張庭薈

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全1301班，陜西 漢中 723000)

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石杉堿甲提取工藝及藥理功效研究進(jìn)展

張庭薈

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全1301班，陜西 漢中 723000)

摘要：石杉堿甲(Huperzine-A，簡稱Hup-A)，是從石杉科植物千層塔中提取的一種生物堿，具有提高記憶的功能，臨床常用于阿爾茨海默病及良性記憶障礙的治療。本文綜述了近幾年關(guān)于石杉堿甲的提取工藝與藥理功效的研究進(jìn)展，初步確立石杉堿甲的最優(yōu)提取工藝，以及在藥理應(yīng)用的最新發(fā)現(xiàn)。為研究者提供參考。

關(guān)鍵詞：石杉堿甲; 提取工藝; 藥理功效; 研究進(jìn)展

1引言

石杉堿甲(Huperzine-A)是從石杉科植物千層塔中提取的一種生物堿，一種天然的、高效的、可逆的乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑，能夠明顯改善學(xué)習(xí)記憶能力，對早老年性癡呆癥、單純記憶力障礙以及重癥肌無力癥的治療有顯著療效。由于它的治療指數(shù)高,作用時(shí)間長,在國際上已被列為第二代膽堿酯酶的抑制劑之一。國內(nèi)外對石杉堿甲的研究已經(jīng)有近20年，在石杉堿甲的提取工藝與藥理功效方面的研究積累了大量的實(shí)驗(yàn)資料，由于Hup A在自然界中存在量極低,且含有大量雜質(zhì),至今國內(nèi)外有大量研究人員正在探索尋找理想的分離方法。本文通過對近幾年石杉堿甲提取工藝與藥理功效研究進(jìn)展的綜述，確定了石杉堿甲最優(yōu)提取工藝，以及最新藥理功效。

2石杉堿甲的分子結(jié)構(gòu)

石杉堿甲化學(xué)名為(5R，9R，11E)5-氨基-1l-乙叉基-5，6，9，10-四氫-7-甲基-5，9-甲撐環(huán)辛并(6)吡啶-2(1H)酮。它的結(jié)構(gòu)如圖1所示。由石杉堿甲分子結(jié)構(gòu)可知,分子中含有吡啶酮內(nèi)酰胺氫和氨基氫，兩者對 pH值敏感,稀氨水堿性( pH 9)條件下以形成不帶電荷的分子態(tài)易被非極性有機(jī)溶劑萃取,而在稀鹽酸酸性( pH< 3)條件下形成帶正電分子,易被極性溶劑萃取。

3石杉堿甲的提取工藝

目前已有研究者利用酸浸取、索氏提取、微波提取、超聲提取等方法對石杉堿甲進(jìn)行提取，并且利用溶劑萃取、反萃取、重結(jié)晶、硅膠柱層析等方法進(jìn)行分離純化,雖然能獲得少量產(chǎn)品，但終因費(fèi)時(shí)(一個(gè)生產(chǎn)周期超過一個(gè)月)，得率低(低于百萬分之一)，難于規(guī)?；a(chǎn)。

3.1原材料的選擇

石杉堿甲提取自石杉科石杉屬植物，石杉屬下不同種植物，其石杉堿甲的含量及分布不同，同種植物的不同生長階段及不同分布區(qū)域，石杉堿甲含量也不相同。黃雅琪等利用HPLC法測定了三種千層塔中石杉堿甲的含量，結(jié)果表明，蛇足石杉含量最高，四川石杉其次，皺邊石杉含量最低。王德立等對蛇足石杉不同生長階段石杉堿甲含量的地區(qū)差異進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，不同生長階段石杉堿甲的含量：幼苗>幼株>成株(江西、重慶)；幼株>幼苗>成株(貴州、廣西)。相同生長階段不同生長地區(qū)石杉堿甲含量：幼株期和成株期貴州樣地最高，重慶次之。因此對于材料的選擇，貴州產(chǎn)蛇足石杉幼株最為適宜。

