李松濤， 劉　江， 黃學(xué)石

(1. 承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德　067000;

2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 代謝病分子機(jī)制與藥物研究所，遼寧 沈陽(yáng)　110122)

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娃兒藤堿類(lèi)似物DCB-3501的全合成及其細(xì)胞毒性

李松濤1*， 劉江2， 黃學(xué)石2

(1. 承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德067000;

2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 代謝病分子機(jī)制與藥物研究所，遼寧 沈陽(yáng)110122)

摘要：以3,4-二甲氧基苯甲醛與3,4-二甲氧基苯乙酸為起始原料，經(jīng)Perkin縮合、自由基氧化偶聯(lián)反應(yīng)、Swern氧化、還原胺化及付克?；?步反應(yīng)全合成了娃兒藤堿類(lèi)似物DCB-3501，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和ESI-MS確證。體外細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果表明：DCB-3501對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、人胃癌細(xì)胞BGC-823、人肝癌細(xì)胞HepG-2、人宮頸癌細(xì)胞HeLa和人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460的IC50分別為20.0 μmol·L-1, 50.9 μmol·L-1, 2.1 μmol·L-1, 65.8 μmol·L-1和30.8 μmol·L-1。

關(guān)鍵詞：3,4-二甲氧基苯甲醛; 3,4-二甲氧基苯乙酸; 娃兒藤堿類(lèi)似物; DCB-3501； Perkin縮合; Swern氧化; 付克?；?； 全合成； 細(xì)胞毒性

娃兒藤堿(Tylophorine)及其類(lèi)似物(Chart 1)是從羅藦科娃兒藤屬和鵝絨藤屬等植物中提取分離到的一類(lèi)天然生物堿[1-2]。上世紀(jì)九十年代初，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所開(kāi)展了一項(xiàng)針對(duì)60種人腫瘤細(xì)胞系的體外增殖抑制活性篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明多種娃兒藤堿的天然產(chǎn)物具有潛在、廣譜的

Chart 1

Scheme 1

抗腫瘤活性，GI50可達(dá)到納摩級(jí)，有望成為新型抗腫瘤先導(dǎo)化合物。此后，該類(lèi)生物堿及其類(lèi)似物的化學(xué)合成、結(jié)構(gòu)修飾及抗腫瘤活性日益成為研究熱點(diǎn)[2-5]。

DCB-3501是Tylophorine C-14位氫被(R)-OH取代的類(lèi)似物(Chart 1)，由Rapoport H等[6]首次合成。該方法的關(guān)鍵步驟是利用谷氨酸二異丙酯與2,3,6,7-四甲氧基-9-菲醛反應(yīng)引入N-谷氨酸二異丙酯側(cè)鏈，該側(cè)鏈經(jīng)環(huán)化后得到E環(huán)，再進(jìn)一步經(jīng)水解與付克酰基化反應(yīng)構(gòu)建D環(huán)，最后D， E環(huán)上的羰基分別經(jīng)過(guò)還原得到DCB-3501。 Cheng等[7-8]研究結(jié)果表明DCB-3501對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2、鼻咽癌細(xì)胞KB均具有體外增殖抑制活性，EC50分別為(110±45)nmol·L-1和(106±84)nmol·L-1。 Wang等[9]發(fā)現(xiàn)DCB-3501對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、人白血病細(xì)胞HL60也表現(xiàn)出一定的增殖抑制活性。

本文以3,4-二甲氧基苯甲醛與3,4-二甲氧基苯乙酸為起始原料，經(jīng)Perkin縮合、自由基氧化偶聯(lián)反應(yīng)、Swern氧化、還原胺化及付克?；?步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了DCB-3501的全合成(Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和ESI-MS確證。并考察了其對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116等五種腫瘤細(xì)胞株的體外細(xì)胞毒性。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

Bruker ARX-300型或Bruker AV-600型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Finnigan LCQ型質(zhì)譜儀。

