吳林坤　陳　軍　吳紅淼　王娟英　秦賢金　張重義林文雄,*

1福建農林大學生命科學學院, 福建福州 350002;2福建省農業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點實驗室, 福建福州 350002

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地黃連作脅迫響應機制的塊根蛋白質組學分析

吳林坤1,2陳軍1,2吳紅淼1,2王娟英1,2秦賢金1,2張重義2林文雄1,2,*

1福建農林大學生命科學學院, 福建福州 350002;2福建省農業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點實驗室, 福建福州 350002

摘要:地黃種植過程中存在嚴重的連作障礙問題, 連作導致塊根無法正常膨大、產量品質下降、土傳病害嚴重等。本研究以正、重茬地黃塊根為試驗材料, 通過差異蛋白質組學技術分析連作下地黃塊根蛋白質表達譜變化, 并進一步采用qRT-PCR技術對鎖定的差異蛋白質表達量變化進行驗證分析。研究結果發(fā)現(xiàn), 連作導致與塊根重要生理代謝過程和主要成分合成相關的蛋白質都下調表達, 與蛋白質折疊相關的伴侶素(chaperonin)在重茬地黃塊根中全部下調表達; 連作下與脅迫響應、抵御相關的蛋白質(如pathogenesis-related protein 10, cytochrome P450, Type IIIa membrane protein cp-wap13等)均上調表達。qRT-PCR定量分析證實重茬地黃塊根中PR-10基因表達量顯著高于正茬地黃; PR-10基因在尖孢鐮刀菌病原菌侵染下能夠明顯被誘導表達, 表達量隨著侵染時間的增加而逐漸升高, 驗證了差異蛋白質組學分析的結果。可見連作脅迫對地黃塊根蛋白質表達譜有顯著影響, 導致蛋白質表達紊亂, 連作植株生理代謝過程異常, 碳水化合物和能量代謝緩慢, 產生連作障礙效應。

關鍵詞:地黃; 連作障礙; 差異蛋白質組學; 病程相關蛋白; 脅迫響應

本研究由國家自然科學基金項目(81303170), 國家自然基金聯(lián)合基金項目(U1205021)和福建農林大學優(yōu)秀博士學位論文基金項目(324-1122yb005)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (81303170, U1205021) and the Scientific Research Foundation of Graduate School of Fujian Agriculture and Forestry University (324-1122yb005).

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: wulinkun6a19@163.com

連作障礙(consecutive monoculture problem), 也稱為自毒作用、重茬問題或土壤病, 是指即使正常的田間管理措施下, 連續(xù)多年種植相同或相似植物于同一地塊會造成生長發(fā)育不良、病蟲害嚴重、產量品質下降的化學生態(tài)學現(xiàn)象。目前, 隨著現(xiàn)代農業(yè)的發(fā)展, 規(guī)模化、集約化、單一化連續(xù)種植模式十分普遍, 其造成的損失也是十分巨大的, 而且這一趨勢正逐年嚴重。長期困擾我國農業(yè)生產的連作障礙問題, 在地黃、人參等中藥材栽培生產中表現(xiàn)尤為嚴重, 約70％的塊根類藥用植物都存在不同程度的連作障礙問題[1]。地黃(Rehmannia glutinosa Libosch.)為玄參科地黃屬多年生草本藥用植物, 其藥用歷史悠久, 有重要藥用價值。但地黃連作導致藥用部位——塊根無法正常膨大, 產量、品質嚴重下降, 甚至造成絕收。通常每茬收獲后同一地塊需間隔8～10年后方可再種, 這嚴重制約了我國中藥資源的可持續(xù)發(fā)展與利用。更為嚴重的是, 在連作障礙機制尚不清楚的情況下, 農戶往往通過濫施化肥、濫用農藥來試圖維持產量, 但是效果不佳, 而且?guī)砹酥兴幉霓r殘超標、污染環(huán)境等一系列問題。因此, 探究藥用植物連作障礙發(fā)生的機理和尋求克服或緩解措施已成為亟待解決的問題。

