賈　佳，徐一馨，李　佳，范文強，胡景江，慕自新

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室, 陜西 楊凌 712100)

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NO2-源的NO對鎘脅迫下玉米幼苗生理的影響

賈佳，徐一馨，李佳，范文強，胡景江，慕自新

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室, 陜西 楊凌 712100)

摘要：采用亞硝酸鈉(NaNO2)在酸性條件下與還原劑還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)，GSNO能夠釋放出NO，合成不同濃度的GSNO(0、50、125、250 μmol·L-1和350 μmol·L-1)溶液處理受CdCl2脅迫的玉米(ZeamaysL.)幼苗，以未用CdCl2處理的玉米幼苗作為對照(Control)，探究GSNO對玉米幼苗Cd脅迫的緩解作用及其抗氧化機制。結(jié)果表明：GSNO處理使Cd脅迫下玉米幼苗的株高、莖粗和葉面積與對照組相比顯著增加，其中250 μmol·L-1濃度的GSNO處理效果最佳；在350 μmol·L-1GSNO處理下玉米幼苗各類光合色素含量在脅迫組均達到最大值，有效緩解了葉片黃化；GSNO處理(最適濃度在125～250 μmol·L-1之間)也顯著增強了Cd脅迫下玉米幼苗的抗氧化酶活性，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(POD)的活性，相應(yīng)地降低了過氧化氫(H2O2)和超氧陰離子)含量的積累；GSNO還可以顯著提高玉米幼苗螯合重金屬離子的能力，其中250 μmol·L-1濃度的GSNO處理效果最佳。

關(guān)鍵詞：NO；S-亞硝基谷胱甘肽；鎘脅迫；玉米；生理

隨著含有重金屬的灌溉水、農(nóng)藥和化肥的大量使用, 農(nóng)田土壤中重金屬污染日趨嚴(yán)重[1]。鎘(Cd)是一種強毒性重金屬，當(dāng)葉片中Cd濃度大于5～10 μg·g-1時，就會導(dǎo)致植物死亡[2]。Cd容易被植物根部吸收，其被運輸?shù)街参锏厣喜糠趾?，易進入到食物鏈中，最終影響動物和人類的健康[3]。Cd對植物的毒害作用表現(xiàn)為：植物生長發(fā)育遲緩、葉片失綠、改變?nèi)~綠體的超微結(jié)構(gòu)、抑制光合作用、使CO2固定過程中的酶失活、誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化、抑制花粉萌發(fā)和花粉管的生長以及導(dǎo)致N和S代謝紊亂等[4]。植物體具有不同的Cd耐受機制，包括：誘發(fā)抗氧化系統(tǒng)；將Cd束縛在細胞壁上；與植物螯合肽(PCs)絡(luò)合并區(qū)域化于液泡中，或在葉表皮富集等[2]。因此探索生產(chǎn)上易行的緩解重金屬污染的措施勢在必行,而化學(xué)分子的調(diào)控是理想的方法之一。

一氧化氮(NO)是植物應(yīng)答Cd脅迫的一種同步多功能信號分子，植物受Cd脅迫后，在體內(nèi)能激發(fā)內(nèi)源NO的形成[5]。外施NO可以緩解Cd對植株生長發(fā)育和生理代謝的抑制作用，這種促進效應(yīng)可被NO清除劑或合成酶抑制劑所消除[6-7]。植物體內(nèi)NO的來源途徑多樣，包括：酶促及非酶途徑，氧化途徑(以L-精氨酸為底物)，以及還原途徑(以NO2-或NO3-為底物)[8]。非酶促條件下由NO2-體外還原形成的NO具有合成底物來源方便、合成容易的特點，因此具有潛在的應(yīng)用價值[9]。

酸性條件下，亞硝酸鹽(NO2-)在有還原劑存在時會進行非酶促反應(yīng)，生成NO[10]。而還原型谷胱甘肽(GSH)是一種很好的還原劑，可與NO2-反應(yīng)生成S-亞硝基化谷胱甘肽(GSNO)，GSNO能夠快速釋放NO，可以作為一種來源方便的外源NO供體。目前對這種來源的NO的研究主要圍繞在打破種子休眠、抑制植物體內(nèi)乙烯(C2H4)的產(chǎn)生等方面，而對其抵抗重金屬Cd脅迫等方面的研究還未見報道[11]。因此，本文以玉米為材料，利用GSH和NO2-反應(yīng)形成的NO，研究其在提高玉米抵抗重金屬Cd毒害性的作用，以期為NO用于Cd污染土壤的修復(fù)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1幼苗培養(yǎng)及處理