1.2　合成

(1)α-(3,4-二甲氧基苯基)-3,4-二甲氧基肉桂酸(1)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入3,4-二甲氧基苯甲醛1.7 g(10 mmol)， 3,4-二甲氧基苯乙酸1.9 g(10 mmol)，三乙胺3 mL和醋酸酐20 mL，攪拌下回流(140 ℃)反應(yīng)7 h。冷卻至室溫，加入水100 mL，回流30 min；冷卻至室溫，用乙酸乙酯(3×300 mL)萃取，合并萃取液，用飽和食鹽水洗滌至水層呈中性，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶得深黃色粉末固體1 3.1 g，收率90%；1H NMRδ: 3.47(s, 3H, OCH3), 3.81(s, 3H, OCH3), 3.84(s, 3H, OCH3), 3.89(s, 3H, OCH3), 6.55(d,J=1.8 Hz, 1H, ArH), 6.70(d,J=1.8 Hz, 1H, ArH), 6.72(d,J=8.5 Hz, 1H, ArH), 6.84(dd,J=8.2 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 6.85(dd,J=8.5 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 6.92(d,J=8.2 Hz, 1H, ArH), 7.86(s, 1H, C=CH), 12.44(s, 1H, CO2H); ESI-MSm/z: 343{[M-H]-}。

(2) 2,3,6,7-四甲氧基-9-菲酸(2)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入1 3.0 g(8.6 mmol)和無(wú)水二氯甲烷75 mL，攪拌使其溶解；氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入無(wú)水三氯化鐵5.8 g(36.7 mmol)，于室溫反應(yīng)8 h。加甲醇20 mL，攪拌10 min，減壓濃縮，加入甲醇20 mL，過(guò)濾，濾餅用甲醇(3×10 mL)洗滌，干燥得黃綠色固體2 2.1 g，收率70%；1H NMRδ: 3.90(s, 3H, OCH3), 3.91(s, 3H, OCH3), 4.06(s, 3H, OCH3), 4.11(s, 3H, OCH3), 7.55(s, 1H, ArH), 8.00(s, 1H, ArH), 8.03(s, 1H, ArH), 8.42(s, 1H, ArH), 8.55(s, 1H, ArH), 12.88(br s, 1H, CO2H)。

(3) 2,3,6,7-四甲氧基-9-菲醇(3)

冰鹽浴冷卻下，在2 1.78 g(5.2 mmol)的無(wú)水THF(100 mL)溶液中加入氫化鋰鋁1.19 g(31.2 mmol)，反應(yīng)30 min；回流(100 ℃)反應(yīng)2 h。冷卻至室溫，加入冰塊和飽和碳酸氫鈉溶液(100 mL)，攪拌10 min，分液，水相用THF(2×50 mL)萃取，合并有機(jī)相和萃取液，依次用飽和食鹽水(200 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=20 ∶1]純化得白色固體3 1.19 g，收率70%；1H NMRδ: 3.97(s, 3H, OCH3), 4.03(s, 3H, OCH3), 4.08(s, 3H, OCH3), 4.10(s, 3H, OCH3), 5.05(s, 2H, CH2), 7.10(s, 1H, ArH), 7.47(s, 1H, ArH), 7.48(s, 1H, ArH), 7.68(s, 1H, ArH), 7.74(s, 1H, ArH)。

(4) 2,3,6,7-四甲氧基-9-菲醛(4)的合成

將干式變的冷卻方式由自然風(fēng)冷（AN）改為強(qiáng)迫空氣冷卻（AF），即通過(guò)風(fēng)機(jī)將空氣強(qiáng)迫吹進(jìn)變壓器散熱氣道，增強(qiáng)氣道空氣對(duì)流。

