關(guān)立增，婁安鋼，樸明淑，蔡錦順

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002)

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延邊黃牛與韓延牛血液Exosome對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH含量的影響

關(guān)立增，婁安鋼，樸明淑，蔡錦順*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002)

延邊黃牛肉質(zhì)細(xì)膩多汁，鮮美可口，品質(zhì)優(yōu)，特別是不飽和脂肪酸、必需氨基酸和風(fēng)味氨基酸含量明顯高于其他品種牛，具有極高的產(chǎn)品發(fā)展價(jià)值，市場(chǎng)前景廣闊[1]。但是，延邊黃牛具有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、飼養(yǎng)成本高和出欄率低等缺點(diǎn)，已嚴(yán)重制約了延邊黃牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。因此，如何提高延邊黃牛的生長(zhǎng)速度是加快延邊黃牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題之一。韓延牛與延邊黃牛的血統(tǒng)相近，而其生長(zhǎng)發(fā)育速度、初生重及各年齡段體尺和體重均極顯著高于延邊黃牛[3]，因此研究二者之間在生長(zhǎng)方面的差異將為提高延邊黃牛的生長(zhǎng)速度提供新途徑。

Exosome(外胞體)是一類(lèi)由多種細(xì)胞分泌的、直徑為30～150 nm并具有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡。研究表明，外胞體與動(dòng)物生長(zhǎng)有密切的關(guān)系[4]。Melnik等[5]研究發(fā)現(xiàn)牛乳中的Exosome可以促進(jìn)犢牛的生長(zhǎng)，垂體細(xì)胞中分泌的生長(zhǎng)激素(Growth hormone，GH)是直接調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)的重要內(nèi)分泌激素。因此，關(guān)于Exosome通過(guò)影響GH分泌來(lái)調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)的研究是提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度的一個(gè)新的途徑。筆者選擇延邊黃牛和韓延牛為研究對(duì)象，研究延邊黃牛及韓延牛血液外胞體對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH的調(diào)控機(jī)制，以期為延邊黃牛生長(zhǎng)調(diào)控提供新資料，也為提高延邊黃牛的生長(zhǎng)發(fā)育速度奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器。JEM-1230EX透射電鏡(日本)；超高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Kemdro公司)；SHEL LAB 2406-2型CO2培養(yǎng)箱；ABI MX3000P型熒光定量PCR儀(ABI 美國(guó))；凝膠成像系統(tǒng)(Ultro-Violet Products公司，英國(guó))。

1.1.2試劑。Trizol Reagent(Invitrogen公司)；RNase固相清除劑(北京天澤基因公司)；DMEM/F-12、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、膠原酶 Ⅱ 及青霉素、鏈霉素，均購(gòu)自GIBCO公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA Marker、dNTPs、Ribonuclease Inhibitor、DNase I、TaqDNA聚合酶，均購(gòu)自TaKaRa公司；[125I]人生長(zhǎng)激素放射免疫分析藥盒，購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1延邊黃牛和韓延牛Exosome的提取。分別抽取4～6月齡斷乳延邊黃牛和韓延牛全血于50 mL離心管中，2 500 r/min離心5 min，取上清獲得血漿。將血漿置于超速離心管中，放入超速離心機(jī)，50 000 r/min離心60 min；棄上清，用0.01 mol/L PBS將沉淀吹下，使其溶解，再次將其置于超速離心管中，放入超速離心機(jī)，50 000 r/min離心60 min；棄上清，加入0.01 mol/L PBS溶液，使用移液器將沉淀反復(fù)吹打，使其完全混勻，即為Exosome溶液。然后，在透射電鏡下鑒定Exosome形態(tài)并拍照。

1.2.2延邊黃牛垂體細(xì)胞原代培養(yǎng)。在無(wú)菌條件下分離延邊黃牛垂體組織，分離垂體前葉棄去垂體后葉，在裝有500 μL 無(wú)Ca2+、Mg2+和PBS溶液的1.5 mL EP中剪碎至1 mm×1 mm組織塊，用pH 7.0的PBS沖洗3遍。然后，將組織沉淀轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，平均每個(gè)垂體加入0.5 mL 0.25%膠原酶、0.5 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 ℃水浴搖床孵育消化25 min，最后用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。用100目細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞，將濾液于4 ℃、2 000 r/min離心10 min并棄上清，用DMEM/F12培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，放入75 mL培養(yǎng)瓶中于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞從組織塊中爬壁生長(zhǎng)至80%時(shí)，用0.25%的膠原酶消化，并采用差速貼壁法分離細(xì)胞，獲得原代培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.3Exosome對(duì)延邊黃牛腺垂體細(xì)胞GH mRNA表達(dá)的影響。 用含10%胎牛血清的DMEM/F12對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞連接成片后吸棄培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2次。加入2 mL DMEM/F12培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞4 h，然后用100 μL PBS(對(duì)照組)、100 μL延邊黃牛血液Exosome(100 ng/mL)和韓延牛血液Exosome(100 ng/mL)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理6 h，每個(gè)試驗(yàn)組及對(duì)照組均設(shè)5個(gè)重復(fù)。處理結(jié)束后收集培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞1次，并棄去廢液，收集細(xì)胞。

