郭建斌　黃　莉　成良強　陳偉剛　任小平　陳玉寧　周小靜沈金雄　姜慧芳,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所 / 農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室, 湖北武漢 430062;2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖北武漢 430070

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利用3個F2群體整合高密度栽培種花生遺傳連鎖圖

郭建斌1,2黃莉1成良強1陳偉剛1任小平1陳玉寧1周小靜1沈金雄2姜慧芳1,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所 / 農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室, 湖北武漢 430062;2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖北武漢 430070

摘要:遺傳圖譜的構(gòu)建及整合是開展花生分子育種研究的基礎(chǔ), 利用多個作圖群體整合遺傳圖譜是解決圖譜標記密度低的有效途徑。本研究采用基于錨定SSR標記的作圖策略, 構(gòu)建3個F2群體3張遺傳連鎖圖, 利用JoinMap 3.0軟件整合圖譜, 獲得一張包含20個連鎖群、792個位點、總遺傳距離為2079.50 cM, 標記間平均距離為2.63 cM的整合圖譜, 各連鎖群標記數(shù)在20～66個之間, 遺傳距離在59.10～175.80 cM之間。將3個分離群體中檢測到的與莢果及種子大小相關(guān)的QTL區(qū)段與整合連鎖圖的標記比較發(fā)現(xiàn), 各群體中檢測到的位于各染色體上的QTL在整合圖譜中都能出現(xiàn), 有些QTL標記區(qū)間在整合圖譜中存在更多的標記, 為今后利用這些標記進行精細定位奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:花生; SSR; 整合圖譜

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31271764, 31371662, 31471534, 31461143022), 國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2011CB109300), 農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種質(zhì)資源保護項目(NB2010-2130135-28B)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-14-花生種質(zhì)資源評價)。

This study was supported by the Natural Science Foundation of China (31271764, 31371662, 31471534, 31461143022), the National Key Basic Research Program of China (973 Program), the Crop Germplasm Resources Protection Project (NB2010-2130135-28B), and the China Agriculture Research System (CARS-14-peanut germplasm resource evaluation).

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: guojb@webmail.hzau.edu.cn, Tel: 13007123983

花生(Arachis hypogaea L.)是我國乃至世界范圍內(nèi)廣泛種植的經(jīng)濟作物和油料作物, 花生仁中含有豐富的脂肪和蛋白質(zhì), 具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。栽培種花生是異源四倍體(AABB, 2n = 4x = 40), 其基因組比較大, 遺傳多樣性缺乏[1], 有關(guān)花生遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和重要性狀QTL的研究

分析相對滯后。但是近年來, 隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展, 其遺傳圖譜構(gòu)建和重要性狀的QTL定位取得了很大進展。遺傳圖譜的構(gòu)建是分子輔助育種乃至基因定位和圖位克隆的基礎(chǔ)。分子標記遺傳連鎖圖譜為花生QTL和基因定位等研究奠定了基礎(chǔ), 如花生抗病、抗逆、產(chǎn)量和品質(zhì)等的QTL或基因定位均借助于分子標記遺傳連鎖圖譜。姜慧芳等[2]利用重組近交系群體檢測花生青枯病抗性SSR標記, 獲得一張包含8個連鎖群的栽培花生部分遺傳圖譜, 總長603.9 cM。彭文舫等[3]利用遠雜9102和Chico雜交構(gòu)建重組自交系群體, 構(gòu)建了一張包含98個AFLP標記、總長為285 cM的栽培種花生AFLP遺傳連鎖圖譜。洪彥彬等[1]以粵油13×阜95-5為雜交組合構(gòu)建重組自交系, 得到了一張包含108個標記,涉及20個連鎖群, 總長568 cM, 平均距離為6.45 cM的花生遺傳圖譜。雖然花生遺傳圖譜的構(gòu)建取得了一定的進展, 但是覆蓋基因組不全, 圖譜密度不高, 缺乏通用性和實用性。為得到高密度的花生遺傳圖譜, 圖譜的整合是重要途徑。圖譜整合是為了彌補單個作圖群體因分子標記多態(tài)性的局限性而難以構(gòu)建高密度圖譜的有效方法。Qin等[4]對2個RIL群體的遺傳圖譜進行整合, 得到了一張包含21個連鎖群, 324個標記, 總遺傳距離為1352.10 cM的遺傳圖譜。Gautami等[5]以3個RIL群體及3215個SSR標記, 構(gòu)建了一張包含293個SSR位點、涉及20個連鎖群, 全長2840.80 cM, 平均標記密度為9.70 cM的遺傳圖譜。張新友[6]以鄭8903×豫花4號為雜交組合構(gòu)建重組自交系群體, 結(jié)合鄭9001×鄭8903、白籽×豫花4號、開農(nóng)白2號×豫花4號3個作圖群體,以共有標記為基礎(chǔ), 構(gòu)建了一張包含17個連鎖群、101個標記、總長為953.88 cM的栽培種花生遺傳圖譜。選擇適宜群體進行遺傳連鎖圖的構(gòu)建和整合,得到高密度的遺傳連鎖圖譜, 有助于更多的QTL定位或基因分析。

