靳穎+王俊妨+周鑫+等

[摘要] 目的 探討血清（1，3）-β-D-葡聚糖對(duì)深部真菌病的診斷價(jià)值。 方法 將2014年2～6月天津市武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院110份數(shù)據(jù)（標(biāo)本140份）分為侵襲性真菌病患者組33例和無(wú)侵襲性真菌病組77例，分析比較葡聚糖水平，并使用ROC曲線(xiàn)確定最佳臨界值。 結(jié)果 侵襲性真菌病患者組的葡聚糖水平（279.78±83.26）pg/mL，明顯高于對(duì)照組（34.05±9.35）pg/mL（P<0.001）；ROC曲線(xiàn)下面積為0.946（95%的置信區(qū)間為0.904～0.988），當(dāng)以95.20 pg/mL為臨界值時(shí)，實(shí)驗(yàn)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為84.8%、93.5%、80.0%和93.3%；臨床符合率達(dá)到89.1%。Kappa值0.784（P<0.05）。 結(jié)論 血清葡聚糖水平可以用于深部真菌感染的診斷，本研究中用北京金山川公司的GKT-1M Set動(dòng)態(tài)真菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清葡聚糖水平，進(jìn)行深部真菌感染診斷時(shí)的最佳臨界值為95.20 pg/mL，當(dāng)以此臨界值對(duì)深部真菌感染進(jìn)行診斷時(shí)，臨床一致性較好。

[關(guān)鍵詞] 深部真菌?。辉\斷；血清1，3-β-D-葡聚糖；ROC曲線(xiàn)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R392.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）25-0102-03

Study on diagnostic value of serum （1，3）-β-D-Glucan detection for deep fungal disease

JIN Ying WANG Junfang ZHOU Xin WANG Hongzhi

Clinical Laboratory Department， Affiliated Hospital of Armed Police Logistics，Tianjin 300162， China

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic value of serum（1，3）-β-D-glucan for deep fungal disease. Methods 110 copies of data（140 specimens） of affiliated hospital of tianjin Armed Police logistics academy from February to June 2014 were divided into the invasive fungal disease group with 33 copies and the non-invasive fungal disease group with 77 copies. The glucan levels were analyzed and compared. The ROC curve was used to determine the optimal critical value. Results The glucan level of the invasive fungal disease group was （279.78±83.26） pg/mL， which was significantly higher than the（34.05±9.35）pg/mL of the control group（P<0.001）. The ROC area under curve was 0.946（95% confidence interval was 0.904-0.988）； When 95.20 pg/mL was used as the critical value， the sensitivity， specificity， positive predictive value and negative predictive value of experiment were 84.8%， 93.5%， 80.0% and 93.3%. The clinical accordance rate reached 89.1%. The Kappa value was 0.784 （P<0.05）. Conclusion The serum glucan level can be used for the diagnosis of deep fungal infection. This study uses the GKT-1M Set dynamic fungal detection kit of Beijing Jinshan Company to detect the serum glucan level. The optimal critical value for deep fungal infection diagnosis is 95.20 pg/mL and when this critical value is used for the diagnosis of deep fungal infection， the clinical consistency is better.

