盛沖霄，黎紅華，崔 敏，汪志忠，李 敏

·論著 ·

糖尿病與氧化應激在頸動脈粥樣硬化大鼠內皮功能障礙中的作用研究

盛沖霄，黎紅華，崔 敏，汪志忠，李 敏

目的 探討糖尿病與氧化應激在頸動脈粥樣硬化(CAS)大鼠內皮功能障礙中的作用。方法 2014年6—10月選取SPF級健康雄性Wistar大鼠30只，采用隨機數字表法分為對照組、CAS組、糖尿病CAS組，每組10只。CAS組、糖尿病CAS組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)結合維生素D3注射液60萬U/kg一次性腹腔注射建立CAS模型。糖尿病CAS組大鼠第5周時給予鏈脲佐菌素(STZ)45 mg/kg腹腔注射建立糖尿病模型。對照組大鼠給予基礎飼料喂養(yǎng)結合0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。15周后處死大鼠，分離頸動脈，截取約3 mm新鮮頸動脈環(huán)，HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)中加入不同濃度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)乙酰膽堿，記錄頸動脈環(huán)張力(最大舒張度)。蘇木素-伊紅(HE)染色觀察頸動脈組織，免疫組織化學SP法染色并檢測頸動脈親環(huán)素A(CyPA)、Kruppel樣轉錄因子2(KLF2)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)平均光密度。結果 HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)中加入不同濃度乙酰膽堿后各組大鼠頸動脈環(huán)均出現(xiàn)舒張反應。CAS組、糖尿病CAS組大鼠10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L乙酰膽堿頸動脈環(huán)張力較對照組降低(P<0.05)；糖尿病CAS組大鼠10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L乙酰膽堿頸動脈環(huán)張力較CAS組降低(P<0.05)。HE染色示對照組大鼠頸動脈內膜完整光滑，內皮細胞以及平滑肌細胞排列整齊，無增生；彈性纖維連續(xù)無中斷。CAS組、糖尿病CAS組大鼠頸動脈可見內膜斷裂，中層鈣化斑塊形成，彈性層失去連續(xù)性。CAS組、糖尿病CAS組大鼠頸動脈CyPA平均光密度較對照組升高，KLF2、eNOS平均光密度較對照組降低(P<0.05)；糖尿病CAS組大鼠頸動脈CyPA平均光密度較CAS組升高，KLF2平均光密度較CAS組降低(P<0.05)。結論 糖尿病與氧化應激參與了CAS大鼠內皮功能功能障礙的形成，其機制可能與CyPA表達水平增加有關。

頸動脈疾??；糖尿??；氧化應激；內皮功能障礙；親環(huán)素A

盛沖霄，黎紅華，崔敏，等.糖尿病與氧化應激在頸動脈粥樣硬化大鼠內皮功能障礙中的作用研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(9)：1015-1020.[www.chinagp.net]

Sheng CX，Li HH,Cui M,et al.Impact of diabetes and oxidative stress on endothelial dysfunction of carotid atherosclerosis rats[J].Chinese General Practice，2016，19(9)：1015-1020.

據報道，20%～30%的缺血性腦卒中與頸動脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis，CAS)血管狹窄相關[1]。糖尿病作為CAS的重要危險因素，其導致CAS的機制一直是研究的熱點。目前研究證實,高血糖與氧化應激相互作用參與了CAS的發(fā)生發(fā)展[2]。而內皮功能障礙是動脈粥樣硬化(AS)的起始環(huán)節(jié)。氧化應激是指機體氧化與抗氧化能力失衡，活性氧(reactive oxygen species，ROS)在體內蓄積導致組織細胞損傷的病理過程[3]。氧化應激貫穿了糖尿病AS過程的始終[2]。親環(huán)素A(cyclophilin A，CyPA)被認為是重要的氧化應激誘導因子，可在氧化應激刺激下由內皮細胞、血管平滑肌細胞分泌[4]。有研究證實了急性冠脈綜合征(acute coronary syndromes,ACS)患者血清CyPA水平明顯高于穩(wěn)定性心絞痛和正常對照組患者[5]。本研究通過觀察糖尿病CAS大鼠頸動脈內皮依賴性舒張功能以及頸動脈CyPA、Kruppel樣轉錄因子2(Kruppel-like factor 2,KLF2)、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達，探討糖尿病與氧化應激在CAS大鼠內皮功能障礙中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 2014年6—10月選取SPF級健康雄性Wistar大鼠30只，6周齡，體質量180～200 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，分籠飼養(yǎng)在武漢大學動物實驗中心SPF環(huán)境中，室內溫度(22±1)℃,濕度(60±10)%,自由進食水,光照12 h明暗交替。

