蔣素華， 王默霏， 宋彩霞， 梁 芳， 李艷輝， 崔 波*

(1.鄭州師范學(xué)院 生物工程研究所， 河南 鄭州 450044； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 鄭州 450002； 3.封丘縣農(nóng)業(yè)局， 河南 新鄉(xiāng) 453300)

萼脊蘭EF1α基因片段的克隆及序列分析

蔣素華1， 王默霏1， 宋彩霞2， 梁 芳1， 李艷輝3， 崔 波1*

(1.鄭州師范學(xué)院 生物工程研究所， 河南 鄭州 450044； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 鄭州 450002； 3.封丘縣農(nóng)業(yè)局， 河南 新鄉(xiāng) 453300)

為探明萼脊蘭EF1α基因在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生理功能和作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性及適用性，根據(jù)NCBI中植物翻譯延長(zhǎng)因子同源核苷酸保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以萼脊蘭葉片為試驗(yàn)材料，采用RNAprep多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA，利用RT-PCR技術(shù)克隆翻譯延伸因子EF1α，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：EF1α基因長(zhǎng)620 bp，編碼206 個(gè)氨基酸，編碼的蛋白為親水性蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為23.16 KD，等電點(diǎn)為8.50；經(jīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，α-螺旋占29.61%，延伸鏈占31.55%，無(wú)規(guī)則卷曲占38.83%；亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)；EF1α基因與朵麗蝶蘭雜交品種翻譯延伸因子蛋白的一致性較高，進(jìn)化距離最近。在GenBank登錄號(hào)為KT223116。

萼脊蘭；EF1α； 基因克隆； 二級(jí)結(jié)構(gòu)

在單子葉植物中，蘭科是第二大科。萼脊蘭(Sedireajaponica) 為蘭科(Orchidaceae)萼脊蘭屬(Sedirea)，萼脊蘭的花小而素雅，其花色典雅且具有迷人的芳香，觀賞期較長(zhǎng)，養(yǎng)護(hù)簡(jiǎn)單，且耐寒[1-2]。萼脊蘭的莖被宿存的葉鞘所包，葉片長(zhǎng)圓形、倒卵形或披針形，苞片為凹的寬卵形，淡褐色，花梗以及子房長(zhǎng)為18 mm左右；花香與橘子香相似，有萼片，花瓣橢圓形，細(xì)圓柱形的蕊柱，花期一般為6月[3-4]。

蛋白質(zhì)的生物合成是十分復(fù)雜又普遍的生命現(xiàn)象，蛋白質(zhì)合成分為起始階段、延伸階段和終止階段[5-6]。蛋白質(zhì)的生物合成需要許多生物大分子參與，如啟動(dòng)子、終止子、核糖體、氨酰合成酶、信使RNA、tRNA和延伸因子等[7]。植物蛋白質(zhì)合成延伸因子有EF1和EF2，其通過(guò)在核糖體上催化氨基酸鏈的延伸而推動(dòng)和控制蛋白質(zhì)的合成，在植物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8-10]。EF1α是主要的翻譯因子之一，調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，基因表達(dá)及調(diào)控非常保守，幾乎存在于每個(gè)細(xì)胞內(nèi)，僅次于肌動(dòng)蛋白，在真核生物體內(nèi)屬于數(shù)量較多的一類蛋白。目前，許多植物中都可以克隆得到EF1α，如油桐、油棕、玉米、擬南芥、蘋果、沙梨、碧桃、可可樹(shù)、中果咖啡、亞麻芥、金絲小棗、甘蔗、棉花、玫瑰和水稻等植物[11-13]。

在蛋白質(zhì)合成中起重要作用的延伸因子是一種多功能的蛋白因子[14-15]。其還與細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖速度有關(guān)，除參與翻譯控制[16]、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)性有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)[17]外，還可與細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合[18]，如細(xì)胞骨架和有絲分裂裝置等，與細(xì)胞骨架的結(jié)合可以顯著提高蛋白質(zhì)的翻譯[19-20]。但有研究發(fā)現(xiàn)，eEF1A在香蕉果實(shí)采摘后的不同時(shí)期以及在香蕉不同器官中的表達(dá)均有差異，即其在細(xì)胞中的表達(dá)并不是恒定不變，在不同的生理狀態(tài)下，不同細(xì)胞類型中都有差異[21]。因此，研究萼脊蘭的內(nèi)參基因顯得尤為重要。而在萼脊蘭相關(guān)基因的研究中，對(duì)萼脊蘭內(nèi)參基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者采用萼脊蘭葉片為材料，利用RT-PCR的方法，克隆萼脊蘭的EF1α基因序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為下一步萼脊蘭相關(guān)基因的表達(dá)分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

