李玉霞， 錢(qián)關(guān)澤， 李凡海， 劉廷磊， 劉蓮芬

(聊城大學(xué)， 山東 聊城 252059)

臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)致腐微生物的抑制效果

李玉霞， 錢(qián)關(guān)澤*， 李凡海， 劉廷磊， 劉蓮芬

(聊城大學(xué)， 山東 聊城 252059)

為臺(tái)灣林檎的深入研究及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定江西和浙江2個(gè)地區(qū)臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)黑曲霉菌、毛霉菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果。結(jié)果表明：除江西臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)毛霉菌沒(méi)有抑制效果外，2個(gè)地區(qū)臺(tái)灣林檎浸提液對(duì)其他致腐微生物均有抑制作用，其中浙江臺(tái)灣林檎葉片浸提液的抑菌效果最佳，對(duì)黑曲霉、毛霉菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制率分別為93.13%、62.4%、97.88%和100%；江西臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)這4種致腐微生物的抑制率分別為38.7%、-7.48%、99.94%和100%，對(duì)毛霉菌的菌絲生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。臺(tái)灣林檎浸提液具有抑菌防腐的效果，但在選擇臺(tái)灣林檎作為植物源天然防腐劑原料時(shí)應(yīng)注意其來(lái)源地，最好進(jìn)行試驗(yàn)確定其是否適合作為特定微生物防腐劑的原料。

臺(tái)灣林檎； 浸提液； 致腐微生物； 抑菌效果

臺(tái)灣林檎〔Malusdoumeri(Bois.)Chev.〕為薔薇科(Rosaceae)蘋(píng)果屬(Malus Mill.)落葉喬木[1]。其葉片含有多種物質(zhì)，如根皮酚、根皮酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、VC、VE、黃酮苷、黃酮類、多酚類、多元酚、甾醇、胡蘿卜苷、白楊素等[2-4]。其中黃酮、酚類、皂苷類等物質(zhì)具有抑菌、防腐和抗氧化等多種功效，可作為生產(chǎn)生物防腐劑的原料[3，5-6]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)其作為生物防腐劑及作用原理的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，筆者以浙江和江西2個(gè)地區(qū)臺(tái)灣林檎葉片浸提液為原料，研究其對(duì)黑曲霉菌、毛霉菌、大腸桿菌和金黃色葡萄桿菌等4種常見(jiàn)致腐微生物的抑制效果，以期為臺(tái)灣林檎的深入研究、開(kāi)發(fā)應(yīng)用和大面積種植提供理論依據(jù)，同時(shí)為其后期抑菌防腐效果和抑菌機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 臺(tái)灣林檎與菌種 臺(tái)灣林檎：采集于浙江龍泉昴山和江西井岡山。真菌：黑曲霉菌(Aspergillusniger)和毛霉菌(Mucor)，由發(fā)霉食物上分離純化獲得，保存于聊城大學(xué)生命科學(xué)院微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。細(xì)菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄桿菌(BacillusSubtilis)，來(lái)源于聊城大學(xué)生命科學(xué)院微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：葡萄糖、瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、殼聚糖、硝酸銀等。儀器：SW-CJ-IF型單人單面無(wú)菌超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱，金壇市科析儀器有限公司生產(chǎn)；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 臺(tái)灣林檎葉片浸提液的制備 分別稱取4 g江西和浙江的臺(tái)灣林檎葉片、日瓦海棠葉片粉碎物各2份，分別加入200 mL無(wú)菌水。其中，一份煮沸10 min，冷卻后定容至200 mL，靜置24 h后過(guò)濾，棄濾渣；另一份浸泡24 h后直接過(guò)濾，棄濾渣。分別保存濾液，備用。

1.2.2 殼聚糖-Ag溶液的制備 用有效成分含量為2%的乙酸溶液，配制殼聚糖-Ag溶液(殼聚糖∶硝酸銀為100∶1)備用。

1.2.3 培養(yǎng)基的制備 參照文獻(xiàn)[7-8]的方法，配制pH 7.4～7.6的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，121℃高壓濕熱滅菌20 min。參照文獻(xiàn)[9]的方法，配制PDA培養(yǎng)基，分裝后121℃高壓濕熱滅菌20 min。

1.2.4 培養(yǎng)基平板的制備 分別向滅菌后冷卻至50℃左右的24 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基中加入6 mL臺(tái)灣林檎葉片浸提液，充分混勻后分別倒入已滅菌的3個(gè)培養(yǎng)皿中，靜置使其冷卻備用。用防腐效果較好的日瓦海棠葉片浸提液和對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制效果較好的殼聚糖-Ag溶液替換臺(tái)灣林檎葉片浸提液作為陽(yáng)性對(duì)照，空白對(duì)照加入6 mL無(wú)菌水。

