陳曉，王鳳偉

(1.金華市人民醫(yī)院生殖中心，金華　321000；2.武義縣中醫(yī)院，金華　321200；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，杭州　310012)

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TLR2和TNF-α與輸卵管炎的相關(guān)性研究

陳曉1，2*，王鳳偉3

(1.金華市人民醫(yī)院生殖中心，金華321000；2.武義縣中醫(yī)院，金華321200；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，杭州310012)

【摘要】目的建立輸卵管炎模型，檢測(cè)Toll樣受體-2(TLR2)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)，探討其與輸卵管炎的關(guān)系。方法48只6～8周齡BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)平均分為空白組(不處理)和模型組(子宮底注入l×109/ml金黃色葡萄球菌懸液50 μl)。分別在接種3 d、7 d、14 d、28 d處死模型組和對(duì)應(yīng)時(shí)間的空白組小鼠，收集血液和輸卵管。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)輸卵管組織TLR2 mRNA以及ELISA檢測(cè)血TNF-α在模型組和相應(yīng)空白組中的表達(dá)，并觀察各組輸卵管病理改變。結(jié)果空白組各時(shí)間點(diǎn)輸卵管組織TLR2 mRNA表達(dá)及血TNF-α濃度均無(wú)顯著差異(P>0.05)；模型組3 d、7 d、14 d時(shí)TLR2 mRNA表達(dá)逐漸降低，TNF-α濃度逐漸升高，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而28 d時(shí)TLR2 mRNA相對(duì)表達(dá)含量(0.822)顯著低于3 d時(shí)(1.296)(P<0.05)；模型組各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平均顯著高于相應(yīng)空白組(P<0.05)。結(jié)論TLR2可能通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量TNF-α，引起輸卵管炎。

【關(guān)鍵詞】Toll樣受體-2；腫瘤壞死因子-α；輸卵管炎

(JReprodMed2016，25(1)：56-60)

臨床術(shù)后輸卵管炎大多是由革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌感染所致[1]。在炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，機(jī)體的免疫功能在炎性疾病的預(yù)后上起著重要的作用。Toll樣受體 (Toll like receptors，TLRs)是與固有免疫密切相關(guān)的病原識(shí)別受體，可介導(dǎo)免疫防御[2]，Toll樣受體-2(TLR2)在輸卵管中表達(dá)最高[3]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的多肽類(lèi)物質(zhì)，與機(jī)體免疫反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究擬通過(guò)檢測(cè)小鼠輸卵管組織中TLR2和TNF-α的表達(dá)，探討兩者與輸卵管炎的關(guān)系。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：48只6～8周齡BALB/c雌性小鼠，體重16～20克。購(gòu)買(mǎi)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào)2007000580086)，均為清潔級(jí)，分籠顆粒飼料飼養(yǎng)，每只動(dòng)物作上標(biāo)記，飼養(yǎng)在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度18℃～24℃，光暗周期12 h。

2.造模菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院微生物室培養(yǎng)和提供，用無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān)涑蓾舛葹?×109/ml的致病菌懸液。

3.實(shí)驗(yàn)試劑：總RNA提取試劑盒、cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒(大連寶生物)；TLR2、熒光定量PCR試劑(Takara，日本)；TLR2及β-actin引物(上海生工)；TNF-α ELISA試劑盒(CUSABIO CSB-E04741m，武漢華美)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 建立輸卵管炎模型：48只6～8周齡BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)平均分為空白組和模型組?？瞻捉M：不處理；模型組：每只小鼠用1.5%的戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔麻醉后，再用0.1%新潔爾滅消毒外陰、0.9%的生理鹽水清洗，將l×109/ml金黃色葡萄球菌懸液50 μl注入子宮底[4]。分別在接種3 d、7 d、14 d、28 d處死各模型組和對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的空白組小鼠，各時(shí)間點(diǎn)每組均處死6只。

