萬(wàn) 強(qiáng)，劉中勇

·論著·

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

丹參酮ⅡA對(duì)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響研究

萬(wàn) 強(qiáng)，劉中勇

目的 探討丹參酮ⅡA對(duì)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2(LCN-2)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的保護(hù)作用及其與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系。方法 2015年3—5月將HUVEC分為不同濃度組：分別以0、5、10、20 μmol/L LCN-2作用HUVEC 48 h；不同作用時(shí)間組：分別以10 μmol/L LCN-2作用HUVEC 0、12、24、48 h；不同藥物干預(yù)組：對(duì)照組(未做任何處理)、LCN-2組(LCN-2 10 μmol/L刺激48 h)、LCN-2+丹參酮ⅡA組(10 μmol/L丹參酮ⅡA預(yù)處理HUVEC 1 h后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h)、LCN-2+PD98059組〔PD98059(終濃度20 μmol/L)預(yù)處理HUVEC 30 min后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h〕。采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞增殖〔吸光度(A值)〕，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)上清液中白介素6(IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)表達(dá)水平，Western blotting法檢測(cè)HUVEC中B淋巴細(xì)胞癌2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)表達(dá)水平。結(jié)果 與0 μmol/L組和5 μmol/L組比較，10 μmol/L組、20 μmol/L組A值、Bcl-2表達(dá)水平下降，細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達(dá)水平升高(P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L組IL-6、MCP-1表達(dá)水平升高(P<0.05)。與0 h組比較，24 h組MCP-1表達(dá)水平升高(P<0.05)；與0 h組和24 h組比較，48 h組、72 h組A值、Bcl-2表達(dá)水平下降，細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達(dá)水平升高(P<0.05)；與48 h組比較，72 h組IL-6表達(dá)水平升高，Bcl-2、p-ERK1/2表達(dá)水平下降(P<0.05)。與對(duì)照組比較，LCN-2組、LCN-2+丹參酮ⅡA組、LCN-2+PD98059組A值、Bcl-2表達(dá)水平下降，細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax表達(dá)水平升高，LCN-2組及LCN-2+丹參酮ⅡA組p-ERK1/2表達(dá)水平升高(P<0.05)；與LCN-2組比較，LCN-2+丹參酮ⅡA組、LCN-2+PD98059組A值、Bcl-2表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達(dá)水平下降(P<0.05)；與LCN-2+丹參酮ⅡA組比較，LCN-2+PD98059組A值、p-ERK1/2表達(dá)水平下降，細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax表達(dá)水平升高(P<0.05)。結(jié)論 丹參酮ⅡA可通過(guò)抑制ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減輕LCN-2誘導(dǎo)的HUVEC損傷。

丹參酮ⅡA；脂籠蛋白質(zhì)類；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)MAP激酶類；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

萬(wàn)強(qiáng)，劉中勇.丹參酮ⅡA對(duì)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(9)：1086-1090.[www.chinagp.net]

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脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2(lipocalin-2，LCN-2)又名中性粒細(xì)胞明膠酶脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)，是一種新型脂肪細(xì)胞因子。內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)進(jìn)程的起始階段[1]。研究表明,LCN-2可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷從而促進(jìn)AS形成[2]。丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)為唇形科植物丹參的主要脂溶性成分，研究表明,丹參酮ⅡA可從多種途徑發(fā)揮抗AS效應(yīng)[3]，但其機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為模型，加用丹參酮ⅡA及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性阻滯劑PD98059，觀察丹參酮ⅡA對(duì)LCN-2誘導(dǎo)HUVEC損傷的影響，并探討其抗AS機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 2015年3—5月，HUVEC購(gòu)于Cascade Biologics公司，丹參酮ⅡA(純度≥98%)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，LCN-2購(gòu)于美國(guó)Acrobiosystems公司，PD98059購(gòu)于美國(guó)Tocris Bioscience公司，Annexin V-FITC試劑盒購(gòu)于美國(guó)Bio Vision公司，白介素6(IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司，B淋巴細(xì)胞癌2(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signal Technology公司。