1.1.2 主要實驗藥劑 維生素D3注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號：20121002)；膽固醇、膽酸鈉(武漢凱潤成生物工程有限公司)；兔抗CyPA、KLF2、eNOS抗體(北京索萊寶生物科技有限公司)；免疫組織化學SP試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(北京索萊寶生物科技有限公司，批號：S0130)；基礎飼料由武漢大學動物實驗中心提供，高脂飼料(81.3%普通飼料、5.0%蔗糖、10.0%豬油、3.0%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶)由武漢市萬千佳興生物科技有限公司加工。

1.1.3 主要儀器 BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)、HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)、JH-2型張力換能器(成都泰盟科技有限公司)，YB-6型生物組織包埋機(湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術研究所)，RM2016型Leica石蠟切片機(德國Leica公司)，OLYMPUS BX51照相顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 分組 所有大鼠經適應性喂養(yǎng)3 d后采用隨機數字表法分為3組，對照組10只、CAS組10只、糖尿病CAS組10只。3組大鼠體質量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 3組大鼠體質量比較

注：CAS=頸動脈粥樣硬化

1.3 造模方法 CAS造模方法參考文獻[6]，CAS組、糖尿病CAS組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)結合維生素D3注射液60萬U/kg一次性腹腔注射。糖尿病造模參考文獻[7]，糖尿病CAS組大鼠在CAS造模基礎上，第5周禁食水12 h后給予1%STZ溶液45 mg/kg(以0.1 mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制成1%STZ溶液)一次性腹腔注射，在腹腔注射72 h以及10 d后剪尾測血糖，空腹血糖均≥16.7 mmol/L，提示造模成功。CAS組大鼠第5周禁食水12 h后給予等量0.9%氯化鈉溶液一次性腹腔注射。對照組大鼠給予基礎飼料喂養(yǎng)結合等量0.9%氯化鈉溶液一次性腹腔注射，第5周禁食水12 h后給予等量0.9%氯化鈉溶液一次性腹腔注射。

1.4 取材 15周后過量水合氯醛麻醉處死大鼠，快速分離雙側頸動脈，剔除周圍組織。

1.5 頸動脈環(huán)張力測定 每條頸動脈截取約3 mm頸動脈環(huán)連接到JH-2型張力換能器，置于含Krebs液的HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)，給予2×g張力負荷，通入95%O2和5%CO2的混合氣體，在37 ℃水浴中平衡1 h。以10-6mol/L去甲腎上腺素預刺激頸動脈環(huán)，張力達到平衡后加入不同濃度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)乙酰膽堿,記錄每一濃度下頸動脈環(huán)張力(最大舒張度),繪制濃度反應曲線。

1.6 蘇木素-伊紅(HE)染色 新鮮頸動脈以4%多聚甲醛固定48 h后，行石蠟包埋，切片(橫切，片厚2 μm)，按照HE染色步驟染色，置于400倍光鏡下觀察并攝片。

1.7 免疫組織化學SP法染色與數據采集 石蠟切片按照免疫組織化學SP法步驟進行染色。每張切片隨機抽取3個不同的400倍視野。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對免疫組織化學結果進行分析，測定CyPA、KLF2、eNOS平均光密度(平均光密度=累積光密度/測量區(qū)域面積)。

2 結果

2.1 頸動脈環(huán)張力 HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)中加入不同濃度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)乙酰膽堿后各組大鼠頸動脈環(huán)均出現(xiàn)舒張反應。3組大鼠不同濃度乙酰膽堿頸動脈環(huán)張力比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中CAS組、糖尿病CAS組大鼠10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L乙酰膽堿頸動脈環(huán)張力較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；糖尿病CAS組大鼠10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L乙酰膽堿頸動脈環(huán)張力較CAS組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2、圖1)。

2.2 HE染色結果 光鏡下，對照組大鼠頸動脈內膜完整光滑，內皮細胞以及平滑肌細胞排列整齊、無增生，彈性纖維連續(xù)無中斷(見圖2A，本文圖2～5彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。CAS組、糖尿病CAS組大鼠頸動脈可見內膜斷裂，中層鈣化斑塊形成，彈性層失去連續(xù)性(見圖2B、2C)。

注：CAS=頸動脈粥樣硬化

圖1 3組大鼠不同濃度乙酰膽堿頸動脈環(huán)張力

Figure 1 Carotid artery ring tension of the three groups when given different concentrations of acetylcholine