1.2.5 致腐微生物的分離與純化 選取無(wú)菌水處理后發(fā)霉的饅頭、米飯和餅干分別接種到含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，放入(25±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待真菌菌落出現(xiàn)后及時(shí)分離到無(wú)菌處理的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待菌落相對(duì)純凈后，參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行單胞分離純化處理，獲得純凈菌落，分別標(biāo)記后保存于4℃冰箱備用。

1.2.6 致腐微生物的鑒定 查看致腐微生物的菌落形態(tài)、顏色及生長(zhǎng)速率等；在電子顯微鏡下觀測(cè)致腐微生物的菌絲和孢子的形狀、長(zhǎng)短、大小、顏色和有無(wú)橫隔等形態(tài)，參照《真菌鑒定手冊(cè)》《普通真菌學(xué)》《中國(guó)真菌志》等文獻(xiàn)確定分離獲得的真菌種屬。

1.2.7 微生物接種及檢測(cè) 真菌接種參照文獻(xiàn)[10-11]的方法，將直徑為0.5 cm的菌餅，長(zhǎng)菌的一面朝向培養(yǎng)基，密封、標(biāo)記后置于(25±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，待菌落長(zhǎng)至合適大小時(shí)參照文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定菌落直徑并拍照。細(xì)菌接種采用劃線法，用接種環(huán)蘸取少量菌種，在培養(yǎng)皿上劃均勻細(xì)線，密封、標(biāo)記后置于(25±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，待菌落長(zhǎng)至合適時(shí)期觀測(cè)菌落數(shù)量并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、整理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)致腐真菌的抑制效果

從表1可知，不同處理對(duì)2種致腐真菌的抑制效果存在一定差異，浙江臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)黑曲霉的抑制率最高，達(dá)93.13%；殼聚糖-Ag溶液的抑制率次之，為42.17%。殼聚糖-Ag溶液對(duì)毛霉菌的抑制率最高，達(dá)68.32%；浙江臺(tái)灣林檎葉片浸提液的抑制率次之，為62.4%。江西臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)毛霉菌的抑制率為-7.48%，說(shuō)明該浸提液對(duì)菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；對(duì)黑曲霉菌的抑制效果也較差，抑制率僅38.7%。表明，毛霉菌對(duì)4種制劑的抵抗能力較強(qiáng)，在防治腐敗變質(zhì)時(shí)可采用其他方法或增加制劑濃度等達(dá)到預(yù)期效果；浙江臺(tái)灣林檎葉片浸提液抑制真菌生長(zhǎng)、預(yù)防發(fā)霉變質(zhì)的效果明顯，具有作為天然植物防腐劑的潛力。選擇江西臺(tái)灣林檎葉片浸提液作為天然植物防腐劑時(shí)最好進(jìn)行試驗(yàn)，以確定是否可作為特定微生物的防腐劑。

表1 不同處理對(duì)2種致腐真菌的抑制率

2.2 不同處理對(duì)致腐細(xì)菌的抑制效果

從表2看出，臺(tái)灣林檎葉片浸提液和殼聚糖-Ag溶液對(duì)2種致腐細(xì)菌的抑制效果較好，其中，浙江、江西臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)大腸桿菌的抑制率分別為97.88%和99.94%，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率均為100%；殼聚糖-Ag溶液對(duì)2種致腐細(xì)菌的抑制率均為100%。日瓦海棠葉片浸提液不能抑制2種致腐細(xì)菌的生長(zhǎng)，反而會(huì)促進(jìn)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，抑制率分別為-134.73%和-291.46%。臺(tái)灣林檎葉片浸提液和殼聚糖-Ag溶液對(duì)2種致腐細(xì)菌的抑制率差異較小，但均與日瓦海棠葉片浸提液的抑制率存在明顯差異。表明，浙江和江西2個(gè)地區(qū)的臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制功效相當(dāng)，并可完全滅殺金黃色葡萄球菌，臺(tái)灣林檎葉片浸提液在抑制致腐細(xì)菌生長(zhǎng)、預(yù)防發(fā)霉變質(zhì)方面效果明顯，具有作為天然植物防腐劑的潛力。

