李麗莎， 李祥龍，2*， 周榮艷， 李蘭會

(1.河北農業(yè)大學， 河北 保定 071000； 2.河北科技師范學院， 河北 秦皇島 066004)

山羊酪氨酸相關蛋白1(TYRP1)基因密碼子偏好性分析

李麗莎1， 李祥龍1，2*， 周榮艷1， 李蘭會1

(1.河北農業(yè)大學， 河北 保定 071000； 2.河北科技師范學院， 河北 秦皇島 066004)

為TYRP1基因選擇合適的表達系統及該基因編碼蛋白的結構和功能的研究提供依據，運用CodonW軟件和Usage Codon在線程序分析山羊酪氨酸相關蛋白1基因密碼子偏性，比較不同物種TYRP1基因密碼子使用偏性，并比較基于同義密碼子相對使用度形成的聚類和基于編碼區(qū)構建的系統發(fā)育結果。結果表明：山羊偏好使用的密碼子有27個，以A/T結尾密碼子的同義密碼子相對使用度值明顯偏高。山羊與藏羚羊、黑猩猩、家貓、家牛、家犬、家兔、綿羊、雙峰駝、羊駝和野豬在密碼子使用上相似，與家馬不同?；谕x密碼子相對使用度的聚類與基于編碼區(qū)構建的系統發(fā)育結果不同，但TYRP1基因編碼區(qū)形成的親緣關系更可靠。

山羊； 酪氨酸相關蛋白1； 密碼子偏好性

在動物中，黑色素是最普遍的色素，同時也是哺乳動物唯一能夠合成的色素[1]。動物的黑色素主要分為兩大類：真黑色素(黑色、棕色或藍灰色)和褐黑色素(微紅色、黃色或褐色)[2-3]。黑素生成通路的關鍵酶由酪氨酸酶基因家族編碼，家族成員分別是酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相關蛋白1(TYRP1)和酪氨酸相關蛋白2(TYRP2)也稱為多巴色素異構酶(DCT)[4]。TYRP1基因是第一個克隆成功的色素基因，隨后在許多物種中也被成功克隆。TYRP1基因在黑色素合成過程中起調控作用，并對黑色素細胞的發(fā)育、生存與功能有調節(jié)作用[5-7]。同時，該基因對穩(wěn)定酪氨酸酶活性具有重要意義，并能直接影響黑色素的生成[8]。毛色是山羊絨/毛/羔皮及裘皮的重要質量性狀[9]，影響山羊毛色候選基因一直都受到廣泛關注，TYRP1基因在真黑色素形成過程中的關鍵作用已成為研究的熱點。

mRNA是蛋白質合成的模板，mRNA與蛋白質之間的聯系是通過三聯密碼的破譯實現。已知61種密碼子共編碼20種氨基酸，每種氨基酸至少由1種密碼子進行編碼，最多可由6種密碼子進行編碼，這樣對應同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子(synonymous codon)。在編碼蛋白質的過程中，同義密碼子的使用概率不同[9-10]，將基因優(yōu)先使用的密碼子稱為最優(yōu)密碼子(optimal codon)，此現象稱為密碼子偏性[11]。大量研究發(fā)現，不同物種的基因對密碼子的使用具有明顯的偏性[12]，并且不同功能的基因的密碼子偏性也存在較大的差異[13]。產生這種現象的因素有很多，如基因的表達水平[14-15]、翻譯起始效應[16-17]、堿基的組分[18]、某些二核苷酸出現的頻率[19-20]、GC含量[21-22]、基因長度[23]、tRNA的豐度[24-25]、蛋白質的結構[26]、蛋白質疏水水平[27]及密碼子-反密碼子間結合能的大小[28]等。對密碼子偏性的研究為揭示有關物種間或某一物種的基因家族間的基因進化規(guī)律，了解轉錄和翻譯進程中的調控機制，預測外源基因的最適宿主及通過改良外源基因以提高其表達水平等提供理論依據[29]。研究表明，利用聚類分析方法[30]研究不同基因在密碼子偏性上的相似性具有可行性。筆者通過CodonW軟件和Usage Codon在線程序分析山羊TYRP1基因的密碼子偏好性，并與不同物種TYRP1基因密碼子偏好性進行比較，為TYRP1基因選擇合適的表達系統及該基因編碼蛋白的結構和功能的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 目的基因的獲取