2.3 頸動脈免疫組織化學SP法染色及CyPA、KLF2、eNOS平均光密度 光鏡下觀察3組大鼠頸動脈CyPA、KLF2、eNOS免疫組織化學SP法染色，可見其在各組大鼠頸動脈均有不同程度的表達(見圖3～5)。3組大鼠頸動脈CyPA、KLF2、eNOS平均光密度比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中CAS組、糖尿病CAS組大鼠頸動脈CyPA平均光密度較對照組升高，KLF2、eNOS平均光密度較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；糖尿病CAS組大鼠頸動脈CyPA平均光密度較CAS組升高，KLF2平均光密度較CAS組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

Table 3 Comparison of the average optical density of CyPA,KLF2 and eNOS among the three groups

組別只數CyPAKLF2eNOS對照組1000035±0001100932±0033100358±00185CAS組1001096±00199a00205±00052a00045±00013a糖尿病CAS組1001243±00258ab00011±00003ab00013±00006aF值684052745849P值<001<001<001

注：CyPA=親環(huán)素A，KLF2=Kruppel樣轉錄因子2，eNOS=內皮型一氧化氮合酶；與對照組比較，aP<0.05；與CAS組比較，bP<0.05

表2 3組大鼠不同濃度乙酰膽堿頸動脈環(huán)張力比較±s，%)

注：與對照組比較，aP<0.05；與CAS組比較，bP<0.05

注：A為對照組，B為CAS組，C為糖尿病CAS組

圖2 3組大鼠頸動脈切片(HE染色，×400)

Figure 2 Carotid artery sections of the three groups

注：A為對照組，B為CAS組，C為糖尿病CAS組

圖3 3組大鼠頸動脈CyPA免疫組織化學SP法染色結果(×400)

Figure 3 Immunohistochemistry SP method staining results of CyPA of the three groups

注：A為對照組，B為CAS組，C為糖尿病CAS組

圖4 3組大鼠頸動脈KLF2免疫組織化學SP法染色結果(×400)

Figure 4 Immunohistochemistry SP method staining results of KLF2 of the three groups

注：A為對照組，B為CAS組，C為糖尿病CAS組

圖5 3組大鼠頸動脈eNOS免疫組織化學SP法染色結果(×400)

Figure 5 Immunohistochemistry SP method staining results of eNOS of the three groups

3 討論

目前國內外對于CyPA的研究主要集中于其與氧化應激之間的關系，而對于CyPA導致內皮功能障礙的可能途徑及高血糖對其產生的影響尚未見報道，本研究探討了 CyPA與其下游信號分子KLF2、eNOS在CAS形成過程中的可能途徑，研究了糖尿病對CAS以及CyPA的影響，在國內同類研究中有其創(chuàng)新之處。

Brownlee[8]提出糖尿病統(tǒng)一機制學說：氧化應激由始至終貫穿于糖尿病的發(fā)病過程，也是糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機制的共同基礎。Paneni等[9]指出，高血糖觸發(fā)的ROS積聚，與血管舒張因子一氧化氮(nitric oxide，NO)之間的失衡是引起內皮功能障礙的關鍵。內皮功能障礙是AS的起始環(huán)節(jié)。

CyPA屬于親免蛋白家族，在細胞內信號傳導、蛋白活性的調節(jié)等方面具有重要作用。除了其細胞內功能，CyPA作為一種氧化應激誘導因子，在心血管疾病中具有生理以及病理作用，成為心血管疾病的一種潛在的生物標志物以及中介產物，如血管狹窄以及腹主動脈瘤[10]。在ROS的刺激下，內皮細胞以及血管平滑肌細胞分泌CyPA，分泌的細胞外CyPA又可刺激血管平滑肌細胞中細胞外信號調節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、Akt和JAK等信號轉導通路,進一步參與ROS產物的生成[10]。細胞內外的CyPA通過促進內皮細胞凋亡、內皮細胞表達白細胞黏附分子及血管平滑肌細胞增殖等機制參與AS的發(fā)生發(fā)展[10]。糖尿病以代謝紊亂為特征，在糖尿病中，高血糖以及升高的ROS促進單核細胞通過囊泡的形式分泌CyPA，而CyPA是糖尿病血管病變一個潛在的篩選標志物[11]。臨床研究也證實,糖尿病合并冠狀動脈疾病的患者血清CyPA水平明顯高于健康志愿者[11]。

KLF2是近年新發(fā)現(xiàn)的轉錄因子，具有抗炎、抗凝、抗黏附、抗氧化的調控作用[12]，是一種重要的AS保護因子[13]。有報道指出，KLF2在成年大鼠血管中發(fā)揮內皮屏障功能，其可通過MEK5/細胞外信號調節(jié)激酶5(ERK5)/MEF2信號轉導通路促進eNOS表達[14]。eNOS利用L-精氨酸(L-Arg)作為基質，在四氫生物蝶呤調節(jié)下合成NO[15]，后者通過NO/環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)信號轉導通路介導內皮依賴的血管舒張功能，是強大的血管舒張因子[16]。eNOS在血管張力調節(jié)以及維持內皮完整中起重要作用[17]。Nigro等[4]通過培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞發(fā)現(xiàn)，CyPA可抑制KLF2表達，從而導致eNOS mRNA表達水平下降。