萼脊蘭由鄭州師范學(xué)院蘭花工程技術(shù)中心的智能日光溫室培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)試劑

氨芐青霉素、IPTG、X-Gal、DH5α感受態(tài)細(xì)胞和pMD19-T載體購(gòu)自TaKaRA公司，凝膠回收試劑盒和RNAprep多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根試劑公司，LB固體/液體培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)室保存配制試劑。

1.3 萼脊蘭EF1α基因的克隆

1.3.1 RNA的提取及檢測(cè) 將萼脊蘭葉片在液氮中研磨，用RNAprep多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取其總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性，采用Quawell Q5000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的A260/A280值和A260/A230值，同時(shí)測(cè)定其濃度。

1.3.2 cDNA的合成 反轉(zhuǎn)錄參照RevertAid TM First strand cDNA synthesis Kit說(shuō)明書合成第1鏈cDNA，并于-20℃保存。

1.3.3EF1α基因RT-PCR擴(kuò)增 以NCBI中已登錄的其他植物翻譯延伸因子同源DNA保守序列為參考，采用primer5.0設(shè)計(jì)1對(duì)克隆萼脊蘭EF1α基因的簡(jiǎn)并引物：EF1aF，5′-ACATCAACATYGTGGTCATTGG-3′；EF1aR，5′-GCCYTTGTACCA

GTCAAGGTTG-3′。將設(shè)計(jì)的引物送到上海英俊生物技術(shù)公司合成。以萼脊蘭cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.0 μL，dNTP(2.5 μmol/L)1.6 μL，MgCl2(25 μmol/L)1.5 μL，F(xiàn)、R引物(10 μmol/L)各1.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，模板cDNA1.0 μL，定量補(bǔ)足ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，58.5℃復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明回收。

1.3.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 取3 μL回收產(chǎn)物連接至pGEM-Teasy vector，構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有50 mg/L氨芐青霉素、IPTG和X-Gal的LB固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，藍(lán)白斑篩選重組子。

1.3.5 重組質(zhì)粒的鑒定和測(cè)序分析 挑取單克隆搖菌擴(kuò)增，進(jìn)行PCR鑒定，最后將陽(yáng)性單克隆送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。序列分析使用http://www.expasy.org和http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/在線分析軟件，序列的檢索使用GenBank的Blast(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)采用MEGA4.0 軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 萼脊蘭EF1α基因的RNA 完整性和基因克隆

由圖1可見(jiàn)，萼脊蘭總RNA溶液普通瓊脂糖凝膠電泳顯示，28S、18S和5S條帶清晰，28S條帶的亮度大約是18S的2倍，OD260/280為1.8～2.1，RNA濃度為407.59 ng/μL。表明，提取的總RNA完整性較好，能夠進(jìn)行下一步RT-PCR擴(kuò)增。由圖2可見(jiàn)，cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增得到620 bp左右的片段，將圖2目的條帶切膠回收、培養(yǎng)和擴(kuò)增，并電泳檢測(cè)，將檢測(cè)正確的單菌落測(cè)序，經(jīng)過(guò)BLAST分析，測(cè)序結(jié)果正確，證明EF1α基因克隆成功。

2.2 萼脊蘭EF1α基因的序列比較

該片段的核苷酸序列與其他植物EF1α基因的核苷酸序列的同源性均在80%～85%，與其他植物氨基酸序列同源性也均在99%以上，反映出該基因在進(jìn)化上較為保守，表明已克隆EF1α基因的部分cDNA序列，在NCBI上對(duì)EF1α編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)結(jié)果(圖3)顯示，該蛋白屬于延長(zhǎng)因子1-alpha(EF1-alpha)蛋白家族，ABC-ATPase超家族?？寺〉腅F1α基因在GenBank注冊(cè)后登錄號(hào)為KT223116。

圖 1 萼脊蘭EF1α基因的總RNA

Fig.1 Total RNA extracted from geneEF1αfromS.japonica

注：M, DNA Marker 2 000; 1～2, SeAP1-like基因。

Note: M, DNA Marker 2 000; 1～2, SeAP1-like gene.