3.2石杉堿甲的提取

3.2.1酸浸取

石杉堿甲是一種生物堿，酸浸取是依據(jù)生物堿呈堿性的原理，利用酸性溶液浸泡，使其從植物中溶出到溶液中來，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單。張馨等利用硫酸浸取對石杉堿甲的提取工藝進(jìn)行了研究，確定了最佳的石杉堿甲提取工藝，在10倍量pH=1的硫酸浸提12h，超聲30min下，經(jīng)酸化2次，用NaOH堿化調(diào)pH=9，提取率能達(dá)到0.145%以上。劉建廷等利用鹽酸浸提 ,氯仿萃取來制取、 純化石杉堿甲 ,在料液比為1 :10 ,浸泡10 h ,酸解3次 ,每次為45 min ,酸解pH值為3.0 ,酸解溫度為55℃,堿化pH為9.0下,石杉堿甲的得率大于79.4 %。

3.2.2微波提取

微波提取又稱微波輔助提取，根據(jù)不同結(jié)構(gòu)物質(zhì)吸收微博能力的差異，對某些組分選擇性加熱，可是被萃取物質(zhì)從體系中分離進(jìn)入萃取劑，其優(yōu)點(diǎn)有萃取質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)量大，選擇性高、節(jié)省時(shí)間，能耗降低等。查圣華等對微波提取石杉堿甲進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在酸濃度 0.8 %(v/v) ,液固比例25∶ 1 ,微波處理時(shí)間90s下，經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得石杉堿甲回收率為93.7 %,與傳統(tǒng)的回流提取工藝相比 ,過程時(shí)間從2h縮短為90s ,回收率提高了10 %以上。

3.2.3超聲提取

超聲提取是利用超聲波熱學(xué)原理、超聲波機(jī)械機(jī)制和空化作用的原理提取有效物質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)能夠縮短時(shí)間、提高提取率、降低成本等。查圣華等用正交試驗(yàn)研究了超聲提取蛇足石杉生物堿的最佳條件。結(jié)果表明 ,在室溫下超聲提取的最優(yōu)條件為:酸濃度0.8 %(v/v) ,液固比例20 :1 ,超聲功率600 W,超聲15 min，經(jīng)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得石杉堿甲回收率為97.3 %，與傳統(tǒng)的回流提取工藝相比 ,過程時(shí)間從2 h縮短為15 min ,回收率提高了10 %以上。

3.2.4索氏提取

索氏提取是以揮發(fā)性有機(jī)溶劑為溶媒，對浸出液加熱蒸餾，是揮發(fā)性溶劑蒸餾后再冷凝，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，提取率高。黃暉等通過索氏提取對長柄石杉中石杉堿甲的提取進(jìn)行了研究，用95%的乙醇回流24h，回流一次，檢測得到石杉堿甲0.02281%，RSD為0.83%，從石杉堿甲的得率上看，其提取效果最差，而且耗時(shí)長，在生產(chǎn)實(shí)際中難以推廣。

4石杉堿甲的藥理功效

4.1對膽堿酯酶的抑制作用

石杉堿甲是一種高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑，能進(jìn)入中樞而發(fā)揮作用，與不可逆膽堿酯酶抑制劑異丙氟磷(DFP)的作用不同證明石杉堿甲是一種可逆乙酰膽堿酯酶抑制劑。通過對大鼠的整體試驗(yàn)研究，結(jié)果表明：石杉堿甲對皮層、 海馬、 中膈、延腦、 小腦的AchE的活動(dòng)均有明顯抑制作用并呈劑量

依賴性。按等摩爾劑量計(jì)算口服石杉堿甲對AchE活性的抑制強(qiáng)度分別強(qiáng)于多奈哌嗪和他克林24 和180倍。通過抑制膽堿酯酶，石杉堿甲能明顯升高大鼠全腦乙酰膽堿水平，與對照組相比，其增長率呈線性增加。此外，石杉堿甲對皮質(zhì)、海馬、中隔、延髓、小腦和下丘腦乙酰膽堿酯酶的活力均有明顯抑制作用, 石杉堿甲對大鼠額葉皮質(zhì)及全腦乙酰膽堿水平和乙酰膽堿酯酶活力的作用呈反向關(guān)系。致乙酰膽堿濃度升高的時(shí)間比對乙酰膽堿酯酶的抑制時(shí)間出現(xiàn)稍晚。

4.2抗炎作用

膽堿能抗炎通路是指當(dāng)致病菌入侵時(shí) 體內(nèi)的迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿與免疫系統(tǒng)相互作用參與抗炎。顧健等研究了石杉堿甲對D-半乳糖誘導(dǎo)的老年性聾大鼠的局部抗炎作用，利用免疫組織化學(xué)檢測耳蝸組織中的施萬細(xì)胞和NF-kB的活化情況；通過定量RT-PCR分析檢測耳蝸組織中的炎癥因子IL-1p、IL-6、TNF-a，結(jié)果表明石杉堿甲可以抑制D-半乳糖誘導(dǎo)老年性聾大鼠的耳蝸組織內(nèi)的施萬細(xì)胞的激活和NF-KB活化，進(jìn)而抑制炎癥因子的釋放，起到局部抗炎作用。