采用TRIzol Reagent 提取垂體細(xì)胞總RNA，整個(gè)過(guò)程在冰上操作，總RNA提取后用DNaseI消化以除去痕量DNA的污染。以獲得的總RNA為模板，用OligodT-18為引物，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)延邊黃牛GH基因及β-actin基因的上游引物和下游引物。β-actin的上、下游引物分別為：CCACGAAACTACCTTCAACTC和CCACGAAACTACCTTCAACTC；GH的上、下游引物分別為：CTCCAACTGGCTGCCGACAGCTA和CGATGTCTGCTGGGGCTCGTCC。

在優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)后，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，具體反應(yīng)體系為：SYBR Green Master Mix 10.0 μL，上、下游引物各 0.3 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.4 μL。將各成分加入到定量PCR板的各孔中，封膜、振蕩混勻，放入qRT-PCR儀中，反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)并在延伸結(jié)束收集熒光信號(hào)；最后95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，繪制溶解曲線并收集熒光信號(hào)，每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)。GH基因mRNA表達(dá)水平采用2-ΔCt法進(jìn)行計(jì)算，其計(jì)算公式為ΔCt=GH基因Ct-內(nèi)參基因Ct。

1.2.4Exosome對(duì)延邊黃牛腺垂體細(xì)胞GH分泌的影響。用含10%胎牛血清的DMEM/F12對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞連接成片、鋪成單層后，吸棄培養(yǎng)基，并用預(yù)熱的PBS沖洗細(xì)胞3次；然后，用DMEM/F12培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞4 h；最后用100 μL PBS(對(duì)照組)、100 μL延邊黃牛血液Exosome(100 ng/mL)和韓延牛血液Exosome(100 ng/mL)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，12、24和48 h后收集培養(yǎng)液，使用125I-GH放射免疫檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞上清液中GH含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。對(duì)不同處理組間的數(shù)值進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及鄧肯氏多重比較(Duncan’s multiple range test)。P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1延邊黃牛和韓延牛Exosome的觀察通過(guò)對(duì)延邊黃牛和韓延牛血漿進(jìn)行一系列離心和超離心后分別獲得Exosome。從圖1可以看出，延邊黃牛和韓延牛血液中含有大量的Exosome，電鏡下觀察均呈圓形或橢圓形的雙層膜小囊泡，直徑也均為30～100 nm，膜結(jié)構(gòu)完整。

注：A.延邊黃牛血液Exosome；B.韓延牛血液Exosome。Note：A.Blood Exosome from Yanbian yellow cattle；B.Blood Exosome from Hanyan cattle.圖1　延邊黃牛和韓延牛血液Exosome的透射電鏡圖(10 000×)Fig.1　Transmission electron microscopes of blood Exosome from Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle

2.2Exosome對(duì)延邊黃牛腺垂體細(xì)胞GH mRNA表達(dá)的影響從圖2、3可以看出，韓延牛Exosome處理的延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH mRNA表達(dá)顯著高于延邊黃牛Exosome處理組(P>0.05)。這表明韓延牛與延邊黃牛Exosome對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH的mRNA表達(dá)有明顯影響。

圖2　實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)GH mRNA表達(dá)的電泳圖譜Fig.2　Electrophoretogram of GH mRNA expression by real-time quantitative PCR detection

圖3　韓延牛和延邊黃牛Exosome對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞GH 的mRNA表達(dá)的影響Fig.3　Effects of Exosome from Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle on mRNA expression of pituitary cells GH of Yanbian yellow cattle

2.3Exosome對(duì)延邊黃牛腺垂體細(xì)胞GH含量的影響用100 μL延邊黃牛血液Exosome(100 ng/mL)和韓延牛血液Exosome(100 ng/mL)對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞進(jìn)行處理12、24和48 h后，收集培養(yǎng)液并對(duì)細(xì)胞上清液中GH含量進(jìn)行檢測(cè)。從圖4可以看出，韓延牛血液Exosome處理組的垂體中GH含量顯著高于延邊黃牛血液Exosome處理組。

圖4　延邊黃牛與韓延牛血液Exosome對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH含量的影響Fig.4　Effects of blood Exosome of Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle on the GH content in pituitary cells of Yanbian yellow cattle

3討論與結(jié)論

延邊黃牛具有生產(chǎn)高檔牛肉的品質(zhì)特性，而如何提高延邊黃牛的生長(zhǎng)速度是人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。GH是一種具有種屬特異性的蛋白激素，可以促進(jìn)骨、軟骨、肌肉及其他組織細(xì)胞分裂增殖，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的調(diào)控作用[6]。關(guān)于通過(guò)調(diào)控GH分泌來(lái)影響動(dòng)物生長(zhǎng)的研究是目前的熱點(diǎn)之一。研究表明，外胞體(Exosome)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)有調(diào)控作用[7]。筆者研究了延邊黃牛及韓延牛血液Exosome對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH表達(dá)的影響，可為提高延邊黃牛的生長(zhǎng)速度提供一個(gè)新的途徑。