圖 2 萼脊蘭EF1α基因克隆

Fig.2 Gene clone ofEF1αfromS.japonica

圖3 萼脊蘭EF1α 基因的功能域

2.3 萼脊蘭EF1α基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與二級(jí)結(jié)構(gòu)

EF1α編碼編碼蛋白的分子量為23.16 KD，其中含量最豐富的氨基酸為賴氨酸(Lys)21 個(gè)，約占10.2%，其次是異亮氨酸(Ile)20 個(gè)，約占9.7%。帶負(fù)電的氨基酸(Asp+Glu)總共27 個(gè)、帶正電荷(Arg+Lys)的氨基酸總共30 個(gè)，等電點(diǎn)為8.50。由圖4可見(jiàn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有4種形式組成，α-螺旋(Alpha helix)占29.61%，延伸鏈(Extended strand)占31.55%，無(wú)則卷曲(Random coil)占38.83%。

注：H, α-螺旋；e, 延伸鏈；c,無(wú)則卷曲。

Note: H, alpha helix; e, extended strand; c, random coil.

圖 4 萼脊蘭EF1α 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

Fig.4 Protein secondary structure analysis of EF1α fromS.japonica

圖 5 萼脊蘭 EF1α氨基酸序列的親水性

圖6 萼脊蘭EF1α 的進(jìn)化樹(shù)

2.4 萼脊蘭EF1α基因編碼蛋白質(zhì)的親水性/疏水性與亞細(xì)胞定位在http://web.expasy.org/protscale/對(duì)EF1α編碼的蛋白分析(圖5)發(fā)現(xiàn)，平均親水系數(shù)為-0.311，蛋白其編碼的氨基酸序列屬于親水蛋白。在http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/上對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)可能的位點(diǎn)在細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步說(shuō)明EF1α是翻譯延伸因子。

2.5 萼脊蘭EF1α基因的進(jìn)化樹(shù)如圖6所示，萼脊蘭EF1α所編碼的蛋白與朵麗蝶蘭雜交品種的蛋白同屬一個(gè)分支，進(jìn)化的同源性最高。

3 結(jié)論與討論

EF1α高度保守，分布廣泛，但并不是簡(jiǎn)單的內(nèi)參基因，還是一類具有多種生物學(xué)功能的重要調(diào)控蛋白，延伸因子參與蛋白合成、細(xì)胞調(diào)控和植物抗逆，研究延伸因子對(duì)植物發(fā)育和植物抗逆有重要意義，也為改良作物品質(zhì)、提高作物抗逆水平提供研究基礎(chǔ)。因此，對(duì)EF1α生物學(xué)功能的研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為植物生理過(guò)程的研究和生產(chǎn)應(yīng)用打開(kāi)新思維。筆者研究克隆了萼脊蘭的EF1α基因片段，與其他植物EF1α基因的核苷酸序列的同源性均在80%～85%，與其他植物氨基酸序列同源性也均在99%以上，反映出該基因在進(jìn)化上較為保守；蛋白質(zhì)分析該蛋白屬于延長(zhǎng)因子1-alpha(EF1-alpha)蛋白家族，ABC-ATPase超家族；屬于親疏水性蛋白，系統(tǒng)樹(shù)的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，萼脊蘭EF1α編碼的蛋白與朵麗蝶蘭雜交品種的蛋白同屬一個(gè)分支，進(jìn)化的同源性最高。

在很多植物中通過(guò)克隆得到延伸因子EF1α，如蘋果、碧桃、沙梨、玉米和水稻等[22-23]，由于延伸因子表達(dá)比較穩(wěn)定，近幾年在許多文獻(xiàn)中都有以EF1α作為植物重要的內(nèi)參基因，如香蕉延伸因子1A基因的分離及特征分析[24-25]，獨(dú)行菜Eef-1α基因片段分離克隆及RT-PCR分析[26]，本研究克隆并分析了EF1α基因，目的是研究其作為內(nèi)參基因在萼脊蘭不同組織中的表達(dá)量是否一致，若一致并表達(dá)穩(wěn)定，可將其列為看家基因。

