胡桂萍， 石旭平， 張國彪， 楊 廣， 方雅君， 黃瓊瑤

(1.江西省桑蠶茶葉研究所， 江西 南昌 330020； 2.福建農(nóng)林大學(xué) 應(yīng)用生態(tài)研究所， 福建 福州 350003)

茶渣蛋白提取工藝條件的優(yōu)化

胡桂萍1,2， 石旭平1， 張國彪1， 楊 廣2*， 方雅君2， 黃瓊瑤2

(1.江西省桑蠶茶葉研究所， 江西 南昌 330020； 2.福建農(nóng)林大學(xué) 應(yīng)用生態(tài)研究所， 福建 福州 350003)

為實(shí)現(xiàn)茶渣副產(chǎn)物資源的綜合利用，提高茶渣蛋白提取率，用堿浸提法提取廢茶渣蛋白，通過單因素試驗(yàn)分析不同提取溫度、NaOH濃度、提取時間和液固比對茶渣蛋白提取得率的影響。并在單因素篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design Expert 8統(tǒng)計(jì)分析軟件，設(shè)計(jì)4因素5水平響應(yīng)面試驗(yàn)對提取溫度、NaOH濃度、提取時間和液固比進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：茶渣蛋白的最佳提取條件為提取溫度50℃、NaOH濃度0.1 mol/L、液固比45∶1、提取時間4 h；在該條件下，茶渣蛋白提取得率為58.94%。

茶渣； 蛋白； 提取工藝； 響應(yīng)面試驗(yàn)

茶葉含有大量生物活性物質(zhì)成分，具有止渴、清神、消炎解毒等功效，因此被公認(rèn)為健康飲料。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每天全世界茶飲料的消費(fèi)量超過30億杯之多。我國是最大的產(chǎn)茶國且國內(nèi)的茶葉深加工產(chǎn)業(yè)化程度高，已有規(guī)模的茶飲料生產(chǎn)企業(yè)約近百家，如康師傅，娃哈哈等品牌。但隨著茶葉深加工的發(fā)展，深加工產(chǎn)生的副產(chǎn)品數(shù)量巨大，僅茶渣每年就有16萬t以上。這些廢渣一般堆放在工廠外或者直接丟棄城郊，不僅占用大量的土地，長期堆放容易霉變等反應(yīng)滋生不良?xì)馕?，污染大氣和環(huán)境[1-3]，隨著十二五規(guī)劃提出國家對節(jié)能減排政策的加強(qiáng)，如何處理這些茶渣已成為茶葉深加工廠家首先要解決的環(huán)境難題。

茶蛋白是茶葉重要功能物質(zhì)的組成成分，其含量約占茶葉干重20%～30%，種類豐富，而且絕大部分為非水溶性蛋白質(zhì)，約占茶葉總蛋白量的95%[4]。一般而言，茶葉經(jīng)沖泡后進(jìn)入茶湯的蛋白質(zhì)很少，只占茶葉蛋白質(zhì)總量2%左右，絕大部分非水溶性蛋白質(zhì)均殘留在茶渣中。茶葉中的內(nèi)含物質(zhì)如茶多酚、茶氨酸等雖然經(jīng)過深加工處理被提取出來，但是提取率低，因此茶渣中還有很多可以被利用的有效成分，經(jīng)對提取過茶多酚和茶氨酸后的廢茶渣檢測分析發(fā)現(xiàn)，茶渣中茶蛋白含量達(dá)50%以上。有研究顯示，茶蛋白具有降血脂、消除自由基、抗突變等營養(yǎng)保健功效[5-6]。而茶渣中非水溶性蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致提取困難。因此，通過有效途徑提取茶渣蛋白，提高茶渣蛋白提取率，從而提高茶葉的經(jīng)濟(jì)附加值以及實(shí)現(xiàn)茶渣副產(chǎn)物資源的綜合利用具有重要意義。目前，茶渣蛋白提取多采用堿浸提法[7-9]，該方法操作簡單，成本低，實(shí)用性強(qiáng)，可利用工業(yè)化推廣，但已報(bào)道的堿提取法存在提取溫度過高，固液比過大等問題。筆者立足于生產(chǎn)實(shí)際，以茶渣提取得率、減少能耗為指標(biāo)，茶渣為材料，通過單因素分析和響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化茶渣蛋白堿浸提取的最適提取溫度、pH、提取時間及固液比，以期為茶渣蛋白提取的生產(chǎn)應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶渣為福建大閩食品有限公司提供。