國內外有關植物連作障礙機制的研究主要聚焦于土壤養(yǎng)分匱乏或失調; 根系分泌物的化感自毒作用; 根際微生物群落結構失衡3個方面。但是越來越多的研究結果認為, 土壤肥力不是主要因素, 而且許多研究結果表明連作土壤主要營養(yǎng)元素的含量并不隨著種植年限的增加而下降, 這也在我們對地黃連作的研究中得到了證實[2]。至于根系分泌物的化感自毒效應方面, 先前的研究都主要采用生測法來直接評價對靶標受體植物生長的影響, 此方法不僅忽略了土壤物理化學因素對根系分泌物活性的影響如土壤吸附遷移等過程, 還忽視了土壤微生物的加工、轉化及降解等過程[3]。近年來, 越來越多的研究認為連作障礙是由根系分泌物介導下的根際微生態(tài)結構惡化造成[4], 地黃連作同樣也造成根際微生物群落結構失衡, 導致病原菌大量生長, 引發(fā)障礙效應[2,5]。

根際微生態(tài)環(huán)境惡化勢必影響地黃塊根的正常生理代謝及脅迫響應過程, 研究地黃塊根連作下的蛋白質表達譜變化反之可為揭示地黃連作障礙的形成機理提供根據。前人研究表明, 單一化栽培模式下, 地黃植株能夠通過miRNAs調控因子來調控靶基因的表達模式, 以應對源自土壤中的環(huán)境脅迫因子[6]。但是, 蛋白質才是細胞活性和功能的最終執(zhí)行者, mRNA與蛋白質之間并不是一一對應的關系,初始mRNA轉錄物經過加工與修飾后才能形成成熟的mRNA。迄今, 有關地黃響應連作脅迫的塊根蛋白質表達譜變化的研究未見報道。因此, 本研究基于前期優(yōu)化確定的最佳地黃塊根總蛋白提取與分離方法, 對正、重茬地黃塊根蛋白質表達譜差異進行分析, 以鎖定關鍵蛋白質, 并通過qRT-PCR技術驗證分析在分離篩選的特異病原微生物作用下關鍵蛋白質表達量的變化趨勢, 以進一步研究土壤環(huán)境災變(如土傳病原菌)對地黃植株生長發(fā)育的影響以及地黃響應連作逆境脅迫的生物學過程。研究結果可為揭示地黃連作障礙的形成機制及探究植物–微生物根際互作等提供理論依據。

1　材料與方法

1.1田間試驗及取樣

以廣泛種植的溫85-5懷地黃為試驗材料。在道地產區(qū)河南省焦作市溫縣農業(yè)科學研究所(34o56′N, 112o58′E)進行試驗。設置正茬(頭茬種植, 對照組)與重茬(連作2年, 試驗組) 2個處理。在同一地塊的不同小區(qū)中種植對照組與試驗組, 以保證土壤質地、微氣候條件等相同。地黃整個生長發(fā)育期間, 水分、肥料等措施管理保持一致。地黃塊根膨大中期取塊根樣品, 洗凈剪碎后立即用液氮速凍, 放入–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2地黃塊根蛋白質提取與電泳分離

基于前期優(yōu)化確定的最佳地黃塊根總蛋白提取與分離方法[7], 對正、重茬地黃塊根蛋白質進行提取與分離。設置3次生物學重復, 基于銀染圖譜進行差異表達統(tǒng)計分析(n=3), 基于考染圖譜進行差異蛋白點質譜鑒定。

1.3蛋白質酶解及MALDI TOF-TOF MS鑒定

采用胰島素酶酶解差異蛋白點, 采用MALDI

TOF-TOF MS進行二級質譜鑒定。參照李奇松等[8]的方法。比對數(shù)據庫時, 參數(shù)設置如下: 數(shù)據庫為NCBInr全庫, 胰酶消化, 最大允許漏切位點為1,母離子質量偏差容忍度為100×10–6, MS/MS二級肽段質量偏差為0.6 Da, 固定修飾為半胱氨酸酰胺甲基化, 可變修飾為甲硫氨酸氧化。

1.4蛋白質GO分析

成功鑒定的蛋白質根據KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome. jp/kegg/)數(shù)據庫進行功能歸類, 進一步借助Uniprot (http://www.uniprot.org/)數(shù)據庫進行Gene Ontology (GO)注釋分析, 并用WEGO (http://wego.genomics. org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)工具制圖[9]。

