左澤彥， 孫端方

(貴州省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院， 國家酒類及加工食品質量監(jiān)督檢驗中心， 貴州 貴陽 550016)

實時熒光PCR檢測食品中牛及豬源性成分

左澤彥， 孫端方*

(貴州省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院， 國家酒類及加工食品質量監(jiān)督檢驗中心， 貴州 貴陽 550016)

為快速檢測出食用肉類中摻假物質，確保消費者切身利益，維持正常市場秩序，提升貴州省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗的檢測能力，采用實時熒光定量PCR對豬源性成分和牛源性成分進行檢測。結果表明：熒光PCR可以用來檢測豬、牛等動物源性成分，且檢測靈敏度為1%；熒光PCR檢測動物源性成分提高了檢測效率及靈敏度，降低了假陽性機率。

實時熒光定量PCR； 動物源性成分； 牛； 豬； 檢測

近年來，食用肉類摻假事件逐漸成為當前食品安全熱點問題，繼2013年歐洲馬肉風波之后，肉類摻假已引起全球的重點關注[1]。同年我國濟南沃爾瑪發(fā)生狐貍肉冒充牛肉、驢肉事件；北京、上海等一線城市相繼披露了制售摻假羊肉事件；2015年7月，在埃及法雨地區(qū)也發(fā)生了肉類摻假事件[2]。究其原因，實為不法商販以低價肉類冒充或摻假高價肉類擷取違法利益。但當前肉類摻假工藝復雜，尤其在肉類加工品中為甚，僅憑感官和傳統(tǒng)方法無法鑒別。既損害消費權益，也危害市場[3]。因此，各檢測機構有必要建立高效的食品及相關產(chǎn)品中動物源性成分的鑒定方法，從而對市售動物源性食品進行快速、準確、全面的監(jiān)測。

實時熒光PCR技術(real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-PCR)在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個反應進程的PCR技術，并可通過標準曲線對未知模板進行定性及定量分析[4]；具有特異性強、靈敏度高、準確性好、污染程度低和分析速度快等優(yōu)勢[1]。2013年，范麗麗[5]等用RT-PCR檢測食品中豬源性成分，得出各肉類中豬肉成分檢出限為1%。2015年，高曉麗等用RT-PCR檢測貓源性成分[6]，檢測靈敏度為100 fg。當前，RT-PCR被認為是肉類真實性鑒定中最有潛力的分子檢測工具。

面對國內肉類摻假事件日益嚴峻和輿論不斷重點關注的現(xiàn)狀，為更好地確保消費者的切身利益，貴州省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院參與CANS組織的豬牛源性成分測定，以提升貴州省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗的綜合檢測能力，為今后介入動物源性食品真實性成分鑒定、市售肉類食品摻假現(xiàn)狀調查和積累相關檢測科研數(shù)據(jù)等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品：試驗中所用的豬組織成分、牛組織成分由遼寧出入境提供(陰性、陽性為確定)。

試劑：基因組提取試劑盒(TaKaRa，AK501-1)、牛源性試劑盒(TaKaRa，A1501-1)，豬源性試劑盒(TaKaRa，A1401-1)等均購于TaKaRa(大連)公司，瓊脂糖(Agarose)、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等試劑均為國產(chǎn)。

儀器：移液器量程覆蓋0.1 ～104μL共5支(Eppendorf)、小型離心機(Labongene)、紫外分光光度計(Thermo)、RT-PCR儀(ABI Step One Plus)、電泳儀(Hofer)、凝膠成像儀(Bio-Rad)。

1.2 動物基因組DNA 提取

稱取西林瓶中動物組織粉末25～100 mg于1.5 mL的離心管中，按照基因組提取試劑盒說明書提取動物基因組DNA，以0.7%瓊脂糖在1×TAE buffer中5 V/cm電泳0.5 h后，利用凝膠成像系統(tǒng)檢測DNA純度及完整度，并用紫外分光光度計檢測其質量和濃度。

1.3 實時熒光PCR 反應體系與反應循環(huán)參數(shù)

1.3.1 反應體系 根據(jù)牛、豬源性試劑盒，熒光PCR反應體系為2×Premix for Bovine/Porcine 12.5 μL，Primer Mix for Bovine/Porcine 1 μL，Probe Mix for Bovine/Porcine 1 μL，樣品DNA(陰性對照用雙蒸水替代；空白對照用雙蒸水替代；陽性樣品用試劑盒自帶的control DNA for Bovine/Porcine替代樣品DNA。) 1 μL，加三蒸水補至25 μL。

1.3.2 反應程序 根據(jù)牛、豬源性試劑盒，熒光集團選擇FAM，猝滅集團選擇無，熒光PCR反應程序為第一步：95℃ 10 s，1 Cycles；第二步： 預變性95℃ 5 s，60 ℃退火 30 s，收集熒光信號，40 Cycles。

1.4 檢測結果的判斷

PCR反應結束后，將基線調整為3～15個循環(huán)的熒光信號(閾值線應超過陰性對照擴增曲線的最高點)，根據(jù)Ct值(循環(huán)閾值)及有無明顯擴增曲線判定結果。陰性對照：無Ct值，曲線為直線或輕微斜線，無S型擴增曲線；陽性對照：Ct≤35，呈S型擴增曲線。內參圖譜(HEX)用來檢驗熒光PCR儀及試劑的性能。