試劑：硝酸鈉、苯酚、次氯酸鈉、硫酸銨、氫氧化鈉、過氧化氫、濃硫酸、酒石酸鉀鈉，均為分析純(AR)。

儀器：低速大容量離心機(jī)(DL-5型，上海安亭科學(xué)儀器廠)，高溫電爐(XY-YRL-013，上海雄義電熱電器有限公司)，分析天平(FA2004，上海方瑞)，消化爐(KDN系列，杭州大材光電科技有限公司)，酶標(biāo)儀(iMark680，美國Bio-Rad公司)，立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器械廠)，酸式滴定管，專用鋁制容器等。

1.2 茶渣蛋白的提取

茶渣蛋白提取參考蔡志寧等[10]和鄒小明等[11]并略做修改，采用堿浸提法，稱取0.5 g發(fā)酵茶渣，按一定固液比加入20 mL一定濃度的NaOH溶液、適宜溫度下恒溫振蕩箱堿提一定時間，過濾，取濾液。

1.3 茶渣蛋白的消化

將得到的堿提液轉(zhuǎn)移入消化管中，于消化爐加熱煮沸去水，濃縮至1 mL液體，加入5 mL的濃硫酸，搖勻后，設(shè)置消化爐溫度220℃，消化20 min，待管內(nèi)形成白色循環(huán)氣流后，升溫至350℃，繼續(xù)消化40 min后，管內(nèi)樣品成深棕色，從消化爐中取出，稍涼后，加入1 mL 30%過氧化氫溶液，搖勻后，放回消化爐繼續(xù)消化10 min，此時再次取出，按照顏色變化情況加入30%過氧化氫，顏色越淺，加入量越少，隨后再放回消化爐消化，如此重復(fù)，直至管內(nèi)液體變得透明、澄清即可取出。冷涼后定容至100 mL容量瓶中，隨后轉(zhuǎn)移到100 mL塑料瓶中貯存?zhèn)溆谩２⒘砣∫豢瞻紫笠鹤鳛閷φ铡?/p>

1.4 茶渣蛋白的定量測定

茶渣蛋白濃度以樣品中N濃度來表示，測定方法采用靛酚藍(lán)比色法。具體方法如下：1) 通過酶標(biāo)儀測定標(biāo)準(zhǔn)品在635 nm波長下測取吸光值，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為A=0.743 7C+0.002 1，r2=0.999 9(其中A為吸光度，C為N標(biāo)準(zhǔn)液濃度)。2) 樣品測定：吸取10 mL的N提取液，稀釋定容，隨后通過酶標(biāo)儀上測量其在635 nm上的吸光值，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出容量瓶內(nèi)N濃度，根據(jù)以下公式求得N含量：

式中：N為氮含量(mg/g)，C為計(jì)算出的N濃度(mg/mL)，VC試管內(nèi)總體積(mL)，VS為測定時取用的樣品提取液體積(mL)，VT為提取液總體積(mL)，P為稀釋倍數(shù)，W為樣品鮮重(g)。

1.5 茶渣提取條件單因素考察

以茶渣為原料，用堿性水溶液提取，分別選取堿液濃度、溫度、時間、固液比4個因素考察，初始條件設(shè)置為0.5 g茶渣，固液比40∶1(w/v，下同)，NaOH溶液20 mL 0.06 mol/L，35℃恒溫振蕩箱，堿提時間2 h。具體方法如下：

1) 溫度。固定其他提取條件(固液比40∶1，NaOH溶液20 mL 0.06 mol/L，堿提時間2 h)，分別測定30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃下的茶渣蛋白得率。

2) 堿濃度。固定其他提取條件(固液比40∶1，35℃恒溫振蕩箱，堿提時間2 h)，分別測定茶渣在NaOH濃度0.02 mol/L、0.04 mol/L、0.06 mol/L、0.08 mol/L、0.10 mol/L、0.12 mol/L和0.14 mol/L下的茶渣蛋白得率。

3) 堿提取時間。固定其他提取條件(固液比40∶1，35℃恒溫振蕩箱，0.06 mol/L NaOH溶液20 mL)，分別測定茶渣在提取時間為0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h下的茶渣蛋白得率。