Exosome是一類(lèi)由多種細(xì)胞分泌的、直徑為30～150 nm并具有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，在透射電鏡下呈圓形或杯狀磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)[4，8]。該試驗(yàn)中獲得的延邊黃牛與韓延牛的血液Exosome在電鏡觀察下均呈圓形或橢圓形的雙層膜小囊泡，直徑也均為30～100 nm，與以前報(bào)道結(jié)果相一致。

該試驗(yàn)用100 μL PBS(對(duì)照組)、100 μL延邊黃牛血液Exosome(100 ng/mL)和韓延牛血液Exosome(100 ng/mL)對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞進(jìn)行處理6 h，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分析延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH的表達(dá)。結(jié)果表明，韓延牛Exosome處理的延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH mRNA表達(dá)顯著高于延邊黃牛Exosome處理的垂體細(xì)胞。這說(shuō)明延邊黃牛血液Exosome抑制了延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH的mRNA表達(dá)。為了進(jìn)一步研究延邊黃牛和韓延牛血液Exosome對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH表達(dá)的影響，分別用延邊黃牛和韓延牛血液Exosome對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞進(jìn)行處理12、24和48 h后，收集培養(yǎng)液并對(duì)細(xì)胞上清液中GH含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，韓延牛血液Exosome處理組的垂體中GH的含量顯著高于延邊黃牛血液Exosome處理組。此結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)延邊黃牛血液Exosome抑制了延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH的表達(dá)，但具體抑制機(jī)制有待進(jìn)一步研究。據(jù)推測(cè)，這可能與Exosome中含有的miRNAs有關(guān)[9]。Qi等[10]研究發(fā)現(xiàn)ssc-let-7c可調(diào)控豬GH的分泌，同時(shí)還預(yù)測(cè)let-7i、miR-34a、miR-136和miR-326可能與GH的分泌也存在著密切的關(guān)系。該研究可為進(jìn)一步研究Exosome對(duì)延邊黃牛生長(zhǎng)調(diào)控的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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摘要[目的]從延邊黃牛和韓延牛血液中分離Exosome(外胞體)，研究2種外胞體對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH含量的影響。[方法]通過(guò)超高速離心等方法，從延邊黃牛和韓延牛血液中分離Exosome，并以100 ng/mL的濃度分別轉(zhuǎn)染給原代培養(yǎng)的延邊黃牛垂體細(xì)胞培養(yǎng)12、24和48 h，對(duì)細(xì)胞上清液中GH含量進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果] 電鏡下延邊黃牛與韓延牛血液Exosome均呈圓形或橢圓形的雙層膜小囊泡，直徑均為30～100 nm，膜結(jié)構(gòu)完整。韓延牛Exosome處理組的延邊黃牛垂體細(xì)胞GH mRNA表達(dá)顯著高于延邊黃牛Exosome處理組(P>0.05)。韓延牛血液Exosome處理組垂體中GH的含量顯著高于延邊黃牛血液Exosome處理組(P>0.05)。[結(jié)論]延邊黃牛和韓延牛血液中的Exosome對(duì)延邊黃牛垂體細(xì)胞中GH含量的影響有明顯差異。

關(guān)鍵詞延邊黃牛；韓延牛；血液Exosome；垂體細(xì)胞；GH

Effects of Blood Exosome in Yanbian Yellow Cattle and Hanyan Cattle on the GH Content in Pituitary Cells of Yanbian Yellow Cattle

GUAN Li-zeng, LOU An-gang, PIAO Ming-shu, CAI Jin-shun*(College of Agronomy, Yanbian University, Yanji, Jilin 133002)

Abstract[Objective] To study the effects of blood Exosome in Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle on the GH content in pituitary cells of Yanbian yellow cattle. [Method] Exosome was isolated from Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle by ultra high speed centrifugation method, and then was transfected to primary pituitary cell of Yanbian yellow cattle at a concentration of 100 ng/mL for 12, 24 and 48 h, respectively. Content of GH in cell supernatant was detected by kit. [Result] Electron microscope observation showed Exosomes from Yanbian cattle and Hanyan cattle blood were both a round or oval global double membrane vesicle. Their diameters were both 30-100 nm, and membrane structure was both complete. The expression of GH mRNA in the pituitary cells of Yanbian yellow cattle treated by Hanyan cattle Exosome was significantly higher than that treated by Yanbian yellow cattle Exosome(P>0.05).The content of GH in the pituitary of the Hanyan cattle group treated by blood Exosome was significantly higher than that of the Yanbian yellow cattle(P>0.05). [Conclusion] GH content in pituitary cells of Yanbian yellow cattle treated by blood Exosome of Yanbian yellow cattle shows significant differences with that treated by Hanyan cattle blood Exosome.

Key wordsYanbian yellow cattle; Hanyan cattle; Blood Exosome; Pituitary cells; GH

收稿日期2015-12-14

作者簡(jiǎn)介關(guān)立增(1974- )，男，吉林延吉人，講師，博士，從事基因表達(dá)與調(diào)控研究。*通訊作者，副教授，博士，從事動(dòng)物傳染病與預(yù)防研究。

中圖分類(lèi)號(hào)S 811.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)01-105-03