以‘鄭單958’玉米為試驗材料，種子購于楊凌金諾種業(yè)公司。GSH購于Sigma公司，現(xiàn)用現(xiàn)配；NaNO2購于西隴制藥公司。

GSNO溶液的制備：等體積的10 mmol·L-1NaNO2(在100 mmol·L-1HCl中)與等體積的10 mmol·L-1GSH(在100 mmol·L-1pH7.4的Na2HPO4-NaH2PO4磷酸緩沖液中)反應(yīng)，即可形成5 mmol·L-1GSNO(混合液包含5 mmol·L-1GSNO)[12]。GSNO母液貯存在冰上，使用時稀釋成特定的濃度。室溫下，在100 mmol·L-1pH7.4的磷酸緩沖液中(內(nèi)含50 μmol·L-1DTT)，GSNO就可以釋放出NO，其中500 μmol·L-1GSNO 30 min約釋放NO 3.25μmol·L-1[12]。

幼苗培養(yǎng)：挑選飽滿且胚完整的種子，用3% H2O2消毒15 min，蒸餾水反復(fù)沖洗后在蒸餾水中浸泡過夜，使其充分吸脹。然后將種子擱在底部鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中使種子發(fā)芽；待芽長到2～3 cm(約3～4 d)后，選取發(fā)芽勢一致的幼苗移栽到盛有自來水的培養(yǎng)缽中，置于光照培養(yǎng)間培養(yǎng)(光照強度為800 μmol·m-2·S-1，光周期14 h/10 h，晝夜溫度28℃/20℃，空氣相對濕度70%)。自來水中適應(yīng)培養(yǎng)3 d后，將除對照組(control)以外的幼苗移栽至含有80 mg·L-1Cd(用CdCl2配制)(預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)此濃度足以產(chǎn)生脅迫效果，且可逆)的1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)，并將上述合成的5 mmol·L-1GSNO母液添加到含Cd的營養(yǎng)液中，使之形成0、50、125、250 μmol·L-1和350 μmol·L-1GSNO濃度梯度處理。因此，本研究共計6個處理，處理如下：Control，GSNO0+Cd80，GSNO50+Cd80，GSNO125+Cd80，GSNO250+Cd80，GSNO350+Cd80。對照一直培養(yǎng)在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中。含Cd營養(yǎng)液每3天更換一次，而GSNO按濃度梯度每天進行補充。Cd處理7 d后開始測量，每處理分兩部分，一部分用于形態(tài)指標(biāo)和光合色素含量的測定；另一部分將根和葉片組織液氮速凍后用于其它生理指標(biāo)的測定。

1.2指標(biāo)測定方法

(1) 幼苗地上部分株高、莖粗和葉面積采用Francis[13]的方法進行測量。

(2) 光合色素含量的測定采用丙酮浸提法，用UV-2450型紫外可見分光光度計檢測，分別在波長663、645 nm和470 nm處測定吸光度值。按公式分別計算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的濃度，葉綠素a和葉綠素b的濃度相加即得葉綠素總濃度[9]。

(3) 抗氧化酶活性的測定采用Elavarthi和Martin[14]的分光光度法。

(5) 絡(luò)合素(PCs)的含量為酸溶性硫醇含量(TAST)與GSH含量的差值。TAST的提取和含量測定：稱取0.5 g左右的樣品，加入0.02 mol·L-1EDTA溶液5 mL冰上研磨，12 000 g離心10 min，所得上清即為TAST。取2 ml上清與0.4 mol·L-1Tris緩沖液(pH8.2)和0.1 mL 0.01 mol·L-1DTNB混合，加入3.95 mL甲醇，20℃保溫10 min，測定412 nm下的光吸收。

(6) GSH含量測定參照高俊鳳等[17]的方法。

1.3統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)為3次試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。顯著性差異分析用DPS軟件進行方差分析和新復(fù)極差法比較，用Excel軟件做圖。

2結(jié)果與分析

2.1GSNO處理對Cd脅迫下玉米幼苗生長發(fā)育的影響

用不同濃度的GSNO處理Cd(80 mg·L-1)脅迫下的玉米幼苗，7 d后發(fā)現(xiàn)GSNO0+Cd80處理下玉米幼苗葉片黃化程度明顯，甚至有發(fā)黑現(xiàn)象，且伸展不完全，葉片發(fā)育緩慢，植株矮小，根系發(fā)育也受到明顯抑制(圖1)。而GSNO對緩解CdCl2脅迫有顯著作用，表現(xiàn)在根系和地上部生長的抑制均被緩解，葉片發(fā)育恢復(fù)正常，葉片黃化程度明顯減弱甚至消失，側(cè)根發(fā)育甚至優(yōu)于對照，表現(xiàn)出部分的補償效應(yīng)。在≤ 250 μmol·L-1GSNO濃度范圍內(nèi)，GSNO緩解Cd脅迫的效果隨GSNO濃度的增加而增加，GSNO250+Cd80處理達到最佳效果，隨后隨著濃度的增大，效果開始下降。表1表明：與GSNO0+Cd80處理相比，GSNO250+Cd80處理使Cd脅迫下玉米幼苗的株高、莖粗和葉面積分別增加了39.53%、42.11%和51.97%。