1.5qRT-PCR驗證分析關鍵蛋白質表達量變化

取正重茬地黃塊根各100 mg用RNAprep Pure Plant Kit試劑盒(TIANGEN, 北京)按照說明書提取總RNA, 用Nanodrop 2000C Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA)測定濃度。取等量總RNA 用TIANScript RT Kit試劑盒(TIANGEN, 北京)分別進行逆轉錄, 合成cDNA第1鏈。

經差異蛋白質組學及蛋白功能分析, 鎖定2個連作脅迫下發(fā)生顯著差異表達的蛋白質, 即病程相關蛋白(pathogenesis-related protein 10, PR-10蛋白,序列已登入NCBI)和S-adenosylmethionine (SAM)合成酶, 進一步運用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)技術進行表達量變化驗證。PR-10蛋白特異引物序列為PR-F (5'-GCCGGAATTCATGGGTATCACCAAAC ACATCC-3')和PR-R (5'-TTACTCGAGGGCGCAGA CATTAGGATTGGCAT-3')。以Actin作為內參基因,引物序列為AT-F (5'-CAACCCCAAGGCAAACAGA -3')和AT-R (5'-GGCAAGATCCAAACGCAAG-3')。熒光定量PCR體系含2×SuperRealPreMix Plus (含SYBR Green I) 7.5 μL、引物各0.6 μL、cDNA模板0.45 μL、RNase-Free ddH2O 5.85 μL。熒光定量PCR擴增條件為95℃預變性10 min, 95℃變性10 s, 64℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 40個循環(huán), 在每個循環(huán)的延伸階段檢測熒光信號。SAM合成酶基因qRT-PCR分析的特異引物及擴增程序參考范華敏等[10]。采用2–ΔΔCt法計算正重茬PR-10與SAM合成酶基因表達量差異。

1.6尖孢鐮刀菌對地黃生長及PR-10基因表達量的影響

課題組前期從地黃連作土壤和發(fā)病植株中高頻篩選到多株尖孢鐮刀菌病原真菌[5], 本研究將分離到的一株?；图怄哏牭毒罨囵B(yǎng)后, 接種至地黃組培瓶中(離苗根部1.5 cm處接種), 動態(tài)觀察尖孢鐮刀菌對地黃組培苗的侵害。同時, 動態(tài)取地黃組培苗樣品以驗證分析尖孢鐮刀菌侵染下地黃PR-10基因表達量的變化趨勢。總RNA提取、逆轉錄、qRT-PCR步驟同1.5。

2　結果與分析

2.1正重茬地黃塊根差異蛋白質組學分析

基于優(yōu)化建立的雙向電泳體系, 分別構建了正、重茬地黃塊根蛋白質表達圖譜(圖1)。Scatters Plot分析發(fā)現(xiàn)正重茬地黃塊根蛋白圖譜的平均相關系數(shù)達0.812, 可見正重茬地黃塊根具有相似的蛋白質點分布信息, 二者的主要差異在于蛋白質表達量的變化。

采用生物統(tǒng)計學方法, 分析正重茬塊根蛋白質表達豐度, 共發(fā)現(xiàn)37個蛋白質點的相對豐度顯著變化(表1和圖2)。與正茬相比, 重茬塊根中有6個蛋白質上調表達, 31個蛋白質下調表達。經MALDI TOF-TOF MS質譜分析, 共成功鑒定出34個蛋白質(表1)。

2.2差異蛋白質GO分析和KEGG分析

Gene Ontology (GO)分析發(fā)現(xiàn), 所有成功鑒定的蛋白質按細胞組成(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物過程(biological process)可分別分為7類、3類和11類。細胞組成中, 細胞和細胞組分所占的比例最高; 分子功能中, 結合和催化所占的比例最高; 生物過程中, 細胞過程和代謝過程所占的比例最高(圖3)。

進一步, 運用KEGG數(shù)據庫對成功鑒定的蛋白質進行功能歸類, 共分為10類(表1): (1)碳水化合物/能量代謝(5個, 蛋白點2、5、13、28、31); (2)氨基酸代謝(8個, 蛋白點3、17、18、19、21、24、32、34); (3)核酸代謝(1個, 蛋白點29); (4)淀粉代謝(3個,蛋白點11、12、25); (5)萜類代謝(1個, 蛋白點4); (6)蛋白質代謝(9個, 蛋白點7、8、9、10、15、16、27、30、33); (7)異源物質代謝(1個, 蛋白點20); (8)脅迫響應(3個, 蛋白點14、22、26); (9)信號傳導(1個, 蛋白點23); (10)未知功能(2個, 蛋白點1、6)。其中, 蛋白質代謝相關的差異蛋白點所占比例最大, 為26.5％, 其次為氨基酸代謝相關(23.5％)和碳水化合物代謝相關(14.7％)蛋白質(圖4)。