[Key words] Deep fungal disease； Diagnosis； Serum 1，3-β-D-glucan； ROC curve

現(xiàn)今，盡管存在有效的治療方法，但是侵襲性真菌?。╥nvasive fungal disease，IFD）仍然是免疫抑制患者發(fā)病和死亡的重要原因[1]。及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷是非常必要的，但是由于非特異性的臨床和影像結(jié)果、低敏感性的培養(yǎng)方法等[2]，診斷又面臨著諸多挑戰(zhàn)。非培養(yǎng)血清抗原診斷方法，如（1，3）-β-D-葡聚糖檢測(cè)（G實(shí)驗(yàn)）和半乳甘露聚糖檢測(cè)（GM實(shí)驗(yàn)）等則使得IFD的早期診斷成為可能[3]。本研究中，我們應(yīng)用MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)，調(diào)查了血清（1，3）-β-D-葡聚糖（G實(shí)驗(yàn)）在侵襲性真菌病方面的診斷作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析天津市武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院2014年2～6月確診侵襲性真菌病患者33例（其中男15例，年齡52～90歲；女18例，年齡29～81歲），平均64歲，對(duì)照組77例（其中男41例，女36例），平均年齡59歲。相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照歐洲腫瘤研究治療組織（EORTC）和真菌病研究組（MSG）對(duì)侵襲性真菌病的定義和分類(lèi)進(jìn)行判斷[4]，整個(gè)過(guò)程結(jié)合臨床，患者出院后進(jìn)行病例分析總結(jié)。

1.2 試劑與儀器

GKT203真菌檢測(cè)試劑盒（定量）、MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)、T02智能恒溫儀，均由北京金山川科技發(fā)展有限公司提供。

1.3 標(biāo)本采集

兩組均在早晨空腹用藥前采血，分別送血清葡聚糖檢測(cè)和真菌血培養(yǎng)，根據(jù)臨床癥狀，對(duì)于高度疑似患者同時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。取樣過(guò)程盡量保證無(wú)菌無(wú)熱原，血培養(yǎng)時(shí)將標(biāo)本接種于標(biāo)準(zhǔn)真菌培養(yǎng)基。最后留取用于檢測(cè)血清（1，3）-β-D-葡聚糖的標(biāo)本110 份，其中確診和高度疑似病例33份，對(duì)照組77 份。

1.4 血清（1，3）-β-D-葡聚糖的檢測(cè)（G實(shí)驗(yàn)）

使用無(wú)菌無(wú)熱原真空血清采血管取4 mL靜脈血，3000轉(zhuǎn)每分鐘離心10 min，得到血清標(biāo)本，取血清標(biāo)本上層清液100 μL，加入到900 μL的樣品處理液中，搖勻，放入T02智能恒溫儀，70℃加熱10 min，轉(zhuǎn)移到冷卻區(qū)冷卻5 min，得到處理后的待測(cè)樣本。取200 μL上述處理后的樣本，加入到反應(yīng)主劑中，混勻后全量轉(zhuǎn)移至無(wú)熱原平底試管中，一次性插入MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)，反應(yīng)1.5 h系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算結(jié)果并保存。廠(chǎng)家提供的真菌葡聚糖陽(yáng)性判斷值為100 pg/mL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS11.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確診及高度疑似組、健康組的血清葡聚糖水平記錄為[x±s（中位數(shù)）]形式，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另繪制血清（1，3）-β-D-葡聚糖水平、真菌血培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查結(jié)果的ROC曲線(xiàn)（受試操作特征曲線(xiàn)），根據(jù)該方法對(duì)敏感度和特異度的要求，確定血清（1，3）-β-D-葡聚糖檢測(cè)用于診斷侵襲性真菌病的最佳臨界值，使用一致性檢驗(yàn)Kappa值，判斷一致性符合度，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清（1，3）-β-D葡聚糖水平比較

侵襲性真菌病患者組的葡聚糖水平[（279.78±83.26）（192.10）pg/mL，方差為69687.40 pg/mL2（其中念珠菌感染者平均水平198.33 pg/mL，曲霉感染者平均水平232.9 pg/mL，明顯高于對(duì)照組的葡聚糖水平（34.05±9.35）（18.87）pg/mL，方差為1450.91（pg/mL）2。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)值：t=8.023，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 真菌培養(yǎng)和組織病理學(xué)檢查結(jié)果