2. 病理學(xué)觀察：迅速精確地切取輸卵管組織，置于福爾馬林溶液中固定，常規(guī)切片、HE染色，光鏡下觀察病理改變。

3. TNF-α檢測(cè)：心臟采血，2 000 rpm離心20 min后取上清，采用ELISA雙抗體夾心法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；用直線(xiàn)回歸分析，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算各樣品含量(pg/ml)。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TLR2 mRNA表達(dá)：RNA提取試劑盒提取輸卵管總RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子，在熒光定量PCR儀行PCR反應(yīng)。

引物：TLR2 (Forward)：5’-AGCAGGATTCCCATTGGGTG-3’，(Reverse)：5’-CATTTGCCCGGAACGAAGTC-3’；β-actin (Forward)：5’-ATGTGGATCAGCAAGCAGGA-3’，(Reverse)：5’-AAGGGTGTAAAACGCAGCTC-3’。

每個(gè)標(biāo)本3個(gè)復(fù)孔，取平均Ct值，結(jié)果2-ΔCt表示TLR2 mRNA相對(duì)于內(nèi)參β-actin的表達(dá)量，2-ΔCt值越大，表示基因的表達(dá)量越大，其中ΔCt目標(biāo)基因=Ct目標(biāo)基因- Ctβ-actin。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0 windows軟件包分析，結(jié)果用±s表示。非正態(tài)分別數(shù)據(jù)組間比較采用Mann-Whitney U test，繪圖采用Origin 7.0 進(jìn)行，計(jì)算統(tǒng)計(jì)資料采用Pearson χ2檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)。

結(jié)果

一、小鼠輸卵管光鏡下的病理學(xué)改變

正常輸卵管壁由粘膜、肌層、漿膜三層構(gòu)成。粘膜層主要由單層纖毛柱狀上皮細(xì)胞組成。管壁組織結(jié)構(gòu)清晰，粘膜層可見(jiàn)排列整齊的上皮柱狀細(xì)胞，纖毛豐富，管腔通暢(圖1A)。模型組輸卵管三層結(jié)構(gòu)中以粘膜層病變最為顯著，早期(3 d)病變主要侵犯粘膜上皮，且局限于粘膜層，可見(jiàn)粘膜皺襞增粗且互相粘連，大量單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，少量纖毛脫落(圖1B)；中期(7 d、14 d)粘膜柱狀上皮細(xì)胞逐漸減少且成矮柱狀、頂部纖毛顯著變短，進(jìn)而大部分脫落、間質(zhì)空化，粘膜皺壁變平、減少，管腔擴(kuò)大，漿膜層毛細(xì)胞血管擴(kuò)張，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C、1D)；晚期(28 d)柱狀上皮細(xì)胞呈卵圓形，可見(jiàn)裸露的細(xì)胞核，纖毛完全脫落，粘膜皺襞基本消失，壞死組織溶解吸收，管腔極度增大(圖1E)。

二、模型組各時(shí)間點(diǎn)與相應(yīng)空白組血清TNF-α水平變化

模型組血清TNF-α水平隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，到28 d時(shí)下降(3 d：1 817.926 pg/ml；7 d：2 227.699 pg/ml；14 d：2 378.322 pg/ml；28 d：1 791.388 pg/ml)，但各時(shí)間點(diǎn)TNF-α水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)；空白組各時(shí)間點(diǎn)之間TNF-α濃度無(wú)明顯變化(3 d：496.788 pg/mL；7 d：505.175 pg/ml；14 d：498.652 pg/ml；28 d：512.134 pg/ml)(P>0.05)；各時(shí)間點(diǎn)TNF-α水平在模型組與空白組之間均有顯著差異(P<0.05)(圖2)。

A：空白組；B：造模3 d；C：造模7 d；D：造模14 d；E：造模28 d；L示管腔圖1　空白組和模型組小鼠輸卵管的病理學(xué)改變(HE染色 ×40)

圖2　血清TNF-α水平在模型組和空白組的時(shí)間變化趨勢(shì)