本研究擬在3個與莢果和種子大小相關(guān)的F2分離群體的遺傳圖譜基礎(chǔ)上, 利用共同標記作為錨定標記, 整合高密度的花生分子遺傳連鎖圖譜, 分析單個分離群體的QTL及在整合圖譜上的位置, 為分析不同種質(zhì)間QTL的差異奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1作圖親本

徐花13屬中間型、中早熟大粒品種; 中花6號屬珍珠豆型早熟中小粒品種。富川大花生是龍生型地方品種, 種子大小中等; ICG6375是來自ICRISAT的珍珠豆型小粒材料。中花10號是珍珠豆型早熟中?；ㄉ贩N; ICG12625是來自ICRISAT引進的多粒型品種。

1.2作圖群體

FI群體是以富川大花生為母本、ICG6375為父本雜交得到的含有218個單株的F2群體。XZ群體是以徐花13為母本、中花6號為父本雜交得到的含有282個單株的F2群體。ZI群體是以中花10號為母本、ICG12625為父本雜交得到的含有232個單株的F2群體。

1.3基因組DNA提取及PCR擴增

在花生苗期取幼嫩葉片, 采用CTAB法提取基因組DNA。所用引物為查閱文獻[7–11]的圖譜上的和本實驗室新開發(fā)的SSR引物, PCR體系10 μL, 含10～20 ng模板DNA 2 μL、Mix 2.5 μL (由北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))、ddH2O 5 μL、10～40 pmol L–1SSR引物0.5 μL, PCR程序為Touchdown, 擴增條件為94℃預(yù)變性3 min; 93℃變性30 s, 65℃退火30 s, (每個循環(huán)–1℃), 72℃延伸1 min, 共10個循環(huán); 93℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 共20個循環(huán); 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物變性后經(jīng)6％的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離, 銀染顯影。

1.4基因型統(tǒng)計及遺傳連鎖圖構(gòu)建

與母本相同的帶型記為“A”, 與父本相同的帶型記為“B”, 同時具有雙親帶型的記為“H”, 缺失的帶型記為“-”。采用JoinMap 3.0軟件繪制遺傳圖譜和整合圖譜。設(shè)置LOD≥2, 步長為0.5, 在2.0～20.0 的LOD值范圍內(nèi)對所有標記分組, 并利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)換為圖譜距離(cM), 構(gòu)建遺傳圖譜。比較不同群體中各個連鎖群上共有的SSR標記并將此標記作為錨定標記, 利用JoinMap 3.0進行各連鎖群的整合。

1.5表型性狀考察及QTL定位

將F2材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所試驗農(nóng)場, 常規(guī)田間管理。單株收獲, 曬干后隨機選取10個成熟飽滿的莢果緊密排成直線, 中間不留空隙, 測量莢果長和莢果寬。重復(fù)3次, 計算平均值。取每個莢果果嘴部分的種子, 將10個成熟飽滿種子緊密排成直線, 中間不留空隙, 測量種子長和種子寬。重復(fù)3次, 計算平均值。結(jié)合構(gòu)建的遺傳連鎖圖, 采用WinQTLcart 2.5軟件的復(fù)合區(qū)間作圖

法進行QTL定位和效應(yīng)估計。

2　結(jié)果與分析

2.1SSR多態(tài)性分析

選用的和本實驗室開發(fā)的SSR引物信息見表1,篩選親本間具有多態(tài)性的引物檢測F2群體, 結(jié)果表明, ZI群體的多態(tài)性引物相對較多, 為13.94％; XZ群體的多態(tài)性引物相對較少, 只有10.39％。各群體的多態(tài)性引物比例列于表1。