33例確診和高度疑似深部真菌病患者中，血清（1，3）-β-D-葡聚糖檢測(cè)28例陽(yáng)性，5例陰性。血培養(yǎng)出22例陽(yáng)性，其余11例通過(guò)組織病理學(xué)確診。血培養(yǎng)結(jié)果：白色念珠菌11例，光滑念珠菌5例，克柔念珠菌2例，近平滑念珠菌2例，季也蒙念珠菌2例；組織病理學(xué)檢查黃曲霉3例，組織胞漿菌2例，黑曲霉2例，毛霉菌2例，煙曲霉1例，念珠菌1例。

2.3 血清（1，3）-β-D葡聚糖檢測(cè)的敏感性和特異性

血清葡聚糖用于診斷侵襲性真菌病ROC曲線(xiàn)下面積為0.946（漸進(jìn)95%的置信區(qū)間為0.904～0.988），見(jiàn)圖1。

圖1 血清葡聚糖用于診斷侵襲性真菌病ROC曲線(xiàn)

不同血清葡聚糖水平作為臨界值時(shí)的敏感度和特異度見(jiàn)表1。當(dāng)以95.20 pg/mL為臨界值時(shí)，本方法對(duì)侵襲性真菌病的診斷敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為84.8%、93.5%、80.0%和93.3%，效果較為理想。

表1 不同血清葡聚糖水平作為臨界值時(shí)的敏感度和特異度

3 討論

近年來(lái)，由于免疫抑制劑和廣譜抗生素以及抗腫瘤藥物的大量使用，侵襲性真菌病的發(fā)病率不斷增加[5]，同時(shí)由于缺少早期診斷方法，延遲了真菌藥物治療，部分侵襲性真菌病在尸檢時(shí)才能診斷出來(lái)，導(dǎo)致IFD的病死率逐年升高。真菌血培養(yǎng)是侵襲性真菌病的傳統(tǒng)診斷手段，可明確診斷結(jié)果并進(jìn)行相應(yīng)的藥敏試驗(yàn)，但陽(yáng)性率很低，組織病理學(xué)檢測(cè)往往需要侵入性手段獲得標(biāo)本[6]。因此侵襲性真菌病的早期快速準(zhǔn)確診斷顯得尤為重要。

血清（1，3）-β-D-葡聚糖檢測(cè)（G實(shí)驗(yàn)）敏感度和特異度較高，可早期快速明確是否具有深部真菌感染[7]。在歐洲癌癥治療研究組織/真菌病研究組（EORTC/ MSG）診斷侵襲性真菌病的標(biāo)準(zhǔn)中，已經(jīng)將G試驗(yàn)連續(xù)2次陽(yáng)性結(jié)果作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。（1，3）-β-D-葡聚糖是許多真菌細(xì)胞壁的主要成分，占真菌細(xì)胞壁成分的50%以上，其形式以（1，3）-β-糖苷鍵連接的葡萄糖殘基骨架作為主鏈，分支狀（1，3）-β-D-葡聚糖殘基作為側(cè)鏈。這些真菌包括念珠菌、曲霉菌、鐮刀菌和肺孢子菌等，而細(xì)菌、病毒以及人體細(xì)胞中則不含有（1，3）-β-D-葡聚糖。由于（1，3）-β-D-葡聚糖僅特異性存在于真菌的細(xì)胞壁中，占真菌細(xì)胞壁成分的50%以上，真菌進(jìn)入人體血液或系統(tǒng)性組織后，經(jīng)過(guò)吞噬細(xì)胞的吞噬消化等處理，（1，3）-β-D-葡聚糖可以從真菌細(xì)胞壁中釋放出來(lái)，導(dǎo)致血液和其他體液（如尿、腦脊液、腹水、胸水等）中的葡聚糖含量增高[8]，而在淺部真菌感染中，（1，3）-β-D-葡聚糖不會(huì)進(jìn)入血液等體液中，所以體液中葡聚糖的的量不會(huì)增高。當(dāng)病人患有侵襲性真菌病時(shí)，血清中（1，3）-β-D-葡聚糖濃度會(huì)明顯增高，因此可以根據(jù)血清葡聚糖的濃度判斷病人是否患病[9]。本研究中，G實(shí)驗(yàn)對(duì)接合菌和新生隱球菌的感染呈陰性，主要是因?yàn)榻雍暇ò购透梗┘?xì)胞壁中（1，3）-β-D-葡聚糖含量較少、而新生隱球菌的莢膜較厚，影響（1，3）-β-D-葡聚糖的釋放，使得（1，3）-β-D-葡聚糖無(wú)法被檢測(cè)到[10]。