山羊TYRP1基因的核苷酸序列全長1 614 bp，編碼538個氨基酸。藏羚羊、黑猩猩和家馬等物種的TYRP1基因完整編碼區(qū)核苷酸序列數據均來源于NCBI上的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)Genbank數據庫(表1)。共計12個物種12條TYRP1基因編碼區(qū)核苷酸序列。

表1 TYRP1基因的完整編碼區(qū)來源

1.2 RSCU 的計算

同義密碼子相對使用度(Relative synonymous codon usage，RSCU)是指某一特定的密碼子在編碼對應氨基酸的同義密碼子中的相對概率。氨基酸的使用和密碼子的豐度不影響該值，RSCU值能直觀地反映出密碼子使用偏好性的程度[30]。當RSCU=1時，表明密碼子使用無偏好性；當RSCU>1時，表明該密碼子的使用頻率較高。根據值大小判斷偏好程度，反正亦然。Fraction表示各個密碼子在編碼該氨基酸的密碼子中所占的比例，編碼各氨基酸的密碼子各比例之和為1。Frequency表示該密碼子在編碼基因總密碼子中出現的頻率，即在1000個密碼子中出現的次數。利用Usage Codon在線程序(http://www.geneinfinity.org/sms/sms_codonusage.html)分析山羊TYRP1基因的Fraction和Frequency值，利用CodonW軟件分析不同物種的RSCU值。

1.3 ENc、GC含量、 GC3s、FOP和CBI 的計算

有效密碼子數(Effective number of codons，ENc)是一個能反映同義密碼子非均衡使用的偏好程度的量化值[31]，該值的范圍為20～61，越靠近20表明偏好性越強。該值同時能確定內源基因表達量的相對高低，ENc值越大，對應的內源基因表達量越低，反之亦然。GC含量和密碼子第三位的GC含量(GC3s)可以反映出堿基組成是否表現出明顯的偏倚性，以0.5為一個界限，當二者均大于0.5時，表明該基因傾向于G、C堿基的使用。最優(yōu)密碼子使用頻率(Frequency of optimal codons，FOP)可以確定基因密碼子的最佳密碼子，為蛋白的高表達改造提供依據，該值范圍是0～1。密碼子偏愛指數(Condon bias index，CBI)[32]反映一個具體基因中高表達優(yōu)越密碼子的組分情況：當CBI=1時，表明所有密碼子均為偏向使用；當CBI=0時，表明所有密碼子完全隨機使用；CBI也可為負值。利用CodonW軟件計算不同物種的ENc、GC、GC3s、FOP和CBI值。

1.4TYRP1基因的聚類分析方法

利用SPSS19.0軟件對不同動物TYRP1基因密碼子使用偏性的歐式平方距離系數進行聚類分析，在聚類的過程中，以每個物種的TYRP1基因作為一個對象，不考慮色氨酸、甲硫氨酸和3個終止密碼子，剩余59個密碼子的相對使用度作為變量，不同物種基因間的距離規(guī)定為同義密碼子相對使用度的歐式平方距離[32]。計算2個基因間密碼子使用偏性的歐式距離系數公式如下：

利用Clustal W 2.1軟件對不同物種TYRP1基因編碼區(qū)編碼核苷酸序列進行序列比對，再由MEGA[34]軟件按鄰接法[35]構建系統發(fā)育樹，該系統發(fā)育樹的可靠性經1000次重復的自舉檢驗法檢驗。

2 結果與分析

2.1 有效密碼子數的 (ENc)、GC、CG3s、FOP和CBI

經軟件計算，山羊TYRP1基因的ENc值、GC值、CG3s值、FOP值和CBI值分別為52.71、0.485、0.467、0.444、0.040?？梢奅Nc值偏大，表明山羊TYRP1基因在編碼氨基酸時出現的頻率較為一致；山羊TYRP1基因CDS區(qū)GC含量較低，其GC3s值也較低，表明山羊偏好使用以A、T結尾的密碼子，而且在完整的CDS區(qū)中A+T含量大于G+C含量；FOP值和CBI值均略微偏低，二者再次表明山羊TYRP1基因中高表達優(yōu)越密碼子的使用偏低。