本研究結果顯示，對照組大鼠頸動脈環(huán)張力良好，最大達(93.46±2.80)%，頸動脈內膜完整光滑，內皮細胞以及平滑肌細胞排列整齊、無增生，CyPA平均光密度較低，KLF2、eNOS平均光密度較高；而CAS組、糖尿病CAS組大鼠頸動脈環(huán)張力明顯下降，頸動脈結構破壞嚴重，出現(xiàn)鈣化斑塊，深達中層，CyPA平均光密度升高，KLF2、eNOS平均光密度下降，其中糖尿病CAS組大鼠頸動脈在頸動脈環(huán)張力以及CyPA、KLF2、eNOS平均光密度等方面的變化尤為顯著。表明了糖尿病CAS大鼠體內升高的氧化應激水平，糖尿病與氧化應激促進了CAS大鼠頸動脈內皮功能障礙，其機制可能與CyPA水平升高有關。本實驗亦有不足之處，免疫組織化學光密度檢測有其局限性，下一步本課題組將嘗試更客觀的分子生物學檢測手段進一步論證本實驗結果。

作者貢獻：盛沖霄、崔敏、李敏進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；盛沖霄、汪志忠、李敏進行實驗實施、評估、資料收集；黎紅華進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Impact of Diabetes and Oxidative Stress on Endothelial Dysfunction of Carotid Atherosclerosis Rats

SHENGChong-xiao，LIHong-hua,CUIMin,etal.DepartmentofNeurology,WuhanGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryAreaCommand,Wuhan430070,China

Objective To observe the impact of diabetes and oxidative stress on endothelial dysfunction of carotid atherosclerosis(CAS) rats.Methods From June to October in 2014,30 healthy male SPF-grade Wistar rats were divided into control group,CAS group and diabetic CAS group with 10 rats in each group by random table method.CAS group and diabetic CAS group were given intraperitoneal injection of a single dose of Vitamin D3by 600,000 U per kg body weight with high-fat diet.In the fifth week，diabetic CAS group was given intraperitoneal injection of a dose of Streptozocin by 45 mg per kg body weight.Control group was fed with basic diet.After 15 weeks,the rats were sacrificed,and 3 mm fresh carotid arterial ring was sectioned from each of the separated carotid arteries.The carotid artery ring tension was measured by adding different concentrations of acetylcholine (10-9，10-8，10-7，10-6，10-5and 10-4mol/L) into HV-4 out body tissue organ constant temperature perfusion system.Carotid artery tissue was observed by Hematoxylin and Eosin staining, and the average optical density of CyPA,KLF2 and eNOS was measured by immunohistochemistry SP method.Results After the addition of different concentrations of acetylcholine into HV-4 out body tissue organ constant temperature perfusion system,the carotid arterial rings of all the three groups had relaxant responses.CAS group and diabetic CAS group were lower than control group in carotid arterial ring tension when acetylcholine was given by 10-9，10-8，10-7，10-6，10-5and 10-4mol/L (P<0.05).Diabetic CAS group was lower than CAS group in carotid arterial ring tension when acetylcholine was given by 10-8，10-7,10-6,10-5and 10-4mol/L(P<0.05).HE staining showed that carotid artery intima of control group was complete and smooth with endothelial cells and smooth muscle cells in alignment,elastic fibers continuous without breakoff,and no hyperplasia. In CAS group and diabetic CAS group,intima breakage,formation of medial calcification plaques and loss of elastic layer continuity were observed. CAS group and diabetic CAS group were higher in the average optical density of CyPA and lower in the average optical density of KLF2 and eNOS than control group (P<0.05).Diabetic CAS group was higher in the average optical density of CyPA and lower in the average optical density of KLF2 than CAS group (P<0.05).Conclusion Diabetes and oxidative stress participate in the formation of endothelial dysfunction of CAS rats,and the mechanism may be related with the increase of CyPA expression.

Carotid artery diseases；Diabetes mellitus；Oxidative stress；Endothelial dysfunction；Cyclophilin A

湖北省自然科學基金資助項目(2013CFB428)

430070湖北省武漢市，廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經內科

黎紅華，430070湖北省武漢市，廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經內科；E-mail：Lihonghua567@aliyun.com

R 743.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.006

2015-09-24；

2016-01-16)