圖1　正茬(A)與重茬(B)地黃塊根蛋白質雙向電泳圖譜Fig. 1　Silver stained 2-DE gels of proteins extracted from the tuber roots of the newly planting (A) and monocropping (B) R. glutinosa

圖2　正、重茬地黃塊根部分差異蛋白質點局部放大圖Fig. 2　Close-up views of part of differentially expressed proteins extracted from the tuber roots of newly planting and monoculturing R. glutinosa

圖3　地黃塊根差異蛋白質Gene Ontology分析Fig. 3　Gene Ontology (GO) for the differentially expressed proteins

圖4　差異蛋白質功能歸類圖Fig. 4　Functional classification of the differentially expressed proteins

結合蛋白點相對表達豐度可以看出, 連作下,地黃塊根中與碳水化合物代謝、氨基酸代謝、核酸代謝、淀粉代謝、萜類代謝、蛋白質代謝相關的蛋白質幾乎都下調表達, 尤其發(fā)現(xiàn)與蛋白質折疊相關的伴侶素(chaperonin)在重茬塊根中全部下調表達。然而, 重茬塊根中與異源物質代謝相關、脅迫響應相關、信號傳導相關的蛋白質全部上調表達, 尤其發(fā)現(xiàn)一個病程相關蛋白(pathogenesis-related protein, PR蛋白)顯著上調表達(表1)?？梢? 地黃塊根受到連作脅迫因子的影響, 與脅迫響應相關的蛋白質(如PR蛋白)上調表達, 而與塊根重要生理代謝過程相關(如與能量代謝、氨基酸、蛋白質代謝相關)和與塊根主要成分合成相關的蛋白質(如與淀粉合成、萜類合成相關)都下調表達。

2.3地黃連作下PR-10和SAM合成酶基因表達量qRT-PCR驗證

基于地黃PR-10基因(GenBank登錄號為EU526395.1)和Actin基因(GenBank登錄號為EU526396.1)序列, 設計了qRT-PCR定量分析的特異引物, 由圖5可以看出, PR-10基因的引物(PR-F、PR-R)與Actin基因的引物(AT-F、AT-R)特異性均較好, 無其他非特異性條帶, 擴增產物測序后均顯示序列正確, 故適合qRT-PCR分析。差異蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn), 重茬塊根中PR-10蛋白的表達豐度顯著高于正茬地黃, 約是正茬的4倍(表1), 而qRT-PCR結果與之類似, 在轉錄水平上, 重茬地黃塊根中PR-10基因的表達量約是正茬的3.4倍(圖6)。同樣, S-adenosylmethionine (SAM) synthetase的qRT-PCR定量分析結果也與差異蛋白質組學結果表現(xiàn)一致,均出現(xiàn)下調表達。

2.4?；图怄哏牭毒闹虏⌒则炞C及對地黃PR-10基因表達量的影響

前期分離篩選的專化型尖孢鐮刀菌能夠快速侵害地黃組培苗生長, 侵染第7天時, 發(fā)現(xiàn)組培苗植株開始表現(xiàn)輕微病害癥狀, 即出現(xiàn)輕微的發(fā)黃枯萎現(xiàn)象; 第9天時, 莖出現(xiàn)倒伏, 葉片嚴重黃化; 之后癥狀不斷加重, 并且發(fā)病植株上有大量尖孢鐮刀菌菌絲出現(xiàn)(圖7)。

圖6　正茬(NP)和重茬(SM)地黃塊根PR-10和SAM合成酶基因表達量qRT-PCR驗證分析Fig. 6　qRT-PCR analysis of PR-10 and SAM synthetase genes in the newly planting (NP) and monocropping (SM) R. glutinosa roots

圖7　地黃專化型尖孢鐮刀菌侵染地黃組培苗Fig. 7　Pathogenicity testing of host-specific Fusarium oxysporum isolated