1.2 主要儀器 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、低溫高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，全自動(dòng)生化儀購(gòu)于美國(guó)Beckman公司，熒光倒置顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)ACEA Biosciences公司，電泳儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞分組及處理 將HUVEC分為不同濃度組：分別以0、5、10、20 μmol/L LCN-2作用HUVEC 48 h[4]。不同作用時(shí)間組：分別以10 μmol/L LCN-2作用HUVEC 0、12、24、48 h。不同藥物干預(yù)組：(1)對(duì)照組(未做任何處理)；(2)LCN-2組：LCN-2 10 μmol/L刺激48 h；(3)LCN-2+丹參酮ⅡA組：10 μmol/L丹參酮ⅡA[5]預(yù)處理HUVEC 1 h后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h；(4)LCN-2+PD98059組：PD98059(終濃度20 μmol/L[5])預(yù)處理HUVEC 30 min后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h。

1.3.2 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞增殖 HUVEC以1×104/孔接種于96孔板，24 h后撤去血清，分組見(jiàn)1.3.1，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。干預(yù)完成后以20 μl MTT (5 g/L)37 ℃孵育4 h，每孔加DMSO 150 μl低速振蕩10 min使結(jié)晶物溶解，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm處吸光度(A值)。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 HUVEC以2×105/孔接種于12孔板，24 h后換無(wú)血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，分組見(jiàn)1.3.1，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。收集細(xì)胞，加Annexin V-FITC及碘化丙啶(PI)雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)IL-6、MCP-1表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC以1×105/ml接種于培養(yǎng)皿，分組見(jiàn)1.3.1，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。收集上清液，ELISA法檢測(cè)上清液中IL-6、MCP-1表達(dá)水平，操作步驟參照說(shuō)明書(shū)。

1.3.5 Western blotting法檢測(cè)Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表達(dá)水平 分組見(jiàn)1.3.1，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，提取HUVEC總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔取上清液20 μl加上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min。凝膠電泳轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜，二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，ECL系統(tǒng)顯色，以β-actin為內(nèi)參，采用Image Tool 3.0進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度及不同作用時(shí)間LCN-2對(duì)HUVEC的作用 不同濃度組A值、細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中與0 μmol/L組和5 μmol/L組比較，10 μmol/L組、20 μmol/L組A值、Bcl-2表達(dá)水平下降，細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L組IL-6、MCP-1表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1、圖1)。

不同作用時(shí)間組A值、細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中與0 h組比較，24 h組MCP-1表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與0 h組和24 h組比較，48 h組、72 h組A值、Bcl-2表達(dá)水平下降，細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與48 h組比較，72 h組IL-6表達(dá)水平升高，Bcl-2、p-ERK1/2表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2、圖2)。

2.2 不同藥物干預(yù)對(duì)HUVEC的作用 不同藥物干預(yù)組A值、細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中與對(duì)照組比較，LCN-2組、LCN-2+丹參酮ⅡA組、LCN-2+PD98059組A值、Bcl-2表達(dá)水平下降，細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax表達(dá)水平升高，LCN-2組和LCN-2+丹參酮ⅡA組p-ERK1/2表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LCN-2組比較，LCN-2+丹參酮ⅡA組、LCN-2+PD98059組A值、Bcl-2表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LCN-2+丹參酮ⅡA組比較，LCN-2+PD98059組A值、p-ERE1/2表達(dá)水平下降，細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3、圖3)。

表1 不同濃度組A值、細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、p-ERK1/2、Bax表達(dá)水平比較

注：A值=吸光度，IL-6=白介素6，MCP-1=單核細(xì)胞趨化蛋白1，Bcl-2=B淋巴細(xì)胞癌2，Bax=Bcl-2相關(guān)X蛋白，p-ERK1/2=磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2；與0 μmol/L組比較，aP<0.05；與5 μmol/L組比較，bP<0.05；與10 μmol/L組比較，cP<0.05

表2 不同作用時(shí)間組A值、細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、p-ERK1/2、Bax表達(dá)水平比較

注：與0 h組比較，aP<0.05；與24 h組比較，bP<0.05；與48 h組比較，cP<0.05

表3 不同藥物干預(yù)組A值、細(xì)胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、p-ERK1/2、Bax表達(dá)水平比較

注：LCN-2=脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與LCN-2組比較，bP<0.05；與LCN-2+丹參酮ⅡA組比較，cP<0.05

注：p-ERK1/2=磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2，Bax=Bcl-2相關(guān)X蛋白，Bcl-2=B淋巴細(xì)胞癌2

圖1 Western blotting法檢測(cè)不同濃度組Bcl-2、Bax、p-ERK1/2的表達(dá)水平

Figure 1 Levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 expression among different concentration groups detected by Western blotting