圖1　不同濃度GSNO處理對80 mg·L-1Cd脅迫7 d后

注：不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters indicated significant differences (P<0.05) among different treatments. The same below.

2.2GSNO處理對Cd脅迫下玉米葉片光合色素含量的影響

與對照相比，GSNO0+Cd80處理使玉米幼苗葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量都顯著降低(圖2)。與GSNO0+Cd80處理相比，>50 μmol·L-1的GSNO處理使Cd脅迫玉米幼苗各光合色素含量的抑制作用被顯著緩解(P<0.05)，且隨著GSNO處理濃度的升高，緩解作用逐漸增大。GSNO350+Cd80處理使葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別比GSNO0+Cd80處理增加了267.74%、180.86%、731.01%和109.31%，類胡蘿卜素的含量甚至達到了對照的水平，即抑制作用完全被解除。在GSNO350+Cd80處理時，并沒有觀察到GSNO處理的飽和效應(yīng)，說明從保護光合色素含量的穩(wěn)定性方面來講，GSNO的處理濃度還能繼續(xù)增加，同時表明Cd脅迫玉米幼苗的生長發(fā)育和光合色素對GSNO的敏感性不同。

2.3GSNO處理對Cd脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖3可見，無論在根系還是葉片組織上，GSNO0+Cd80處理都顯著地抑制了幾種抗氧化酶的活性。與對照組相比，GSNO0+Cd80處理使玉米根系的SOD、CAT、APX和POD活性分別下降了69.30%、81.97%、90.91%和71.93%，葉片的SOD、CAT、APX和POD活性分別下降了34.86%、78.68%、53.16%和57.90%。而Cd脅迫幼苗抗氧化酶活性對GSNO的響應(yīng)與GSNO的濃度、酶蛋白自身特性和組織特異性都有關(guān)?？偟囊?guī)律是無論何種處理，葉片組織中SOD、APX活性均顯著高于根系組織，而POD的活性在根系組織顯著高于葉片組織，CAT的活性在組織間差異不顯著。

圖2不同濃度GSNO處理對Cd脅迫下玉米幼苗光合色素含量的影響

Fig.2Effects of GSNO treatments with different concentrations on the chloroplast pigments

content under 80 mg·L-1Cd stress in maize seedlings

與GSNO0+Cd80處理相比，適宜濃度的外源GSNO處理使Cd脅迫下的玉米幼苗根系和葉片中幾種抗氧化酶活性均顯著增加(P<0.05)。在葉片組織中，SOD、APX活性均隨GSNO濃度增加而增加，前者GSNO125+Cd80處理達到峰值，后者GSNO250+Cd80處理達到峰值，處理濃度再次增加后均維持在這一水平。CAT和POD活性各自在GSNO125+Cd80處理和GSNO250+Cd80處理時達到峰值，然后當(dāng)GSNO添加量達到350 μmol·L-1時，均下降到處理GSNO0+Cd80水平。在根系組織中，與處理GSNO0+Cd80相比，4種抗氧化酶活性均先增加后降低，只是其最大值出現(xiàn)的GSNO處理濃度不同。SOD和POD活性均在250 μmol·L-1GSNO濃度達到峰值，而CAT和APX活性在125 μmol·L-1GSNO時達到峰值。說明就GSNO誘導(dǎo)的對Cd脅迫的抗氧化防御來講，不同的抗氧化酶在根系和葉片中的敏感性不同，對GSNO濃度的敏感性也不同。

2.5GSNO處理對Cd脅迫下玉米幼苗TAST、GSH和PCs含量的影響

與對照相比，GSNO0+Cd80處理使根系組織中的酸溶性硫醇(TAST)和絡(luò)合素(PCs)含量都顯著增加，而谷胱甘肽(GSH)含量顯著降低(P<0.05)；使葉片組織中PCs含量增加，TAST含量不變，GSH含量降低(表2)。與GSNO0+Cd80處理相比，≤250 μmol·L-1的GSNO均顯著增加了根系和葉片組織中TAST、GSH、和PCs含量，且都在GSNO250+Cd80處理下達到峰值。此時根系中TAST、GSH和PCs含量分別比GSNO0+Cd80脅迫組提高了58.75%、78.53%和55.07%，而葉片中分別提高了19.52%、108.67%和6.90%。在GSNO350+Cd80處理后，不論是葉片還是根系這3個指標(biāo)的值都開始下降?？傊庠碐SNO處理能夠明顯緩解Cd對GSH的抑制作用，同時提高PCs含量，從而增強玉米組織尤其是根系鰲合Cd的能力，減小了Cd對植物組織的毒害作用。