2.2F2群體的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

以F2基因型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ), 利用JoinMap 3.0軟件進行遺傳連鎖分析, 構(gòu)建了3張遺傳連鎖圖。FI群體的連鎖圖包含22個連鎖群(分別命名為LGF1～ LGF22), 347個位點, 圖譜總長度為1675.6 cM, 連鎖群上標記間平均距離變異范圍為2.8～12.0 cM, 總的標記間平均距離為5.7 cM, 不同連鎖群上標記數(shù)差異較大, 標記數(shù)最少的只有6個, 最多的有26個標記。XZ群體的連鎖圖包含22個連鎖群(分別命名為LGX1～LGX22), 228個位點, 圖譜總長為1337.7 cM, 標記間平均距離為7.2 cM, 標記數(shù)最少的連鎖群只有3個標記。ZI群體的圖譜包含20個連鎖群(分別命名為LGZ1～LGZ20), 470個位點, 圖譜總長為1877.3 cM, 標記間平均距離為4.0 cM, 標記分布比較均勻。3張連鎖圖的基本信息列于表2。

表1　3個花生F2群體多態(tài)率Table 1　Percentage of polymorphic primers tested in three populations

將所構(gòu)建的3張遺傳連鎖圖分別與Shirasawa 等[15]根據(jù)16個群體整合的栽培種(目前標記密度最高的栽培種花生)遺傳圖譜比較, 發(fā)現(xiàn)LGF1～LGF22能對應(yīng)到Shirasawa (2013)整合圖的A1～A10和B1～ B10, LGX5～LGX22能對應(yīng)到Shirasawa整合圖的A1～A10和B2～B6、B9～B10, LGZ1～LGZ20能對應(yīng)到Shirasawa整合圖的A1～A10和B1-B10。因此, 為了方便圖譜的整合, 將LGF1～LGF22分別命名為FA1～ FA10、FB1～FB10、FA7a和FB7a, 將LGX5～LGX22分別命名為XA1～XA10、XB2～FB6、XB9～FB10和XB3a, 將LGZ1～LGZ20分別命名為ZA1～ZA10、ZB1～ZB10。

2.3圖譜整合

分析所構(gòu)建的3張花生F2群體遺傳連鎖圖, 兩兩相互比較, 統(tǒng)計各連鎖群上共有的SSR標記(表3)。FI與ZI群體之間各對應(yīng)連鎖群的共有標記數(shù)較多, 最多的有14個, 而ZI與XZ之間、FI與XZ之間各對應(yīng)連鎖群的共有標記要少些。

以上述3張F2連鎖圖上共有的SSR標記作為錨定標記, 利用JoinMap 3.0軟件進行圖譜整合, 得到了一張包含20個連鎖群(分別命名為IA1～IA10、IB1～IB10), 792個位點的整合圖譜(圖1)。圖譜總長為2079.50 cM, 標記間平均距離為2.63 cM。連鎖群長度介于59.10～175.80 cM范圍內(nèi), 不同連鎖群上標記數(shù)分布相對比較均勻, 各連鎖群標記數(shù)在20～66個之間, 連鎖群上標記間平均距離變異范圍為1.70～ 5.40 cM。最長的連鎖群是LG13 (175.80 cM), 同時也是標記最多的連鎖群(66個), 標記間平均距離為2.66 cM。標記密度最大的LG1連鎖群, 標記間平均距離只有1.70 cM。整合圖譜的基本信息列于表4。

將本研究整合的圖譜與Shirasawa (2013)整合的栽培種遺傳圖譜比對, 發(fā)現(xiàn)本研究整合圖譜的20個連鎖群能夠與Shirasawa根據(jù)16個群體整合圖譜的20個連鎖群一一對應(yīng)(表4)。本研究整合的圖譜中有382個標記在Shirasawa整合的20個連鎖群上, 還有410個標記是Shirasawa整合圖譜中沒有的。

2.4花生莢果大小和種子大小QTL定位

從表5可以看出, 3個群體的親本及其后代在莢果及種子大小方面均存在較大差異。

利用上述3張F2遺傳圖譜, 通過軟件WinQTLcart 2.5采用復(fù)合區(qū)間作圖法, 分別對3個F2群體的莢果長、莢果寬、種子長、種子寬共4個性狀進行QTL定位分析表明, 以FI群體共檢測到18個QTL, 分布在5個連鎖群上。以XZ群體共檢測到13個QTL, 分布在4個連鎖群上。以ZI群體共檢測到10個QTL, 分布在8個連鎖群上(表6)。

(圖1)

圖1　花生遺傳連鎖圖譜Fig. 1　Linkage maps of peanut

表3　3個圖譜相互比較共有標記數(shù)Table 3　Numbers of common markers among three individual maps

表4　標記在連鎖群上的分布Table 4　Distribution of markers in the linkage groups

表5　親本及F2代群體性狀差異Table 5　Variation of the pod and seed size in the parents and F2populations (cm)