2 結果分析

2.1 牛、豬的基因組DNA

由圖1可知，提取的牛、豬基因組DNA電泳條帶遷移率低，條帶明亮整齊，溴酚藍前沒有明亮的熒光區(qū)，點樣孔內沒有亮點，表明提取的牛、豬基因組DNA純度較高，沒有蛋白質和RNA的污染或污染藥材水分含量在10.51%～11.23%，平均10.745%；總灰分含量為5.56%～7.95%，平均6.477%；酸不溶性灰分含量0.61%～0.79%，平均0.691%；醇溶性浸出物含量為16.12%～18.38%，平均值為17.557%。不同產(chǎn)地的相應含量存在一定的差異。

注：M，marker；1，豬基因組；2，?；蚪M。

Note：M，marker；1，genomic DNA of porcine；2，genomic DNA of bovine.

圖1 牛、豬基因組 DNA電泳結果

Fig.1 DNA electrophoresis pattern of bovine and porcine genome

2.2 牛及豬源性成分

由圖2可知，1) 牛源性成分的陰性對照、空白對照均有HEX擴增曲線，無Ct值，無FAM；陽性對照有FAM和HEX擴增曲線，Ct <28，樣品有FAM和HEX擴增曲線，Ct≤35，根據(jù)試劑盒說明判定牛源性成分為陽性。

2) 豬源性成的陰性對照、空白對照均有HEX擴增曲線，無Ct值，無FAM；陽性對照有FAM和HEX擴增曲線，Ct <28，樣品有FAM和HEX擴增曲線，Ct≤35，根據(jù)試劑盒說明判定豬源性成分為陽性。因驗證涉及貴州省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院的資質項目，因此空白對照一組中選擇雙蒸水代替其他動物成分，充分說明熒光PCR可以用于檢測豬、牛藥材水分含量在10.51%～11.23%，平均10.745%；總灰分含量為5.56%～7.95%，平均6.477%；酸不溶性灰分含量0.61%～0.79%，平均0.691%；醇溶性浸出物含量為16.12%～18.38%，平均值為17.557%。不同產(chǎn)地的相應含量存在一定的差異。

圖 2 牛、豬源性的熒光圖譜及內參圖譜

3 結論

試驗表明，實時熒光PCR測定豬及牛源性成分的結果為豬源性成分為陽性，牛源性成分為陽性，與遼寧出入境反饋結果一致，證明貴州省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院具備檢測動物源性成分的能力，檢測靈敏度為1%。對于提升貴州省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗的綜合檢測能力、滿足國家酒類及食品檢驗中心的建設需求具有重要意義，為今后動物源性食品真實性成分鑒定、市售肉類食品摻假現(xiàn)狀調查、積累相關檢測科研數(shù)據(jù)等奠定基礎。

[1] 高曉麗,楊昕霆,王 丹,等.實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中貓源性成分[J].食品科學,2014,35(24):235-238.

[2] 李 楠,王佳慧,沈 青,等.北京地區(qū)牛、羊肉片中鴨、雞、豬源性成分調查[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2014,26(3):227-232.

[3] 胡智愷,宋麗萍,姜 潔,等.實時定量PCR法對牛肉中雞源性成份的量化檢測[J].食品安全質量檢測學報,2015,6(2):550-554.

[4] 李家鵬,喬曉玲,田寒友,等.食品和飼料中動物源性成分檢測技術研究進展[J].食品科學,2011,32(9):340-347.

[5] 范麗麗,李 培,傅春玲,等.實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中豬源性成分[J].食品科學,2013,34(8):224-227.

[6] 高曉麗,楊昕霆,薛晨玉,等.實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中狗源性成分[J].食品工業(yè)科技,2015,36(2):61-64.

(責任編輯： 孫小嵐)

Bovine Derived Materials and Porcine Derived Materials Detecting with Real-time Fluorescence PCR

ZUO Zeyan， SUN Duanfang*

(QualitySupervisionandInspectionCenterofNationalLiquorandProcessedFoods,GuizhouProvinceProductQualitySupervisionandInspectionInstitute,Guiyang,Guizhou550016,China)

In order to rapidly detect adulterants in meat, ensure consumers’ vital interests, maintain a normal market order and enhance the detectability of Guizhou Province Product Quality Supervision and Inspection Institute, the bovine derived materials and porcine derives materials were detected by using real-time quantitative PCR. Results: Real-time quantitative PCR was suitable for detecting bovine derived materials and porcine derives materials with detection sensitivity of 1%; Detection efficiency and sensitivity were enhanced and false positive rate was decreased.

real-time quantitative PCR; animal-derived materials; bovine; pig; detection

2015-09-28； 2016-3-25修回

左澤彥(1985-)，男，工程師，碩士，從事食品檢測、動物源性和轉基因檢測研究。E-mail：zuozeyan2008@163.com

*通訊作者:孫端方(1987-)，男，高級工程師，博士，從事食品檢測研究。E-mail：340109925@qq.com

1001-3601(2016)04-0177-0130-03

S851.34+7.1/.7； TS207.3

A