圖3　不同濃度GSNO處理對80 mg·L-1Cd脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

圖4　不同濃度GSNO處理對Cd脅迫下玉米幼苗根系和葉片ROS含量的影響

3討論

研究表明，Cd污染不僅抑制種子的萌發(fā)、種胚的生長，而且還會干擾植株的生理過程，降低光合速率[18]。Hsu和Kao[19]研究NO對Cd脅迫下水稻葉片光合色素含量的影響時認(rèn)為，適量的NO可通過調(diào)節(jié)氣孔的運動，減輕氧化脅迫和誘導(dǎo)脅迫應(yīng)答基因的表達來行使抗逆功能。外源施加硝普鈉(SNP)也明顯地對Cd脅迫下玉米幼苗有保護作用，如增加玉米幼苗生物量以及提高各種抗氧化酶活性[20]。本研究中玉米幼苗在GSNO0+Cd80處理下，植株矮小，葉片卷曲黃化，根系生長發(fā)育受到顯著抑制,而用NO2-源的NO處理后，光合色素含量顯著增加，植株的生長狀況也逐漸得到恢復(fù)。且在一定濃度閾值內(nèi)，GSNO釋放的NO可以顯著提高玉米根系和葉片組織中抗氧化酶SOD、CAT、POD和APX的活性，消除組織中多余的ROS(H2O2和O2-)，減少氧化傷害。我們推測，玉米體內(nèi)NO2-源的NO對Cd脅迫的緩解作用，可能與提高植物清除ROS的能力(圖3，圖4，表2)，降低ROS對葉綠素的損傷(圖2)，提高光合速率，促進植株的生長發(fā)育有關(guān)(表1)。NO提高植物抗逆性的一個重要機制是誘導(dǎo)抗氧化防御系統(tǒng)，減小氧化脅迫。如向Cd脅迫處理的苧麻幼苗施加外源NO(SNP)后，相比較于單獨Cd脅迫處理的植株，SOD活性、APX活性以及GSH含量在短時間內(nèi)大幅提高，從而緩解了Cd對植株的毒害作用[21]。鹽脅迫會嚴(yán)重抑制芥末幼苗抗氧化酶的活性，而施加外源NO(SNP)則會使CAT活性、SOD活性以及APX活性迅速升高[22]。Singh[23]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫處理的水稻幼苗中H2O2以及O2-含量是無脅迫處理對照組的近兩倍，而外源NO處理后，ROS含量幾乎接近于對照組。這些結(jié)果都表明NO抗氧化功能可能是通過清除體內(nèi)多余的ROS來發(fā)揮作用。植物在細胞內(nèi)通過螯合作用將重金屬固定以降低其生物毒性是植物緩解重金屬脅迫的一種重要方式，而植物螯合素(PCs)是植物體內(nèi)主要的金屬螯合物質(zhì)[24]。PCs具有較低的分子量，可以與各種金屬離子形成硫醇結(jié)合蛋白[20]。D’Alessandro[25]等通過質(zhì)譜分析的方法測定Cd脅迫下芥菜幼苗的PC含量，發(fā)現(xiàn)一定濃度的Cd處理確實會引起PC2和PC3在植物體內(nèi)的積累。除了螯合重金屬之外，有研究者證實PCs還能夠降低植物體內(nèi)Cd脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS含量，提高重金屬耐受力[26]。GSH是一種三肽，是PCs合成的前體物質(zhì)，PCs的合成是從GSH的γ-谷氨酰半胱氨酰二肽轉(zhuǎn)肽而來，Cd脅迫會使ROS含量上升，從而擾亂抗壞血酸和GSH的正常代謝，使得GSH含量降低[27]。而GSH本身又是一種抗氧化劑，可以抵抗逆境，NO能夠啟動植物體抗脅迫機制，從而促進GSH含量的增加[28]。本文通過研究NO2-源的NO對Cd脅迫下玉米幼苗TAST、GSH和PCs含量的影響，發(fā)現(xiàn)此來源的NO對三者的含量都有促進作用，只不過它們在根系和葉片組織中對Cd抗性的貢獻不同。從對NO的響應(yīng)程度看，PCs(螯合機制)可能主要在根系中起作用，而GSH(抗氧化防御機制)主要在葉片中起作用。這對應(yīng)于葉片組織中活性氧的含量和抗氧化酶的活性大都高于根系組織。這就說明NO2-來源的NO能夠在重金屬脅迫下增強植物螯合和固定重金屬離子的能力，避免傷害延續(xù)，對脅迫起到了緩解作用。而且與化學(xué)合成的重金屬螯合劑或絡(luò)合劑相比，NO作用更迅速，半衰期更短，二次污染更小[2]。