4) 固液比。固定其他提取條件(提取時間2 h，35℃恒溫振蕩箱，0.06 mol/L NaOH溶液20 mL)，分別測定茶渣在不同固液比30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1、55∶1、60∶1下的茶渣蛋白得率。

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蛋白提取量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其因素水平見表1。

表1 茶渣蛋白提取響應(yīng)面試驗(yàn)的因素及水平

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析通過Excel數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過DPS軟件，數(shù)據(jù)采用Fisher’s LSD test方差分析，響應(yīng)面分析利用Design-expert 8.0軟件采用Central Composites設(shè)計(jì)方法，對提取溫度，堿濃度，提取時間和固液比進(jìn)行4因素5水平優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對茶渣蛋白提取的影響

2.1.1 溫度 提取溫度為30～50℃條件下，茶渣蛋白得率隨提取的溫度升高而升高，其中30～40℃下蛋白得率增幅較小，40～50℃下的蛋白得率增幅較大，50℃時茶渣蛋白得率最高，為77.68%。提取溫度超過50℃，所提取的茶渣蛋白得率反而下降(圖示)，故提取溫度宜在50℃左右。

圖示 不同影響因素下的茶渣蛋白得率

Fig. Extraction yield of protein from exhausted tea with different influencing factors

2.1.2 NaOH濃度 茶渣蛋白得率隨著NaOH濃度的升高而升高，NaOH濃度在0.04～0.1 mol/L時，蛋白得率增加量較大；NaOH濃度在0.1～0.14 mol/L時，蛋白得率的增加量變低。從其工業(yè)化生產(chǎn)成本和利潤角度考慮，茶渣蛋白提取的NaOH濃度可初步定為0.1 mol/L。

2.1.3 提取時間 堿提時間越長，堿提取蛋白的得率越高。其中堿提時間在0.5～3 h，蛋白得率較低，均低于40%；堿提時間在3～4 h，蛋白得率迅速增大，并于4 h時蛋白得率達(dá)到最高值，為68.38%；堿提時間超過4 h，蛋白得率開始下降。故當(dāng)堿提取時間為4 h時，茶渣中蛋白提取效果較好。

2.1.4 固液比 茶渣蛋白得率隨固液比增大而增大，當(dāng)固液比達(dá)45∶1后，增加幅度不大。在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，低固液比能夠降低體系黏度，加快傳質(zhì)過程，提取效果增加，但低固液比后續(xù)處理的難度加大。故綜合考慮，茶渣蛋白提取的適合固液比宜在45∶1左右。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立 由表2可知，茶渣蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及各處理的蛋白得率，對其數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合回歸分析，采用逐步回歸的方法對設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，建立二次回歸模型：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)各處理的茶渣蛋白得率

Table 2 Extraction yield of protein in the response surface experiment of extracting protein from exhausted tea

處理Treatmentx1x2x3x4蛋白得率/%Proteinyield122-2253．552000-436．003-22-2251．604000458．805222-246．206-2-2-2-232．1072-22-238．7080-40035．40922-2-245．7510400039．7511-2-2-2232．7012000058．20132-2-2251．1514-22-2-249．2015-2-22-240．8016000055．2017-222-255．0518000055．6519000057．60202-22248．9021000059．1022000059．5523222256．8524040053．85252-2-2-241．8526-2-22244．8527004049．5028-222266．4529-400048．603000-4053．55

范圍內(nèi)，各因素對結(jié)果的影響排序?yàn)閤4>x2>x3>x1。

2.2.2 優(yōu)化組合與模型驗(yàn)證 為得到茶渣蛋白最佳提取工藝條件，將所得到的回歸方程分別對各自變量取一階偏導(dǎo)等于零可得到一個四元一次方程：

57.24-7.58x1-3.13x2-2.70x3+1.22x4=0

62.99-3.13x1-6.36x2+0.56x3+0.51x4=0

58.88-2.17x1+0.56x2-2.92x3+1.01x4=0

61.80+1.22x1+0.52x2+1.01x3-4.98x4=0

求解方程組，可到模型極值坐標(biāo)為x1=0.66，x2=1.7，x3=-1.26，x4=-0.55相當(dāng)于提取溫度50℃，堿濃度0.1 mol/L，提取時間4 h，固液比45∶1，求得茶渣蛋白提取得率最大預(yù)測值為59.21%。用上述得到的最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到茶渣蛋白實(shí)際提取得率為(58.94±1.03)%，與預(yù)測值59.21%有良好的擬合性，說明模型具有有效性，此優(yōu)化組合有效，得到的優(yōu)化組合為茶渣蛋白提取的最優(yōu)條件，具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