圖8　尖孢鐮刀菌(FON)侵染下地黃組培苗PR-10基因表達量qRT-PCR驗證分析Fig. 8　Quantification of PR-10 gene in tissue culture seedlings of R. glutinosa under F. oxysporum infection

通過qRT-PCR技術對尖孢鐮刀菌侵染下地黃PR-10基因表達量動態(tài)分析, 發(fā)現(xiàn)隨著侵染時間的增加, 地黃組培苗中PR-10基因的表達量也不斷增加(圖8), 再次驗證了蛋白質組學的結果, 說明連作脅迫(如病原菌侵染)下PR-10蛋白顯著上調表達,參與了地黃連作脅迫的響應, 推測田間連續(xù)種植模式下PR-10蛋白上調表達可能與連作地黃的根際微生態(tài)結構失衡、病蟲害加重有關。

3　討論

植物根部是“植物–土壤–微生物”微生態(tài)系統(tǒng)中的一個重要參與者, 是連接植物地上部與地下部的關鍵部位, 是土壤微生物影響植物生長的重要介質,也是植物感應土壤理化性質及生物學特性變化的窗口。研究植物根系在逆境脅迫(如連作脅迫)下的蛋白質表達譜變化, 可為揭示藥用植物連作障礙形成的機制及其探索合理有效的消減策略或是進行遺傳改良等提供一定的理論依據。

本研究基于前期優(yōu)化建立的塊根蛋白質提取及分離方法, 分別構建了正、重茬地黃塊根蛋白質表達圖譜, 進一步通過差異蛋白質組學技術分析發(fā)現(xiàn),連作下地黃塊根蛋白質表達譜明顯變化, 涉及碳水化合物、淀粉代謝、萜類代謝、氨基酸代謝、核酸代謝、蛋白質代謝、脅迫響應以及信號傳導等代謝途徑(表1)。本研究共鑒定到5個碳水化合物和能量代謝相關的蛋白質, 分別涉及糖酵解(如phosphoglycerate mutase、phosphoglycerate kinase等)、三羧酸循環(huán)(malate dehydrogenase)和氧化磷酸化(NADH-ubiquinone oxidoreductase)。它們在重茬地黃塊根中的表達量都顯著低于正茬地黃。同時, 發(fā)現(xiàn)3個淀粉合成和分解代謝相關的(如UDP-glucose 6-dehydrogenase、phosphoglucomutase等)和1個萜類化合物合成相關的蛋白質(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase)在重茬地黃塊根中都下調表達?；瘜W成分分析表明, 地黃塊根中富含甙類化合物, 其中又以環(huán)烯醚萜甙類(屬于單萜類化合物)為主[11]。本試驗鑒定到一個與萜類化合物骨架合成