在與莢果長相關(guān)的QTL中, 以FI群體檢測到4 個QTL, 分別位于A05和A07兩條染色體上, 貢獻率為5.7％～26.1％。以XZ群體也檢測到4個QTL, 分別位于A05和A09兩條染色體上, 貢獻率為4.1％～ 7.8％。以ZI群體檢測到1個QTL, 位于B09染色體上, 貢獻率為11.2％ (表6)。將檢測到的QTL區(qū)段與本研究整合的連鎖圖比較發(fā)現(xiàn), 通過FI群體檢測到的位于A5染色體上的3個QTL (qPLA5.1a、qPLA5.1b、qPLA5.1c)區(qū)段及通過XZ群體檢測到的同樣位于A5染色體上的QTL (qPLA5.2)區(qū)段出現(xiàn)在整合圖譜A05染色體上, 以XZ群體檢測到的位于A9染色體上的3個QTL (qPLA9.2a、qPLA9.2b、qPLA9.2c)區(qū)段出現(xiàn)在整合圖譜A09染色體上, 以FI群體檢測到的位于A07染色體上的QTL (qPLA7.1)區(qū)段和以ZI群體檢測到的位于B09染色體上QTL (qPLB9.3)區(qū)段在整合圖譜相對應(yīng)的染色體上也都能出現(xiàn)。

在莢果寬方面, FI、XZ和ZI 3個群體中分別檢測到6個、4個和2個相關(guān)的QTL, 貢獻率分別為7.42％～16.14％、4.48％～8.78％和2.10％～18.70％ (表6), 各群體中檢測到的位于各染色體上的QTL在整合圖譜中都能出現(xiàn)。與此類似, 3個群體中分別檢測到與種子長相關(guān)的QTL 4個、2個和3個, 貢獻率分別為5.66％～20.80％、3.03％～4.87％和9.86％～10.48％;與種子寬相關(guān)的QTL 4個、3個和4個, 貢獻率分別為7.42％～12.6％、3.77％～9.76％和6.39％～12.20％ (表6)。各群體中檢測到的位于各染色體上的QTL在整合圖譜中都能出現(xiàn)。

不同性狀的QTL存在置信區(qū)間重疊現(xiàn)象, 如FI群體中檢測到的位于A05染色體上與莢果長相關(guān)的QTL (qPLA5.1a、qPLA5.1b、qPLA5.1c)和與種子長相關(guān)的QTL (qSLA5.1a、qSLA5.1b、qSLA5.1c)在相同區(qū)段。用XZ群體在區(qū)段GM1577～ARS141內(nèi)檢測到了與莢果長、莢果寬和種子長相關(guān)的QTL (qPLA5.3、qPWA5.3、qSLA5.3)(表6)。XZ群體A09染色體上的區(qū)間EM87～ARS768和區(qū)間AGGS1925～ AGGS2572內(nèi)都存在與莢果長和莢果寬相關(guān)的QTL。如區(qū)間EM87～ARS768內(nèi)存在控制莢果長的QTL (qPLA9.2a)和控制莢果寬的QTL (qPWA9.2a)(表6)。這些重疊的QTL在整合圖譜中也存在重疊現(xiàn)象, 這可能與不同性狀之間存在相關(guān)性有關(guān)。