2.2 密碼子的偏好性

由表2可知，在山羊TYRP1基因的密碼子中，27個密碼子的RSCU值大于1，其中RSCU值大于1.5的密碼子共10個，以A、T結尾的有13個密碼子，分別是GCT、GAT、GAA、TTT、GGA、ATT、CCA、CCT、AGA、TCA、TCT、ACA、ACT，且這些密碼子的Fraction值也較大，為山羊TYRP1基因的偏好密碼子，其終止密碼子也使用了TAA；而其余以G、C結尾的密碼子的RSCU值大部分低于A、T結尾的密碼子的RSCU值。對RSCU值小于1的密碼子分析發(fā)現，大多數是以G、C結尾，且這些密碼子的Fraction值也較低。

表2 山羊TYRP1 基因的密碼子偏好性

注：大于1的RSCU值用下劃線表示(下同)。

Note: The data with underline mean that the value of RSCU>1.The same below.

2.3 與其他動物TYRP1 基因密碼子偏好性的比較

由表3可看出，藏羚羊、黑猩猩、家貓、家牛、家犬、家兔、綿羊、雙峰駝、羊駝和野豬在密碼子使用上與山羊相似，這些物種的ENc值均小于55；而家馬的ENc值為55.10，大于55。表明山羊、藏羚羊和黑猩猩等11個物種的各密碼子在編碼氨基酸時出現的頻率較為一致，且TYRP1基因表達水平一般，而家馬的基因表達水平偏低。所有物種的GC含量和GC3s值均較為接近，且都低于0.5，提示這些物種TYRP1基因對A、T均有一定的偏好性，其中偶蹄目的GC含量和GC3s值大于其他物種。所有物種的FOP值均小于0.5。黑猩猩、家貓、家犬、家兔和野豬的CBI值均為負值，說明這幾個物種的最佳密碼子數目少于期望值。

表3 不同物種TYRP1 基因的ENc、GC、GC3s、FOP 和CBI值

2.4TYRP1 基因的聚類

由表4、表5可知，家馬和家貓與其他物種的距離差異不大，家犬、家兔分別和雙峰駝、羊駝這2個偶蹄目動物的距離較遠，同時黑猩猩和雙峰駝之間的距離也較遠，但同是偶蹄目的山羊、綿羊、藏羚羊和家牛之間的距離較近，揭示出基于各物種之間的歐式距離系數建立起來的聚類分析可能與動物學分類一致。

由圖示可知，這些物種總共形成了2大類，一類全為偶蹄目動物的綿羊、山羊、藏羚羊、家牛、雙駝峰和羊駝，說明這些物種對密碼子的用法較為相似；而家犬、家兔、黑猩猩、家馬、家貓和野豬聚成另一類，說明基于同義密碼子相對使用度的聚類并沒有反映出食肉目、奇蹄目、靈長目和兔形目這些哺乳動物的親緣關系，比如說同為食肉目的家犬和家貓沒有聚在一起，家犬和兔形目動物家兔首先聚在一起，這一聚類結果和基于各物種TYRP1基因的編碼區(qū)形成的系統發(fā)育樹(圖示)不一致，樹中分支位置的數值幾乎全部大于75，表明置信度較高，因此由編碼區(qū)構建的系統發(fā)育樹更符合動物學分類，更接近這12個物種的真實分類系統，表明TYRP1基因編碼區(qū)的差異大小更能反映物種間的親緣關系。