相關的蛋白質在連作地黃塊根中其表達量顯著下降,這可能也是連作下地黃塊根藥效成分含量下降、品質降低的一個重要原因。

本研究還鑒定到1個核酸合成相關蛋白質(UDP-glucose 4-epimerase)和大部分氨基酸代謝相關的蛋白質(如serine hydroxymethyltransferase、methionine synthase、S-adenosylmethionine synthase、betaine aldehyd dehydrogenase等), 除Glutamate dehydrogenase 2外, 它們在重茬地黃塊根中都下調表達。尤其發(fā)現(xiàn), 鑒定到的3個S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthase)全部下調表達(表1和圖6)。S-腺苷甲硫氨酸合成酶是植物細胞代謝過程中十分關鍵的一個酶, 能催化甲硫氨酸和ATP反應生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。SAM具有很多重要的生物學功能, 是細胞生化反應的主要甲基供體, 涉及植物的轉甲基、轉氨丙基、轉硫反應等重要的生理代謝過程, 這些反應對細胞結構和功能發(fā)揮都至關重要。SAM也是乙烯及多胺生物合成的前體, 眾所周知乙烯是植物生長調節(jié)劑, 參與調控很多的生理生化反應, 而多胺在控制植物形態(tài)建成、調節(jié)植物生長發(fā)育、提高植物抗逆性、延緩衰老等方面發(fā)揮重要功能[12]。與此同時, 本研究還發(fā)現(xiàn)大量與蛋白質代謝, 如蛋白質翻譯后加工(mitochondrial processing peptidase)、蛋白質折疊相關的蛋白質(如chaperonin CPN60-1、heat shock 70 kD protein、chaperonin containing t-complex protein 1、T-complex protein 1 subunit等)在重茬地黃中全部下調表達。伴侶素(chaperonin)是分子伴侶(chaperone)中的一種, 它可以和部分折疊或沒有折疊的蛋白質分子結合, 穩(wěn)定它們的構象, 并能引導蛋白質正確折疊, 形成具有功能的成熟蛋白質。伴侶素表達異常, 可導致很多蛋白質無法正確折疊而失去正常功能, 或者在脅迫條件下出現(xiàn)熱休克或失活無法及時在分子伴侶的協(xié)助下恢復到其自然狀態(tài), 這就造成細胞內很多關鍵蛋白質表達異常或者失去功能, 從而引發(fā)不良生理響應。可見, 連作下參與植物體內重要生理代謝過程的蛋白質, 如能量代謝、淀粉合成、萜類合成、核酸合成、氨基酸代謝、蛋白質代謝相關的蛋白質都下調表達, 導致植物細胞生理生化反應異常, 影響生命活動的重要過程和核心途徑,這與連作地黃植株生長緩慢、根系活力降低、塊根無法正常膨大、藥效成分含量下降等連作癥狀相吻合。

然而, 重茬塊根中與異源物質代謝相關(cytochrome P450)、脅迫響應相關(如pathogenesis-related protein、xylose isomerase、Type IIIa membrane protein cp-wap13、glutamate dehydrogenase 2)、信號傳導相關的蛋白質(auxin-induced protein)全部上調表達。細胞色素P450 (cytochrome P450)是一類血紅素——硫鐵蛋白, 對內源性和外源性物質, 尤其是對環(huán)境有害化學物質具有氧化代謝作用, 它在保護植物免受有害物質侵害方面具有重要作用。研究也發(fā)現(xiàn), 機械損傷、殺蟲劑、重金屬離子等環(huán)境毒物以及病原菌對植物細胞色素P450有明顯的誘導作用[13]。Li 等[14]研究發(fā)現(xiàn), 小麥受到病原菌Fusarium asiaticum侵染時, 其細胞色素P450基因表達量極顯著上調,并且發(fā)現(xiàn)這與病原真菌產生的毒素DON有關, 可見細胞色素P450在植物解毒與抵御生物、非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)2個與植物細胞壁合成相關的基因(xylose isomerase、Type IIIa membrane protein cp-wap13)都上調表達。Mao等[15]發(fā)現(xiàn), 鋁毒誘導下, 木糖異構酶(xylose isomerase)顯著上調, 該酶能夠催化D-木酮糖轉化為D-木糖, 而D-木糖是半纖維素的主要成分, 這與鋁毒誘導下植物細胞壁中半纖維素沉積的現(xiàn)象表現(xiàn)一致。研究也報道, 細胞壁中的半纖維素和果膠乙?；瘜χ参锏钟≡趾τ兄匾饔肹16]。另一個與細胞壁合成相關的蛋白——Type IIIa membrane protein cp-wap13屬于reversibly glycosylated polypeptide (RGP)家族,該蛋白與細胞壁多糖合成相關, 研究發(fā)現(xiàn), 接種Trichoderma harzianum T22的玉米幼苗中該蛋白表達量上調, 推測這可能與細胞壁沉積變厚從而把真菌限制在外表層有關[17]。與此同時, 本研究還鑒定到一個病程相關蛋白(pathogenesis-related protein 10, PR-10)在重茬地黃塊根中其表達量顯著上調。PR蛋白是指由植物寄主基因編碼, 在病理或病理相關的環(huán)境條件下誘導表達的一類蛋白質, 已發(fā)現(xiàn)的PR蛋白可歸為17類, 即PR-1到PR-17, 其中PR-10具有體外核酸酶活性和抗菌活性[18]。PR蛋白的產生與積累是植物體響應外界生物、非生物脅迫的重要特征與途徑[19]。已有研究表明, PR-10基因與植物抗病、次生代謝等密切相關[20], 同時具有配體(如細胞分裂素、植物固醇等)結合能力, 被認為在信號傳遞中發(fā)揮作用[21]。連作下, 地黃塊根中PR-10蛋白表達量上調可能與重茬地黃根際的微環(huán)境惡化、病蟲害加重等有密切關系。本研究還進一步運用qRTPCR技術在轉錄水平上對PR-10蛋白的表達量變化