圖2 Western blotting法檢測(cè)不同作用時(shí)間組Bcl-2、Bax、p-ERK1/2的表達(dá)水平

Figure 2 Levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 expression among different time groups detected by Western blotting

注：LCN-2=脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2

圖3 Western blotting法檢測(cè)不同藥物干預(yù)組Bcl-2、Bax、p-ERK1/2的表達(dá)水平

Figure 3 Levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 expression among different drugintervention groups detected by Western blotting

3 討論

LCN-2于中性粒細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)并分離，是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的2號(hào)成員，相對(duì)分子量約25 kDa，廣泛分布于腎臟、肺臟、肝臟及小腸等多種組織器官中，具有多種生物學(xué)功能，在細(xì)胞的增殖與凋亡及炎性反應(yīng)過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用[6]。既往對(duì)LCN-2的研究主要集中在腎臟病、感染性疾病及腫瘤等方面，近年來(lái)研究表明，LCN-2可作為心血管疾病生物標(biāo)志物，獨(dú)立預(yù)測(cè)心血管事件的發(fā)生[7]。AS患者血清LCN-2水平顯著升高，且與AS嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[8]，LCN-2水平在AS患者不穩(wěn)定粥樣斑塊中亦升高[9]，均提示LCN-2與AS形成密切相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后釋放的炎性因子可致單核細(xì)胞黏附遷移、中膜平滑肌細(xì)胞增生、泡沫細(xì)胞堆積形成脂質(zhì)斑塊，最終促進(jìn)AS形成[1]。IL-6及MCP-1在AS慢性炎癥中扮演重要角色，對(duì)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞的遷移和激活起調(diào)控作用，并能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖，參與AS形成過(guò)程[10]。Bcl-2基因家族蛋白中的促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的比例對(duì)細(xì)胞凋亡起直接調(diào)控作用[11]。Bax可通過(guò)與細(xì)胞外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel，VDAC)或細(xì)胞內(nèi)膜的腺苷轉(zhuǎn)位因子(adenine nucleotide translocator，ANT)的結(jié)合，介導(dǎo)線粒體膜上的膜通透性孔道的開(kāi)放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2可通過(guò)與Bax競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ANT，或直接阻止Bax與VDAC、ANT結(jié)合以發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)[12]。本研究結(jié)果顯示，LCN-2可抑制HUVEC增殖、上調(diào)HUVEC內(nèi)Bax/Bcl-2比例，以促進(jìn)HUVEC凋亡、誘導(dǎo)分泌IL-6及MCP-1等從而加重HUVEC損傷。

ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)家族分支之一，ERK1/2可通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)磷酸化將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控HUVEC的多種基因轉(zhuǎn)錄，在構(gòu)建細(xì)胞骨架、維持細(xì)胞形態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)進(jìn)程中起重要作用[13]，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可通過(guò)促進(jìn)VSMC增殖、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等促進(jìn)AS形成[14]。既往研究證實(shí)，p-ERK1/2參與了HUVEC中炎性因子表達(dá)的調(diào)控[15]。本研究結(jié)果顯示，LCN-2可呈濃度及作用時(shí)間依賴性誘導(dǎo)HUVEC中p-ERK1/2表達(dá)水平的增加，并誘導(dǎo)分泌炎性因子IL-6及MCP-1，加重HUVEC損傷，提示LCN-2對(duì)HUVEC的損傷作用可能與激活ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