表3 回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)

注：1)r2=0.9212，Adj-r2=0.8476, 2) ***為差異極顯著(p<0.001)；*為差異顯著(p<0.05)

Note：1)r2=0.921 2，Adj-r2=0.84 76, 2) *** and * indicated significant levels ofp<0.001 andp<0.05 respectively.

3 結(jié)論與討論

廢茶渣中含有的粗蛋白80%以上為分子量很大的谷蛋白，谷蛋白分子間通過二硫鍵和疏水基團(tuán)進(jìn)行交聯(lián)和凝聚，直接影響到蛋白的提取和分離，嚴(yán)重限制了茶渣蛋白的資源化利用[19]。茶渣蛋白提取隨溫度的升高而下降，溫度高于50℃后，蛋白容易高溫變性凝聚，蛋白質(zhì)溶出效果降低，從而使蛋白提取效果下降[12]。試驗(yàn)采用響應(yīng)面法獲得茶渣蛋白提取最適溫度50℃，有利于茶渣蛋白的提取，這與沈蓮清等的試驗(yàn)研究結(jié)果一致[13]。另外，本研究得到茶渣蛋白提取最適堿濃度為0.1 mol/L，與已報(bào)道的相關(guān)研究相比，該工藝采用較低的堿液濃度，不僅大大降低生產(chǎn)成本，且提高提取蛋白的得率。堿液對蛋白質(zhì)分子的次級鍵特別是氫鍵具有破壞作用，并可使某些極性基團(tuán)發(fā)生解離[14]，使蛋白質(zhì)表面分子具有相同的電荷，對蛋白質(zhì)分子具有增溶作用，從而導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，引起蛋白質(zhì)變性，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，或部分蛋白質(zhì)水解，反而使得率降低[15]。倪星虹[16]的試驗(yàn)結(jié)果也表明茶渣在NaOH濃度為0.1 mol/L時，蛋白提取率最高。張曉輝[7]、王忠英[8]和李娟等[9]的研究中也采用了較低的堿液濃度，但提取溫度高，且提取率均不佳。蔡志寧等正交組合優(yōu)化茶渣蛋白堿提取的條件得到茶渣蛋白提取最優(yōu)固液比1∶8、時間60 min、pH 11、溫度60℃，但該條件下蛋白的提取率低，僅為21.89%。而毛銀等采用正交試驗(yàn)也獲得茶渣蛋白堿提取法最優(yōu)提取條件并獲得較高的蛋白得率77.35%，但其提取溫度80℃過高，堿液濃度0.3 mol/L偏高，均容易導(dǎo)致茶葉中蛋白的變性，嚴(yán)重影響提取蛋白的質(zhì)量和產(chǎn)量，不利于推廣應(yīng)用[17]。另外，也有報(bào)道通過加酶提取茶渣蛋白[11,18-19]，雖提取效能增加，但存在成本過高，不利于工廠化推廣。本研究采用中心組合方式優(yōu)化得到茶渣蛋白堿液提取最佳組合工藝，提取溫度50℃、NaOH濃度0.1 mol/L、液固比45∶1、提取時間4 h，提取溫度適宜，堿液濃度適宜，固液比和提取時間適中，具備工業(yè)生產(chǎn)的意義，同時茶渣蛋白得率可達(dá)59.89%，該工藝在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用上具有優(yōu)越性。

[1] 羅紅玉,黎星輝,郁 軍.茶渣回收利用研究現(xiàn)狀[J].福建茶葉,2010(7):8-12.

[2] 傅志民,吳永福.廢棄茶渣綜合再利用研究進(jìn)展[J].中國茶葉加工,2011(1):17-20.

[3] 張小琴,黃昭密,鄭思芳,等.茶渣之再利用研究[J].福建茶葉,2012(1):14-16.

[4] 安徽農(nóng)學(xué)院.茶葉生物化學(xué)[M].2版.北京，農(nóng)業(yè)出版社，1988.