3　討論

隨著分子標記開發(fā)技術(shù)的發(fā)展, 國內(nèi)外都開展了關(guān)于花生抗病、抗逆、產(chǎn)量和品質(zhì)性狀QTL的研究, 以期將其應(yīng)用于花生分子標記輔助選擇育種。而遺傳圖譜是研究QTL定位乃至基因克隆的基礎(chǔ)。Varshney等[12]利用TAG24與GPBD4雜交得到含有266個RIL的群體構(gòu)建了一張含有188個SSR標記的栽培種花生遺傳連鎖圖。Wang等[13]利用栽培種花生Tifrunner×GT-C20雜交F2代群體構(gòu)建了覆蓋1674.4 cM、含有318個標記位點及21個連鎖群的遺傳圖。隨著更多SSR標記的開發(fā), 更多的基于SSR標記的遺傳圖譜被構(gòu)建[4,14-16]。但是, 總體看來, 花生的遺傳圖譜還很不完善, 目前利用單個遺傳群體通過SSR標記構(gòu)建的密度達500個以上標記的圖譜很少, 因此, 有必要通過多個遺傳群體整合高密度的遺傳連鎖圖。本研究利用3個F2群體構(gòu)建的3張遺傳圖譜的密度分別為347、228和470個標記, 通過3張圖譜的整合, 得到了一張包含792個SSR位點的遺傳連鎖圖。由此可見, 圖譜整合能夠有效增加圖譜密度, 為重要性狀的精細定位奠定了基礎(chǔ)。Shirasawa等(2012)以11個栽培種花生分離群體為基礎(chǔ), 整合了一張包含897個SSR標記的連鎖圖?？梢姳狙芯克婕叭后w的差異比Shirasawa等(2012)所涉及群體的差異大, 在整合圖譜方面的效率較高。Shirasawa等(2013)又增加了2個栽培種花生群體和3個野生花生群體共16個群體構(gòu)建了目前密度最高的遺傳圖譜, 包含3693個標記位點, 其中, 絕大部分位點來源于野生花生群體。雖然本研究整合圖譜密度沒有Shirasawa等(2013)整合圖譜高, 但有410個標記位點是Shirasawa等(2013)整合圖譜中沒有的。這410個標記位點在本研究整合圖譜連鎖群上的分布相對比較均勻, 其中有85個標記位點是本實驗室新開發(fā)的(新引物的信息將近期另文發(fā)表)。本研究構(gòu)建的遺傳圖譜上的標記與Shirasawa等(2013)整合圖譜標記差異的原因, 可能是不同群體的遺傳背景不一樣, 所篩選到的差異性引物也就不同, 進而構(gòu)建遺傳圖譜的標記也是有差異的。另外, 還有新開發(fā)的標記在Shirasawa等(2013)整合圖譜中沒有使用。本研究整合圖譜中的絕大多數(shù)標記的順序與Shirasawa等(2013)整合圖譜的順序一致。因此, 本研究整合的圖譜為今后整合更高密度的連鎖圖奠定了基礎(chǔ)。

整合圖譜包含了不同群體的基因組信息, 為不同群體性狀的基因或QTL相互比較提供了可能性。如以FI群體在A05染色體上檢測到的與莢果寬相關(guān)

的QTL (qPWA5.1a, 相鄰標記為AHGS1904-2～ AHGS1341)和以XZ群體在A05染色體上檢測到的與莢果寬相關(guān)的QTL (qPWA5.2, 緊密連鎖的標記為GM1577)在整合圖譜上均出現(xiàn)了, 但他們位于不同的標記區(qū)間, 因此, 有可能是不同的QTL。從另一方面看, 單個群體定位結(jié)果與整合圖譜相比較, 整合圖譜位點區(qū)間內(nèi)包含有更多的分子標記。如在FI群體A09連鎖群上與種子長相關(guān)的位點AHGS1341～ pPGPseq9A7, 在整合圖譜中發(fā)現(xiàn)此標記區(qū)間AHGS1341～pPGPseq9A7還存在另外的6個標記, 今后可以利用這些標記, 進一步將QTL的定位區(qū)間縮短。

表6　3個F2群體檢中測到的QTLTable 6　QTL for the agronomic traits in three F2populations

4　結(jié)論

利用3個F2群體, 通過JoinMap 3.0軟件, 整合得到一張包含20個連鎖群、792個位點、總遺傳距離為2079.5 cM、標記間平均距離為2.63 cM的栽培種花生遺傳連鎖圖。

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URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151207.1041.016.html

An Integrated Genetic Linkage Map from Three F2Populations of Cultivated Peanut (Arachis hypogaea L.)

GUO Jian-Bin1,2, HUANG Li1, CHENG Liang-Qiang1, CHEN Wei-Gang1, REN Xiao-Ping1, CHEN Yu-Ning1, ZHOU Xiao-Jing1, SHEN Jin-Xiong2, and JIANG Hui-Fang1,*
1Oil Crops Research Institute of China Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China;2College of Plant Science & Technology of Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

Abstract:The genetic linkage map is important for peanut molecular breeding. Construction of integrating genetic linkage map using multiple populations is an effective approach to increase the marker density of map. Three maps were constructed with three F2populations, respectively in the present study. Based on anchored SSR markers in the three maps, we constructed a new map with 792 SSR loci and total map distance of 2079.50 cM (the average distance is 2.63 cM). The length of linkage groups varied from 59.10 to 175.80 cM, and the number of markers was from 20 to 66 in the integrated linkages groups. Comparing the intervals of QTLs linked to the pod size and seed size in the three F2populations with the markers in the integrated linkage groups, all the QTLs linked to the pod size and seed size could be found in the integrated map. Some intervals of QTLs had more markers in the integrated map than in the F2linkage groups in the present study. The markers in the intervals of QTLs of the integrated map could be used for fine mapping.

Keywords:Cultivated peanut; SSR; Integrated genetic mapping

收稿日期Received(): 2015-06-24; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2015-12-07.

通訊作者*(Corresponding author): 姜慧芳, E-mail: peanut@oilcrops.cn, Tel: 027-86711550

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00159