三、模型組各時(shí)間點(diǎn)與相應(yīng)空白組輸卵管組織TLR2 mRNA的表達(dá)變化

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TLR2 mRNA的變化，以相對(duì)于正常組(%)表示。模型組與空白組在各時(shí)間點(diǎn)的TLR2 mRNA的表達(dá)(3 d：1.296 vs. 1.007；7 d：1.041 vs. 1.027；14 d：0.948 vs.1.022；28 d：0.822 vs.1.002)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。模型組TLR2 mRNA的表達(dá)量隨著建模天數(shù)的增加逐漸降低，28 d時(shí)TLR2 mRNA的表達(dá)顯著低于3 d時(shí)(P<0.05)(圖3)。

*表示兩組相比，P<0.05圖3　空白組和模型組各時(shí)間點(diǎn)輸卵管TLR2 mRNA的表達(dá)

討論

TLRs是多種病原體感染的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，在免疫效應(yīng)細(xì)胞包括單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞等均有表達(dá)，通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，觸發(fā)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞聚集，最終引發(fā)固有免疫反應(yīng)[5]。TLR2在單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞大量表達(dá)[6-7]，主要識(shí)別PAMPs革蘭陽(yáng)性菌[8]。TLR2通過(guò)髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)通路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在MyD88依賴(lài)信號(hào)途徑中，MyD88被募集到活化的TLR2后，通過(guò)一系列轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，最終啟動(dòng)核因子κB(NF-κB)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，誘導(dǎo)炎癥前細(xì)胞因子(主要是TNF-α等)的表達(dá)引起炎癥反應(yīng)，激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[9]。TNF-α是反應(yīng)炎癥程度的重要指標(biāo)，主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，在正常輸卵管以及炎性輸卵管粘膜上皮細(xì)胞上均有表達(dá)[10]。TNF-α與輸卵管炎的關(guān)系密切，研究證實(shí)TNF-α產(chǎn)生越多，輸卵管損傷越嚴(yán)重，可能是由于高于生理水平的TNF-α可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，合成更多的白細(xì)胞介素 (IL)-1、6、8和TNF-α[11]，促進(jìn)了炎癥反應(yīng)，加重輸卵管損傷。

TLR2是引起先天免疫反應(yīng)的重要媒介，在小鼠輸卵管早期產(chǎn)生炎性介質(zhì)和慢性炎癥的病理發(fā)展中起著重要作用[12]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M造模3 d時(shí)TLR2 mRNA表達(dá)升高，可能與TLR2識(shí)別病原菌啟動(dòng)免疫防御反應(yīng)有關(guān)，隨著接種金葡萄菌時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)TLR2 mRNA表達(dá)逐漸降低，28 d時(shí)顯著低于3 d時(shí)(P<0.05)，雖然與相應(yīng)空白組均無(wú)顯著性差異，但模型組各時(shí)間點(diǎn)病理改變卻逐漸加重，推測(cè)異于生理水平的TLR2表達(dá)就能觸發(fā)一系列級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而引起輸卵管炎癥反應(yīng)。TLR2有分泌炎癥因子的作用，并能較強(qiáng)的終止炎癥反應(yīng)[13]，在急性炎癥反應(yīng)初期，TLR2高表達(dá)募集炎癥因子，激活炎癥反應(yīng)，待病原體消除后，則啟動(dòng)炎癥反應(yīng)終止機(jī)制，減少對(duì)組織損傷的破壞。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組接種金葡菌第28 d輸卵管腔內(nèi)炎癥滲出物和壞死組織被溶解吸收，推測(cè)可能是TLR2啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)終止機(jī)制，減輕了輸卵管的炎癥病變。