[5] 活 潑,黃光榮,張曉輝,等.非水溶性茶葉蛋白降血脂作用的研究[J].茶葉科學(xué),2005,25(2):95-99.

[6] 李 燕,蔡東聯(lián).茶蛋白液預(yù)防輻射引起的突變效應(yīng)[J].癌變·畸變·突變,2001,13(1):32-35.

[7] 張曉輝,章克昌,活 潑,等.非水溶性茶蛋白的提取工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2005,26(3):64-67.

[8] 王忠英.茶葉中蛋白的提取及理化性質(zhì)的研究[D].杭州:浙江工商大學(xué),2006.

[9] 李 娟.非水溶性茶葉蛋白提取及理化性質(zhì)研究[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[10] 蔡志寧,王春燕.茶渣蛋白提取工藝研究[J].茶葉科學(xué),2008,28(4):309-312.

[11] 鄒小明,謝 騫,朱立成,等.茶葉蛋白的提取工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,(1):169-171.

[12] 李運(yùn)罡,李夢琴,張 劍,等.響應(yīng)曲面法提取玉米谷蛋白工藝優(yōu)化研究[J].糧食與飼料工業(yè),2008(9):24-25.

[13] 沈蓮清,黃光榮.茶渣中蛋白質(zhì)的堿法提取工藝研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2007,7(6):108-112.

[14] 王文高.早秈稻及碎米轉(zhuǎn)化為低過敏性蛋白和緩釋淀粉的研究——低過敏性大米蛋白質(zhì)的研究[D].無錫:江南大學(xué),2001.

[15] 江志煒,沈蓓英,潘秋琴．蛋白質(zhì)加工技術(shù)[M].北京,化學(xué)工業(yè)出版社,2003.

[16] 倪星虹.茶渣提取蛋白及飼料化利用的初步研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011

[17] 毛 銀,王 彬,朱科學(xué),等.堿法提取茶渣蛋白工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2013,34(14):36-38.

[18] 周紹遷,徐 炎,郭洪濤,等.茶渣蛋白的提取、酶解及其作為飼料添加劑的應(yīng)用研究[J].飲料工業(yè),2011,14(12):10-14

[19] 靳偉剛,張 洋,羅鋆琳,等.茶渣資源的開發(fā)與利用——茶渣中茶葉蛋白的酶法提取和酶法水解[J].中國食品添加劑,2011(4):54-58.

(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

Optimization of Extraction Technique for Protein from Exhausted Tea

HU Guiping1,2， SHI Xuping1， ZHANG Guobiao1， YANG Guang2*， FANG Yajun2， HUANG Qiongyao2

(1.JiangxiSericultureandTeaResearchInstitute，Nanchang，Jiangxi330202; 2.InstituteofAppliedEcology,FujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350003，China)

To realize the intergraded utilization of exhausted tea and enhance the extraction rate of protein, alkali solution was adopted to extract the protein from exhausted tea. A single factor experiment was conducted to analyze the effects of extraction temperature, NaOH concentration, extraction time and liquid-solid ratio on protein extraction rate from exhausted tea. Taking the protein concentration as the main factor, a quadratic regression model of extraction conditions containing extracted temperature, NaOH concentration, extracted time and liquid-solid ratio was obtained using a four-factor and five-level test conducting on the statisstical analysis software of Design-Expert 8 which was performed according to the single-factor experiment, and the optimal condition of the extracted protein was also required. The results showed that the optimal extracted conditions were as follows: 50℃ of temperature, 0.1 mol/L of NaOH concentration, 4 h of extracted time and 45∶1 of liquid-solid ratio, and the total extracted protein yield reached 58.94% under the optimal conditions.

exhausted tea; protein; extraction technique; response surface experiment

2015-09-14； 2016-03-14修回

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303094-08)；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20151BBA13042)

胡桂萍(1985-)，女，在讀博士，研究方向：茶葉副產(chǎn)物資源化利用 E-mail:hugp_2007@163.com

*通訊作者：楊 廣(1972-)，男，教授，從事昆蟲生態(tài)及害蟲綜合治理 。E-mail:yxg@iae.fjau.edu.cn

1001-3601(2016)05-0220-0127-04

S38

A

加工貯藏·農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量

Processing and Storage·Agricultural Product Quality