本研究填補(bǔ)了萼脊蘭內(nèi)參基因的空白，增加了EF1α基因研究領(lǐng)域，內(nèi)參基因的表達(dá)在不同類型的細(xì)胞、組織中并不完全相同，在不同的試驗(yàn)條件下的表達(dá)也不相同，因此選擇合適的內(nèi)參基因顯得尤為重要，合適的內(nèi)參基因的選擇，需要不同細(xì)胞和組織在各種試驗(yàn)條件下進(jìn)行比較[27-28]。近年來(lái)，隨著RACE和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展與成熟，全長(zhǎng)功能基因被克隆與分析，基因相對(duì)表達(dá)量的研究也越來(lái)越受到關(guān)注，隨之內(nèi)參基因的研究也成為熱點(diǎn)研究對(duì)象，延伸因子EF1α是否能夠成為萼脊蘭生長(zhǎng)發(fā)育和生理過(guò)程的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，還需進(jìn)一步研究。

[1] 陳心啟,吉占和.中國(guó)蘭花全書[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1998:30-59.

[2] 盧思聰.中國(guó)蘭與洋蘭[M].北京:金盾出版社,1994:80-160.

[3] 陳心啟.中國(guó)野生蘭科植物彩色圖鑒[M].北京:科學(xué)出版社,1999:120-136.

[4] 麥 奮.蘭花育種其樂(lè)無(wú)窮[J].中國(guó)花卉園藝,2002(9):20-21.

[5] 程 君,芮耀誠(chéng).真核延長(zhǎng)因子eEFIA功能研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2012,30(2):89-91,124.

[6] 陳建中,戴 劍,章 鎮(zhèn),等.黃羽扇豆翻譯延伸因子2的序列分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)2002,35(1):102-105.

[7] 周 冰,曹 誠(chéng),劉 傳.翻譯延伸因子1A的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2007,18(2):281-284.

[8] 覃迎姿,黃先益,葉興枝,等.植物延伸因子eEFlA研究進(jìn)展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,40(5):472-477.

[9] 孫 偉,李 燕,趙彥修,等.鹽地堿蓬延伸因子(SsEF-α)的克隆與表達(dá)分析[J].西北植物學(xué)報(bào),2004,24(9):1657-1661.

[10] Wang A Q,Qin Y Z,Ye x z,et al. Molecular cloning and tissue specific expression of an elongation factor IA gene in sugarcane stalks[J].Sugar Tech,2008,10(2):119-123.

[11] 董曉麗,王加啟,卜登攀,等.內(nèi)參基因在實(shí)時(shí)定量PCR中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2006,36(9):83-85.

[12] Kavaliauskas D,Nissen P,Knudsen C R.The busiest of all ribosomal assistants:elongation factor Tu[J].Biochemistry,2012,51(13):2642-2651.

[13] Sasikumar A N,Perez W B,Kinzy T G. The many roles of the eukaryotic elongation factor 1 complex[J].Wiley Interdisciplinary Reviews:RNA,2012,3(4):543-555.

[14] Kim S,Coulombe P A.Emerging role for the cytoskeleton as an organizer and regulator of translation[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2010,11(1):75-81.

[15] Gross S R,Kinzy T G. Translation elongation factor 1A is essential for regulation of the actin cytoskeleton and cell morphology[J].Nature Structural and Molecular Biology,2005,12(9):772-778.

[16] Pittman Y R,Kandl K,Lewis M,et al.Coordination of eukaryotic translation elongation factor 1A(eEF1A)function in actin organization and translation elongation by the guanine nucleotide exchange factor eEF1Bα[J].Journal of Biological Chemistry,2009,284(7):4739-4747.

[17] Yue J,Shukla R,Accardi R,et al.Cutaneous human papillomavirus type 38 E7 regulates actin cytoskeleton structure for increasing cell proliferation through CK2and the eukaryotic elongation factor 1A[J].J Virol,2011,85(17):8477-8494.