丹參酮ⅡA能通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗炎、調(diào)節(jié)血脂、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等多種途徑發(fā)揮抗AS效應(yīng)[3，16-17]。研究表明，丹參酮ⅡA的抗AS機(jī)制與抑制ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)，丹參酮ⅡA可通過(guò)抑制ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)c-fos表達(dá)水平，顯著抑制頸動(dòng)脈球囊損傷大鼠VSMC增殖并減少血管內(nèi)膜增生，從而延緩AS進(jìn)程[18]。但丹參酮ⅡA是否可通過(guò)抑制ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減輕LCN-2誘導(dǎo)的HUVEC損傷而抗AS尚不清楚。本研究結(jié)果證實(shí)，丹參酮ⅡA及PD98059均可顯著降低HUVEC中p-ERK1/2表達(dá)水平、減輕LCN-2誘導(dǎo)的HUVEC增殖抑制、下調(diào)Bax/Bcl-2比例以抑制HUVEC凋亡、降低IL-6及MCP-1表達(dá)水平，提示丹參酮ⅡA的抗AS機(jī)制可能通過(guò)抑制ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減輕LCN-2誘導(dǎo)的HUVEC損傷得以實(shí)現(xiàn)，此發(fā)現(xiàn)有望為丹參酮ⅡA在AS防治中的應(yīng)用提供新依據(jù)。丹參酮ⅡA對(duì)LCN-2抑制HUVEC增殖、誘導(dǎo)HUVEC凋亡、促進(jìn)分泌IL-6及MCP-1、調(diào)節(jié)Bax表達(dá)水平的作用強(qiáng)于PD98059，這可能是HUVEC內(nèi)存在其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且各信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間相互作用的結(jié)果。丹參酮ⅡA可能也通過(guò)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了減輕LCN-2誘導(dǎo)的HUVEC損傷過(guò)程。丹參酮ⅡA的抗AS作用機(jī)制和臨床應(yīng)用仍需大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)研究加以明確。

作者貢獻(xiàn)：萬(wàn)強(qiáng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集、撰寫(xiě)論文、成文、進(jìn)行質(zhì)量控制及審校；劉中勇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、并對(duì)文章負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Effect of Tanshinone ⅡA on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Injury Induced by Lipocalin-2

WANQiang，LIUZhong-yong.DepartmentofMedicalCardiology，AffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330006，China

Objective To investigate the protective effect of tanshinone ⅡA on human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) injury induced by lipocalin-2 (LCN-2) and its relation with ERK1/2 signal transduction pathway.Methods From March to May in 2015,HUVEC were divided into different concentration groups:(0,5,10 and 20 μmol/L LCN-2 for 48 h),different time groups:(10 μmol/L LCN-2 for 0,12,24 and 48 h) and different drug intervention groups:control group,LCN-2 group (10 μmol/L LCN-2 for 48 h),LCN-2+tanshinone ⅡA group (10 μmol/L tanshinone ⅡA for 1 h then 10 μmol/L LCN-2 for 48 h) and LCN-2+PD98059 group (20 μmol/L PD98059 for 30 min then 10 μmol/L LCN-2 for 48 h).MTT assay was used to detect cell proliferation and flow cytometry was used to detect cell apoptosis;the levels of interleukin-6(IL-6) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) were determined by enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA),and the levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 in HUVEC were determined by Western blotting.Results Compared with 0 μmol/L group and 5 μmol/L gruop,10 μmol/L group and 20 μmol/L group were significantly lower in A value and the level of Bcl-2 but were significantly higher in apoptosis rate,the levels of IL-6,MCP-1,Bax and p-ERK1/2(P<0.05).Compared 10 μmol/L group,20 μmol/L group was higher in the levels of IL-6 and MCP-1 (P<0.05).Compared with 0 h group,24 h group was higher in the level of MCP-1 (P<0.05).Compared with 0 h group and 24 h group,48 h group and 72 h group were lower in A value and the level of Bcl-2 but were higher in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bax and p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with 48 h group,72 h group was higher in the level of IL-6 but was lower in the levels of Bcl-2 and p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with control group,LCN-2 group,LCN-2+tanshinone ⅡA group and LCN-2+PD98059 group were lower in A value and the level of Bcl-2 but were higher in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bax and LCN-2 group,LCN-2+tanshinone ⅡA group were higher in the level of p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with LCN-2 group,LCN-2+tanshinone ⅡA group and LCN-2+PD98059 group were higher in A value and the level of Bcl-2 but were lower in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bax and p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with LCN-2+tanshinone ⅡA group,LCN-2+PD98059 group was lower in A value and the level of p-ERK1/2 but was higher in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bcl-2 and Bax(P<0.05).Conclusion Tanshinone ⅡA attenuates HUVEC injury induced by LCN-2 and its mechanism may be related to the inhibition of ERK1/2 signal transduction pathway.

Tanshinone ⅡA；Lipocalins；Extracellular signal-regulated MAP kinases；Human umbilical vein endothelial cells

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460680)；江西省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(20135BBG70002)

330006 江西省南昌市，江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心血管病科

劉中勇，330006 江西省南昌市，江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心血管病科；E-mail：liuzhongyong2014@163.com

R 363

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.021

2015-06-14；

2016-01-12)