目前國(guó)產(chǎn)用于（1，3）-β-D-葡聚糖檢測(cè)的商品化試劑盒主要以北京金山川科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的真菌動(dòng)態(tài)檢測(cè)試劑盒為主，根據(jù)患者臨床狀況和試劑本身的特點(diǎn)，當(dāng)以95 pg/mL為臨界判斷值時(shí)，靈敏度和特異度都很好，臨床符合率也較高。根據(jù)病理組織學(xué)，并結(jié)合血培養(yǎng)結(jié)果是否為陽(yáng)性判斷該方法的敏感度與特異度，本研究認(rèn)為，使用GKT-1M Set動(dòng)態(tài)真菌檢測(cè)試劑盒診斷侵襲性真菌病的最佳臨界值為（1，3）-β-D-葡聚糖濃度95.20 pg/mL。當(dāng)以血清（1，3）-β-D-葡聚糖水平95.20 pg/mL為臨界值對(duì)侵襲性真菌病的診斷敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為84.8%、93.5%、80.0%和93.3%，臨床符合率達(dá)到89.1%，一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.748（P<0.05），說(shuō)明G實(shí)驗(yàn)和血培養(yǎng)具有非常好的符合度。

臨床工作中侵襲性真菌病患者血清（1，3）-β-D-葡聚糖水平的檢測(cè)具有其局限性：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，G試驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因包括：①應(yīng)用纖維素膜進(jìn)行血液透析[11]；②靜脈輸注免疫球蛋白[12]；③標(biāo)本或患者傷口接觸紗布或其他含有葡聚糖的物質(zhì)[13]；④患者伴有較重的溶血（血紅蛋白在5.88 g/L以上）；⑤某些鏈球菌感染會(huì)產(chǎn)生葡聚糖或葡聚糖類(lèi)似物等[14]。此外，其他導(dǎo)致假陽(yáng)性的因素還需要進(jìn)一步的證實(shí)，如使用香菇多糖類(lèi)的抗腫瘤藥物、放化療后因?yàn)橄鲤つな軗p而使食物或腸道定植念珠菌的（1，3）-β-D-葡聚糖進(jìn)入血液及，接受真菌來(lái)源的抗生素治療等[15]。由于導(dǎo)致G試驗(yàn)假陽(yáng)性原因較多，所以在G試驗(yàn)的臨床應(yīng)用中，對(duì)于陽(yáng)性的患者，應(yīng)結(jié)合多種診斷手段，綜合進(jìn)行分析[16]，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也要引起注意。

國(guó)外報(bào)道的多中心對(duì)照研究表明，侵襲性念珠菌、曲霉菌和鐮刀菌感染在相同臨界值下的G試驗(yàn)的靈敏度和特異度都較高[17]。在本次研究中，我們的試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。這也提示我們，血清G實(shí)驗(yàn)可以廣泛應(yīng)用于除接合菌、隱球菌外多種真菌的檢測(cè)。

總之，血清中（1，3）-β-D-葡聚糖的水平可用于侵襲性真菌病的診斷。本研究中用北京金山川公司的GKT-1M Set動(dòng)態(tài)真菌檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)血清中（1，3）-β-D-葡聚糖的水平，最佳臨界值為95.20 pg/mL，當(dāng)以此臨界值進(jìn)行診斷時(shí)，臨床一致性較好。

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（收稿日期：2015-03-19）