表4 不同物種TYRP1 基因的RSCU 值

續(xù)表4

CAC1．371．331．161．201．371．101．221．371．371．411．291．56ATTIleI1．701．671．881．671．952．171．751．571．771．421．421．95ATC0．390．330．560．500．150．170．500．650．410．790．950．15ATA0．911．000．560．830．900．670．750．780．820．790．630．90AAALysK0．751．200．891．000．890．731．110．750．750．500．500．89AAG1．250．801．111．001．111．270．891．251．251．501．501．11TTALeuL0．530．490．650．380．400．400．420．670．530．770．770．65TTG0．801．351．041．250．931．331．400．800．930．770．890．91CTT0．930．860．911．250．931．071．400．800．800．770．770．78CTC0．931．221．300．881．071．070．700．930．930．890．890．91CTA0．270．370．260．130．400．400．560．400．400．260．260．78CTG2．531．711．832．132．271．731．532．402．402．552．431．96ATGMetM1．001．001．001．001．001．001．001．001．001．001．001．00AATAsnN0．831．031．131．150．851．291．350．940．940．810．690．88AAC1．170．970．870．851．150．710．651．061．061．191．311．13CCTProP1．841．741．681．371．671．411．371．731．731．711．781．78CCC0．430．620．420．530．440．650．630．430．430．690．670．67CCA1．621．641．471．791．561．951．581．621．621．491．441．33CCG0．110．000．420．320．330．000．420．220．220．110．110．22CAAGlnQ0．550．861．000．910．570．820．80．550．550．730．730．61CAG1．451．141．001．091．431．181．201．451．451．271．271．39AGAArgR1．822．052．111．941．542．812．291．821．821．951．952．17AGG1．821．261．621．761．891．131．591．821．821．621．781．50CGT0．360．630．650．530．340．560．350．360．360．490．490．67CGC0．730．630．490．180．860．190．530．730．730．650．650．33CGA0．910．470．650．880．860．560．710．910．910．970．810．83CGG0．360．950．490．720．510．750．530．360．360．320．320．50AGTSerS0．491．380．750．620．420．831．420．460．470．570．861．08AGC1．140．771．351．231．401．170．471．381．261．431．141．08TCT2．111．541．801．691．951．331．112．001．891．431．141．69TCC1．141．381．201．231．121．501．891．081．261．291．571．38TCA1．140．920．750．771．121．170．951．081．111．141．000．77TCG0．000．000．150．460．000．000．160．000．000．140．290．00ACTThrT1．141．131．031．451．141．651．581．141．141．441．261．51ACC1．140．751．261．091．140．940．971．141．141．331．260．97ACA1．711．641．261．211．711．411．451．711．710．890．911．51ACG0．000．500．460．240．000．000．000．000．000．330．570．00GTTValV0．691．001．181．250．851．441．030．670．671．161．100．93GTC1．661．501．291．501．451．111．421．601．601．421．521．73GTA0．410．380．120．500．360．560．520．530．530．130．000．67GTG1．241．131．410．751．330．891．031．201．201．291．380．67TGGTrpW1．001．001．001．001．001．001．001．001．001．001．001．00TATTyrY0．781．161．001．050．861．001．000．560．670．630．530．84TAC1．220．841．000．951．141．001．001．441．331．371．471．16

表5 不同物種TYRP1 基因間密碼子使用偏性的歐式平方距離系數

圖示 基于TYRP1基因的RSCU值與CDS區(qū)的聚 類樹狀圖

Fig. Cluster analysis ofTYRP1 gene coding region and RSCU

3 結論與討論

通過分析山羊TYRP1基因的密碼子使用特征發(fā)現，山羊偏好使用以A/T結尾的密碼子，27個密碼子存在使用偏性，其中使用頻率最高的是TAA(3.00)，也是該基因的終止密碼子。關于終止密碼子不用的終止密碼子終止效率不同，其中以TAA的終止效率最高，其次是TAG，而TGA的終止效率最低[36]。Sun等[37]研究發(fā)現，終止密碼子TAA主要出現于低復雜度的真核生物如酵母和非脊柱動物，TAG出現于真核生物的幾率也很低，TGA主要出現于較復雜的真核生物中，尤其是脊柱動物。本研究發(fā)現，山羊TYRP1基因的終止密碼子為TAA，這與Sun等研究結果不一致，這可能是由于終止密碼子使用的偏好性因物種及基因的不同而有所差異。

本研究比較不同物種TYRP1基因密碼子使用的偏好性時發(fā)現，山羊、藏羚羊、黑猩猩、家貓、家牛、家犬、家兔、綿羊、雙峰駝、羊駝和野豬這11個物種的各密碼子在編碼氨基酸時出現的頻率較為一致，且TYRP1基因表達水平一般，而家馬的基因表達水平偏低。這可能是由于在基因類型及功能一定的條件下，物種間的差別對密碼子使用偏性也存在差異。周童[13]等也發(fā)現，在進化過程中，親緣關系較近的物種之間的同義密碼子的使用具有較大的相似性。