表2 不同處理對(duì)2種致腐細(xì)菌的抑制率

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，浙江、江西臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)黑曲霉的抑制率分別為93.13%和38.7%，對(duì)毛霉菌的抑制率分別為62.40%和-7.48%；對(duì)大腸桿菌的抑制率分別為97.88%和99.94%，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率均為100%。表明，除江西臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)對(duì)毛霉菌沒(méi)有抑制效果外，浙江、江西臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)其他真菌和細(xì)菌的抑制效果較好，對(duì)致腐細(xì)菌的抑制效果優(yōu)于致腐真菌，具有作為天然防腐劑的潛力。不同地區(qū)的臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)同一種微生物的抑制效果不同，同一地區(qū)臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)不同微生物的抑制效果也不同。原因可能是臺(tái)灣林檎葉片內(nèi)的一些物質(zhì)受到生長(zhǎng)環(huán)境條件影響，成分發(fā)生變化，因此在選擇臺(tái)灣林檎作為植物源天然防腐劑原料時(shí)應(yīng)注意其來(lái)源地，最好進(jìn)行試驗(yàn)確定其是否適合作為特定微生物的防腐劑原料。

鄧芳席等[13]研究表明，林檎葉浸出物對(duì)部分真菌和細(xì)菌有抑制作用，可顯著抑制金黃色葡萄球菌(BacillusSubtilis)、枯草桿菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(As.flavus)、青霉(PenicilliumSP)等致腐微生物的生長(zhǎng)，對(duì)豬肉、茄子和豆腐等食品具有一定的防腐效果；黃衛(wèi)文等[14]研究林檎葉提取物對(duì)小白鼠體內(nèi)的抑菌效果，結(jié)果表明，溫水浸出物和乙醇提取物具有顯著的抑菌效果，主要抗菌成分為有機(jī)酸、單寧、皂苷。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果相符合，但不同區(qū)域臺(tái)灣林檎浸提液的抑菌效果差異前人研究中未涉及，至于是否只是單純的生長(zhǎng)環(huán)境影響或不同生長(zhǎng)地區(qū)是否會(huì)造成其他影響，這些影響是否可以遺傳也有待進(jìn)一步研究。浙江和江西2個(gè)地區(qū)的臺(tái)灣林檎葉片浸提液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制功效相當(dāng)，但是否為同一種或一類物質(zhì)發(fā)生作用，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。在供試濃度下，2種浸提液可以完全滅殺金黃色葡萄球菌，對(duì)大腸桿菌的作用主要是抑制其生長(zhǎng)，不能完全殺滅，是否提升其供試濃度可完全殺滅，還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 馮 衛(wèi))

Inhibitory Effect ofMalusdoumeriLeaves’ Extract Liquid on Spoilage Microorganism

LI Yuxia, QIAN Guanze*, LI Fanhai, LIU Tinglei， LIU Lianfen

(LiaochengUniversity,Liaocheng,Shandong252059,China)

The inhibitory effect ofM.doumerileaves’ extract liquids from Jiangxi and Zhejiang Province onAspergilusniger,M.doumeri,EscherichiacoliandStaphylococcusaureuswas determined by the growth rate method to provide the theoretical basis for development and application ofM.doumeri. Results: Except that theM.doumerileaves’ extract liquid from Jiangxi Province has no inhibitory effect onMucormucedo,M.doumerileaves’ extract liquids from Jiangxi and Zhejiang Province have the inhibitory effect on other spoilage microorganism. TheM.doumerileaves’ extract liquid from Zhejiang Province has the better inhibitory effect. The inhibitory rate ofM.doumerileaves’ extract liquid from Zhejiang Province onAspergilusniger,Mucormucedo,EscherichiacoliandStaphylococcusaureusis 93.13%, 62.4%, 97.88% and 100% respectively. The inhibitory rate ofM.doumerileaves’ extract liquid from jiangxi Province onAspergilusniger,Mucormucedo,EscherichiacoliandStaphylococcusaureusis 38.7%, -7.48%, 99.94% and 100% separately and has the promotion effect on mycelial growth ofMucormucedo.The extract liquid ofM.doumerihas the bacteriostasis and antiseptic effect but the essential test should be conducted whenM.doumeriis selected as a raw material of natural botanical preservatives against the specific microorganism.

Malusdoumeri; extract liquid; spoilage microorganism; inhibitory effect

2016-03-16； 2016-03-31修回

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目“蘋(píng)果屬(薔薇科)植物雜交起源研究(31070619)”，“蘋(píng)果屬(薔薇科)植物分類修訂”(31170178)

李玉霞(1988-)，女，在讀碩士，研究方向：植物分類學(xué)。E-mail：1066211648@qq.com

*通訊作者：錢(qián)關(guān)澤(1965-)，男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事種子植物分類研究。E-mail：qianguanze@lcu.edu.cn

1001-3601(2016)05-0207-0081-03

S685.12

A