[18] Li H T,Su Y P,Cheng T M,et al.The interaction between interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats-1 and eukaryotic elongation factor-1A[J]. Molecular and Cellular Biochemistry,2010,337(1/2):101-110.

[19] Chang R Y,Eugenia W.Mouse translation elongation factor eEF1A-2 interacts with Prdx- I to protect cells against apoptotic death induced by oxidative stress[J].Journal of Cellular Biochemistry,2007,100(2):267-278.

[20] Murthi A,Shaheen H H,Huang H Y,et al.Regulation of tRNA bidirectional nuclear-cytoplasmic trafficking in Saccharomyces cerevisiae[J].Molecular biology of the cell,2010,21(4):639-649.

[21] 趙麗娟,袁彬青,王秀珍,等.橡膠延伸因子REF基因的克隆、轉(zhuǎn)化及功能分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,21(1):144-150.

[22] 王志敏,牛 義,許俊強(qiáng),等.結(jié)球甘藍(lán)花粉蛋白延伸因子基因的克隆及其序列分析[J].園藝學(xué)報(bào),2013,40(10):1990-1998.

[23] 林淑芳,帥凌飛,袁 媛,等.黃芩延長(zhǎng)因子1a基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及其功能[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,57(20):126-128.

[24] 陳 燕,王偉倩,張紅莉,等.擬南芥翻譯延伸因子EF1A的亞細(xì)胞定位研究[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2015,43(1):106-109,115.

[25] 李 東,吳先軍,陳 新.熱脅迫下丹參迷迭香酸代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2012,26(1):60-67.

[26] Li Zh H,Pogany J,Panavas T,et al.Translation elongation factor 1A is a component of the tombusvirus replicase complex and affects the stability of the p33 replication co-factor[J].Virology,2009,385(1):245-260.

[27] 蘇慧慧,李 濤,黎振興,等.番茄GRX基因家族的鑒定及表達(dá)分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2015,29(4):663-673.

[28] 高 爽,查笑君,潘建偉.真核翻譯延伸因子eEF1A功能研究進(jìn)展[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2013,36(4):444-449.

(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Cloning and Sequence Analysis of GeneEF1αfromSedireajaponica

JIANG Suhua1, WANG Mofei1, SONG Caixia2, LIANG Fang1, LI Yanhui3, CUI Bo1*

(1.InstituteofBioengineering,ZhengzhouNormalCollege,Zhengzhou,Henan450044; 2.CollegeofLifeScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002; 3.FengqiuBureauofAgriculture,Xinxiang,Henan453300,China)

To explore geneEF1αin the process of growth and development, physiological functions and lay a foundation as internal genetic stability and applicability,EF1αofS.japonicawas cloned and sequence analyzed. According to the NCBI login plant translation elongation factor homologous conserved sequences of nucleotide primers to design degenerate primers,S.japonicaleaves as experimental materials, RNAprep pure plant kit was used to extract RNA, and use RT-PCR technology to clone the translation elongation factorEF1a. Through a series of bioinformatics analysis, the results showed that the gene sequence was 620 bp, encoding 206 amino acid residues, was a hydrophilic protein, molecular weight was 23.16 KD, isoelectric point was 8.50. Secondary structure analysis showed that the alpha helix occupied 29.61%, extended strand accounted for 31.55%, Random coil accounted for 38.83%. Subcellular located in cytoplasm. Protein sequence and phylogenetic analysis showed that it had high consistency and short evolutionary distance with theDoritaenopsishybrids of translation elongation factor protein. The authors registered them into GenBank (respective accession number: KT223116 ).

Sedireajaponica;EF1α; gene clone; secondary structure

2015-10-29； 2016-04-22修回

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目“蝴蝶蘭的分子育種”(092102110128)；鄭州市普通科技攻關(guān)項(xiàng)目“蝴蝶蘭新品種選育研究”(141PPTG G420)

蔣素華(1983-)，女，講師，碩士，從事花卉分子生物學(xué)研究。E-mail:jiangsuhua2006@163.com

*通訊作者：崔 波(1962-)，男，研究員，博士，從事花卉分子生物學(xué)研究。E-mail:laocuibo@163.com

1001-3601(2016)05-0189-0005-04

S685； Q789

A