武孟香等[14]采用免疫組化法發(fā)現(xiàn)TNF-α在正常輸卵管和炎癥輸卵管上均有表達(dá)，但正常輸卵管粘膜上皮細(xì)胞的表達(dá)較低，炎癥輸卵管粘膜上皮細(xì)胞的表達(dá)顯著高于正常輸卵管組織。我們的研究也顯示模型組各時(shí)間點(diǎn)血中TNF-α濃度顯著高于相應(yīng)空白組(P<0.05)，說(shuō)明TNF-α在輸卵管炎的發(fā)生中具有重要作用。TNF-α是介導(dǎo)輸卵管上皮細(xì)胞凋亡的主要因子[15]。Nagarajan等[16]發(fā)現(xiàn)敲除了TLR2信號(hào)主要接頭分子MyD88基因的小鼠，TNF-α產(chǎn)生減少，機(jī)體清除生殖道病原體的能力降低，最終導(dǎo)致輸卵管慢性病變。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠感染金黃色葡萄球菌3 d、7 d、14 d后輸卵管黏膜柱狀上皮細(xì)胞變性、壞死，粘膜皺襞逐漸變平、減少，輸卵管炎癥從急性逐漸轉(zhuǎn)為慢性，TNF-α濃度逐漸增高，感染28 d發(fā)現(xiàn)大量壞死的上皮細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬后凋亡、吸收、分解，TNF-α濃度降低。我們推測(cè)：空白組血液中TNF-α的低表達(dá)可能具有保護(hù)輸卵管粘膜上皮細(xì)胞免受病原體入侵的作用，TNF-α在慢性炎癥時(shí)產(chǎn)生增多，使免疫機(jī)制發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致輸卵管粘膜的破壞。

綜上所述，金黃色葡萄球菌大量入侵輸卵管粘膜，TLR2識(shí)別病原菌，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的TNF-α等促炎細(xì)胞因子，高于生理水平的TNF-α誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，產(chǎn)生更多的TNF-α，通過(guò)其細(xì)胞毒作用及促炎因子間的協(xié)同作用，導(dǎo)致輸卵管粘膜上皮細(xì)胞發(fā)生變性、壞死等一系列炎癥反應(yīng)，最終壞死物質(zhì)被溶解吸收，TLR2啟動(dòng)炎癥反應(yīng)終止機(jī)制，減輕了輸卵管的炎癥病變。

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[編輯：辛玲]

Study on the relationship between expression of TLR2 & TNF-α and salpingitis

CHENXiao1，2*，WANGFeng-wei3

1.ReproductiveCenter，JinhuaPeople’sHospital，Jinhua321000

2.WuyiTraditionalChineseMedicineHospital，Jinhua321200

3.CentralLaboratory，Women’sHospital，SchoolofMedicine，ZheJiangUniversity，Hangzhou310012

【Abstract】

Objective： To establish a salpingitis model for exploring the association between toll like receptor-2 (TLR2) & tumor necrosis factor-α (TNF-α) and salpingitis.

Methods： Forty-eight BALB/c female mice of 6-8 weeks were randomly divided to control group and model group. The mice in control group had no treatment，and the fundus of uterus of mice in model group was injected 50 μl l×109/ml suspension of staphylococcus aureus. The blood and fallopian tubes were collected after 3，7，14，28 days of treatment. The expressions of TLR2 mRNA in fallopian tubes and serum TNF-α levels were detected by using real-time fluorescence quantitative PCR and ELISA，respectively，and the pathological changes of fallopian tubes were observed in the model group and control group.

Results： The expressions of TLR2 mRNA and serum TNF-α levels were not significantly different along with the time in the control group (P>0.05). The expressions of TLR2 mRNA were gradually decreased，while the concentrations of TNF-α were gradually increased after 3，7，14 days of treatment，but there were no significant differences (P>0.05). The TLR2 mRNA expression after 28 days of treatment was significantly lower than that after 3 days of treatment (P<0.05). The serum TNF-α levels in model group were all significantly higher than those in control group at corresponding time points (P<0.05).

Conclusions： TLR2 might induce more TNF-α production through a series of signal pathways to cause salpingitis.

Key words：TLR2；TNF-α；Salpingitis

【作者簡(jiǎn)介】陳曉，女，浙江金華人，碩士，主治醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè).(*通訊作者，Email：30395478@qq.com)

【基金項(xiàng)目】金華市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2014A33503)

【收稿日期】2015-05-30；【修回日期】2015-06-27

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.1.011