本研究中也明顯觀察到了NO2-源的NO在增強玉米Cd脅迫耐受中的濃度依賴性，如并非隨施加GSNO供體的濃度增大而成比例地提高玉米幼苗對Cd的耐受性，高濃度GSNO甚至使一些指標(biāo)如PCs含量和部分抗氧化酶活性降低到脅迫水平。這可是能因為低濃度NO作為抗氧化劑，除了直接清除ROS之外，還誘導(dǎo)了抗氧化防御系統(tǒng)的活性；而高濃度的NO作為活性氮，對植株產(chǎn)生了硝化脅迫(Nitrosative stress)有關(guān)[29-30]。本研究設(shè)置的GSNO的濃度上限為350 μmol·L-1，隨著GSNO濃度的增加，硝化脅迫現(xiàn)象可能更加顯著。關(guān)于NO在植物應(yīng)答非生物逆境中的雙面性已有大量的報道[31]。因此要使其應(yīng)用在大田生產(chǎn)中，將來的研究重點需集中在其對大田作物、蔬菜或果品等的農(nóng)藝性狀的影響，合理的使用濃度及其環(huán)境安全性(如殘留情況)方面。

4結(jié)論

NO2-源生成的NO對Cd脅迫下玉米幼苗地上部和根系的生長均具有顯著的促進作用，緩解了Cd的毒害作用。并且通過維持光合色素含量的相對穩(wěn)定，有效地緩解了Cd脅迫下葉片的失綠黃化現(xiàn)象。還通過優(yōu)化玉米幼苗酶促抗氧化防御系統(tǒng)，進而降低ROS的迸發(fā)而抵御Cd脅迫。增加了玉米幼苗尤其是根系PCs的含量，進而通過增加對重金屬的螯合來減輕Cd的危害。

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Effects of nitric oxide, an indirect reaction production of NO2-, on the

physiological functions of maize under cadmium stress

JIA Jia, XU Yi-xin, LI Jia, FAN Wen-qiang, HU Jing-jiang, MU Zi-xin

(StateKeyLaboratoryofSoilErosionandDrylandFarmingontheLoessPlateau,

NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract：Gaseous signaling molecule nitric oxide (NO) is proven in many plants to be able to alleviate cadmium (Cd) stress. Under acidic conditions, glutathione (GSH) can react with sodium nitrite (NaNO2) to generate S-nitroso-glutathione (GSNO), which can release NO. The present work was to study whether this type of NO could help maize seedlings (ZeamaysL.) to resist Cd stress. Different concentrations of GSNO (50, 125, 250 μmol·L-1, and 350 μmol·L-1) were applied to maize seedlings that had been subjected to 80 mg·L-1CdCl2for 7 d. The results showed that GSNO could significantly improve maize seedlings plant height, stem diameter, and leaf area, especially at the 250 μmol·L-1GSNO concentration; The addition of 350 μmol·L-1GSNO couldmaintain photosynthetic pigment maximization, effectively alleviate leaf yellowing; The benificial effects of GSNO (optimum concentration was in the range of 150～250 μmol·L-1) on Cd-stressed maize might be related to the enhanced antioxidant enzyme activity, such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and peroxidase (POD), and decreased levels of H2O2and; Furthermore, GSNO greatly enhanced the capacity of maize seedlings to chelate heavy metal ions which optimal GSNO concentration was 250 μmol·L-1.

Keywords:NO; S-nitroso-glutathione; cadmium stress; maize; physiological functions

中圖分類號：S513.01

文獻標(biāo)志碼：A

通信作者：慕自新(1972—)，碩士生導(dǎo)師，主要從事材料逆境生理與分子方向的研究。 E-mail: muzx810@126.com。

作者簡介：賈佳(1989—)，女，山東德州人，碩士，主要從事植物逆境生理方面的研究。 E-mail: 646343281@qq.com。

基金項目：黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室基金(K318009902-14)

收稿日期：2015-03-02

doi:10.7606/j.issn.1000-7601.2016.01.25

文章編號：1000-7601(2016)01-0159-07