將基于TYRP1基因同義密碼子相對使用度的聚類結果和基于該基因編碼區(qū)的系統發(fā)育結果比較發(fā)現，前者形成的聚類結果在親緣關系相近的物種之間其密碼子使用偏性較為接近，但在傳統的動物性分類上相近的物種之間仍存在差異，如而家犬(食肉目)、家兔(兔形目)、黑猩猩(靈長目)、家馬(奇蹄目)、家貓(食肉目)和野豬(偶蹄目)聚成一類。這與基于編碼區(qū)序列形成的系統發(fā)育結果不一致，基于密碼子偏好性的聚類并不能完全、真實地對應于系統發(fā)育關系[38]，劉漢梅等[39]，晁岳恩等[40]，郭秀麗等[41]的研究中也出現過此種結果。這可能是由于在進化上，單基因可能存在較大的突變才造成其密碼子使用偏性發(fā)生較大的變化，從而呈現出與真實的分類地位不同。TYRP1基因同義密碼子使用偏性上的差異對該基因在生物體系中蛋白質的表達效率具有重要影響，提示今后在提高特定蛋白的表達效率時，可優(yōu)先選擇高表達的同義密碼子，通過人工合成目的基因序列，這樣能有效提高獲得目標蛋白的水平。

對山羊及其他11個物種TYRP1基因對密碼子使用的偏好性比較發(fā)現，山羊偏好使用以A/T結尾的密碼子，在所有密碼子中，RSCU值大于1.5的密碼子共10個，以A、T結尾的有7個密碼子，且終止密碼子也使用了TAA。山羊與藏羚羊、黑猩猩、家貓、家牛、家犬、家兔、綿羊、雙峰駝、羊駝和野豬在密碼子使用上相似，與家馬不同?；谕x密碼子相對使用度的聚類與基于編碼區(qū)構建的聚類不同，發(fā)現TYRP1基因編碼區(qū)的差異大小更能反映物種間的親緣關系。

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(責任編輯： 劉忠麗)

Analysis of Codon Bias ofTYRP1 Gene inCaprahircus

LI Lisha1, LI Xianglong1.2*, ZHOU Rongyan1, LI Lanhui1

(1.AgricultureUniversityofHebei,Baoding,Hebei071000;2.HebeiNormalUniversityofScience&Technology,Qinhuangdao,Hebei066004,China)

As a link between the nucleic acid and protein, the usage of codon has important biological significance. The authors analyzed the codon usage bias ofTYRP1 gene inC.hircusby CodonW software and Codon Usage online program, compared the codon usage bias ofTYRP1 gene in different species, and compared the cluster based on the relative synonymous codon usage and the result of the phylogeny based on the coding region. The results showed that the preferences using codon ofC.hircusthad 27, and the value of the relative synonymous codon usage at the end of A and T were significantly higher. In codon usage,C.hircus,Pantholopshodgsonii,Pantroglodytes,Feliscatus,Bostaurus,Canislupusfamiliaris,Oryctolaguscuniculus,Ovisaries,Camelusbactrianus,VicugnapacosandSusscrofawere similar but different fromEquuscaballus. Clustering based on the relative synonymous codon usage was different from the results of phylogeny based on coding region, but the genetic relationship of theTYRP1 gene coding sequences was more reliable.

Caprahircus; tyrosinase-related protein 1; codon bias

2015-08-18; 2016-03-04修回

河北省高校創(chuàng)新團隊領軍人才培育計劃(LJRC004)；河北省應用基礎研究計劃重點基礎研究項目“山羊彩色絨毛關鍵功能基因及調控元件克隆和功能研究”(15962901D)；河北省科技計劃項目(15226302D)

李麗莎(1989-)，女，在讀碩士，研究方向：動物遺傳育種。E-mail:15131276262@163.com

*通訊作者：李祥龍(1963-)，男，教授，博士，從事動物遺傳育種研究。E-mail:lixianglongcn@yahoo.com

1001-3601(2016)03-0126-0113-07

S827； Q959.3

A