加以驗證, 發(fā)現(xiàn)重茬地黃塊根中的PR-10基因表達量顯著高于正茬地黃(圖6)。課題組前期研究確實發(fā)現(xiàn), 地黃連作下土壤微生態(tài)結構惡化, 造成病原微生物(如尖孢鐮刀菌)大量生長[2,5], 所以本研究也分析了病原菌——尖孢鐮刀菌侵染下地黃組培苗體內PR-10基因表達量的變化, 結果顯示組培苗PR-10基因能夠明顯被病原菌誘導表達, 且表達量隨著侵染時間的增加而逐漸升高(圖8), 驗證了差異蛋白質組學分析的結果。

4　結論

前期分離篩選的?；图怄哏牭毒鷮Φ攸S組培苗有嚴重的侵染致病作用, 同時發(fā)現(xiàn)地黃連作脅迫對塊根蛋白質表達譜有顯著影響。連作下地黃塊根由于受到了脅迫因子的影響, 如病原菌侵染等, 導致與脅迫響應、抵御相關的蛋白質(如pathogenesisrelated protein、cytochrome P450、Type IIIa membrane protein cp-wap13等)上調表達, 而與塊根重要生理代謝過程相關(如能量代謝、氨基酸、蛋白質代謝)和與塊根主要成分合成相關的蛋白質(如淀粉合成、萜類合成)都下調表達, 尤其與蛋白質折疊相關的伴侶素(chaperonin)在重茬地黃塊根中全部下調表達,這可能造成連作地黃生理代謝過程表現(xiàn)異常, 細胞活性下降, 碳水化合物和能量代謝緩慢, 而且有限的能量都用于抵御外界環(huán)境脅迫, 塊根無法膨大, 藥效成分無法積累, 品質下降, 最終表現(xiàn)出障礙效應。References

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URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151207.1121.024.html

Comparative Proteomics Analysis of R. glutinosa Tuber Root in Response to Consecutive Monoculture

WU Lin-Kun1,2, CHEN Jun1,2, WU Hong-Miao1,2, WANG Juan-Ying1,2, QIN Xian-Jin1,2, ZHANG Zhong-Yi2, and LIN Wen-Xiong1,2,*
1College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;2Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

Abstract:Rehmannia glutinosa L. is widely applied in Chinese medicine. However, consecutive monocropping of this plant results in serious decline in both biomass and quality of underground tubers, with poor field performance and insufficient resistance to disease and pest. In the present study, the tuber roots from the newly planted (NP) and consecutively monocropped (SM) R. glutinosa were used through comparative proteomics analysis to study the response of R. glutinosa to consecutive monocropping and the underlying mechanisms of replanting disease. Comparative proteomics analysis showed that these proteins involved in important physiological processes and biosynthese of main components in tuber roots were significantly down-regulated under consecutive monocropping regime. It was also found that chaperonins related to protein folding was down-expressed with the extended monocropping. However, these proteins related to stress response/defense such as pathogenesis-related protein 10, cytochrome P450 and Type IIIa membrane protein cp-wap13 were up-regulated in consecutively monocropped R. glutinosa. Quantitative analysis by qRT-PCR confirmed the up-regulation of PR-10 responding to consecutive monocropping or the infection of pathogenic Fusarium oxysporum. Moreover, PR-10 was gradually up-regulated with the increasing days of infection. In conclusion, consecutive monocropping of R. glutinosa greatly affects the expression profile of proteome in tuber roots. These abnormally expressed proteins might lead to the metabolic disturbances and low energy production. Moreover, the limited energy is applied to

resist the external environmental stresses, resulting in significant decline in the growth of tuber roots and the accumulation of active ingredients.

Keywords:Rehmannia glutinosa; Consecutive monocropping problem; Comparative proteomics; Pathogenesis-related protein; Stress response

收稿日期Received(): 2015-05-27; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網絡出版日期): 2015-12-07.

通訊作者*(Corresponding author): 林文雄, E-mail: lwx@fafu.edu.cn

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00243