4.3抗氧化作用

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致AD的因素之一，Hup A能夠保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞對抗B-淀粉樣蛋白產(chǎn)生的毒性，并提高超氧化物歧化酶(SOD)的產(chǎn)生。隨著年齡的增加，機(jī)體產(chǎn)生的自由基(0：，·OH)的量明顯增加，D-半乳糖是一種強(qiáng)氧化性化合物，通過影響自由基代謝而引起動(dòng)物癡呆，使動(dòng)物因衰老而出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力減退。以D-半乳糖50mg/(kg·d)劑量皮下注射大鼠6wk后，按石杉堿甲0．1、0．2mg/(kg·d)劑量分別給予2wk后檢測血清和腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量。結(jié)果表明，石杉堿甲能顯著提高大鼠血清和腦組織中SOD的活力，同時(shí)降低MDA的含量，從而加快氧自由基的清除。減少自由基損傷是石杉堿甲抗AD的作用機(jī)制之一。

4.4抗凋亡作用

AD發(fā)病中的細(xì)胞凋亡的機(jī)制及其作用已有論述。通過提前給藥Hup A能夠明顯的提高細(xì)胞存活率和防止細(xì)胞核碎裂，其機(jī)制是Hup A通過抑制活性氧簇(ROS，reactive oxygen species)的形成和caspase-3酶的活性。

4.5抗谷氨酸受體

Hup A 對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用有谷氨酸受體介導(dǎo)的參與。谷氨酸鹽是N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體的激動(dòng)劑，NMDA 受體被激動(dòng)能夠增加鈣離子向神經(jīng)元內(nèi)流，而鈣離子濃度過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 Hup A 可以降低谷氨酸鹽對神經(jīng)細(xì)胞的毒性并提高細(xì)胞存活率。對抗谷氨酸鹽機(jī)制有可能為NMDA受體激動(dòng)后，Hup A 阻斷其信號傳導(dǎo)通道下游某處，從而防止了谷氨酸鹽導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。

5總結(jié)與展望

5.1石杉堿甲最佳提取工藝

對于工業(yè)提取石杉堿甲，其原料選擇上，貴州產(chǎn)蛇足石杉幼株含石杉堿甲量最高。石杉堿甲的最適宜提取工藝為超聲協(xié)助酸浸取工藝，該工藝最佳提取條件為：采用1.5%酒石酸為浸泡劑，固液比為20，浸泡時(shí)間24h，后超聲10min。

5.2石杉堿甲藥理功效

石杉堿甲是具有高選擇性、高效和可逆性AChE抑制劑中好的品種。 Hup A 對多種認(rèn)知功能缺陷的動(dòng)物模型均具有增強(qiáng)、改善的作用，對老年癡呆癥的治療已取得成功。Hup A 還具有多靶點(diǎn)作用,對其它神經(jīng)退行性疾病也可能有良好前景。

5.3展望

雖然石杉堿甲是一種有潛力的治療老年癡呆藥物,但是，由于石杉堿甲在植物中含量有限, 而且存在形式多樣, 同時(shí)還伴有一些成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)類似的共生生物堿, 所以運(yùn)用常規(guī)方法想獲得大量的天然石杉堿甲相當(dāng)困難, 這就促使人們開始石杉堿甲合成方面的研究。但是化學(xué)合成有其難以克服的局限性, 很難取得純光學(xué)活性的合成物, 而實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明石杉堿甲的手性對其生物活性至關(guān)重要,所以對石杉堿甲生物合成機(jī)理的研究就顯得愈發(fā)迫切, 但人們在這方面的工作仍然少有進(jìn)展, 最近幾年的文獻(xiàn)也少有相關(guān)報(bào)道, 這就限制了對石杉堿甲的大規(guī)模開發(fā)利用。在隨后的石杉堿甲研究工作中, 加強(qiáng)對植物合成石杉堿甲機(jī)理的認(rèn)識, 并由此提出生物合成方法應(yīng)該成為今后的發(fā)展方向之一。

中圖分類號:R971

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1671-1602(2016)02-0010-02