在反應(yīng)瓶中加入無(wú)水二氯甲烷20 mL，丙酮-干冰浴冷卻，保持溫度在-78 ℃以下攪拌10 min，加入草酰氯1.6 mL(18.72 mmol)，反應(yīng)20 min；緩慢滴加二甲基亞砜3 mL(42 mmol)的無(wú)水二氯甲烷(20 mL)溶液，滴畢(20 min，保持溫度在-78 ℃)，反應(yīng)30 min；緩慢滴加3 1.0 g(3.04 mmol)的二氯甲烷(20 mL)/二甲基亞砜(1.5 mL)溶液，滴畢(30 min)，反應(yīng)30 min；滴入三乙胺11 mL(78 mmol)，滴畢(20 min)，繼續(xù)低溫反應(yīng)30 min。升至室溫，加入1 mol·L-1鹽酸100 mL，劇烈攪拌10 min，調(diào)節(jié)水層pH呈酸性，分出有機(jī)層，水層用二氯甲烷(2×50 mL)萃取，合并有機(jī)層和萃取液，用無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸干，用甲醇重結(jié)晶得黃色固體4 0.70 g,收率70%；1H NMRδ: 4.06(s, 3H, OCH3), 4.10(s, 3H, OCH3), 4.12(s, 3H, OCH3), 4.15(s, 3H, OCH3), 7.28(s, 1H, ArH), 7.72(s, 1H, ArH), 7.74(s, 1H, ArH), 8.01(s, 1H, ArH), 8.94(s, 1H, CHO)。

(5)N-(2,3,6,7-四甲氧基菲基-9-亞甲基)-L-脯氨酸(5)的合成

將L-脯氨酸431 mg(3.75 mmol)溶于甲醇(10 mL)中，加入甲醇/甲醇鈉溶液，調(diào)至pH≈7，攪拌下緩慢滴加4 500 mg(1.5 mmol)的二氯甲烷(30 mL)溶液，滴畢，反應(yīng)30 min，加入NaBH3CN 300 mg(4.5 mmol)，于室溫反應(yīng)20 h。減壓蒸干，經(jīng)硅膠柱層析(梯度洗脫劑：A=50 ∶1~1 ∶1)純化得白色固體5 0.61 g,收率60%；1H NMRδ: 1.91(m, 2H, CH2), 2.12(m, 2H, CH2), 2.99(d,J=12.0 Hz, 1H, ArCH2N), 3.39(m, 1H, CH2N), 3.47(m, 1H, CH2N), 3.90(s, 3H, OCH3), 4.02(s, 3H, OCH3), 4.07(s, 3H, OCH3), 4.17(s, 3H, OCH3), 4.52(m, 1H, CHN), 4.97(d,J=12.0 Hz, 1H, ArCH2N), 7.12(s, 1H, ArH), 7.53(s, 1H , ArH), 7.59(s, 1H, ArH), 7.64(s, 1H, ArH), 7.65(s, 1H, ArH); ESI-MSm/z: 426{[M+H]+}。

(6) DCB-3501的合成

在反應(yīng)瓶中加入5 220 mg(0.5 mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下于室溫加入多聚磷酸(PPA， 5 mL)，于105 ℃反應(yīng)5 h。冷卻至室溫，加入1 mol·L-1KOH溶液50 mL，調(diào)至pH 10，用二氯甲烷萃取，萃取液用等量飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑得黃褐色固體，用無(wú)水THF 10 mL溶解，攪拌下于室溫加入氫化鋰鋁50 mg(1.3 mmol)，反應(yīng)1 h。加入二氯甲烷(30 mL)和飽和碳酸鈉溶液(30 mL)，劇烈攪拌10 min，靜置，分離有機(jī)層，水相用二氯甲烷(2×50 mL)萃取，合并萃取液和有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸干后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=50 ∶1)純化得灰白色固體DCB-3501 40 mg，收率20%；1H NMRδ: 0.87(m, 1H, 12-H), 1.89(m, 1H, 13-H), 2.05(m, 1H, 12-H), 2.26(m, 1H, 13a-H), 2.34(m, 1H, 11-H), 2.40(m, 1H, 13-H), 3.00 (d,J=11.1 Hz, 1H, 9-H), 3.36(m, 1H, 11-H), 3.37 (d,J=11.1 Hz, 1H, 9-H), 3.80(s, 3H, OCH3), 4.08(s, 3H, OCH3), 4.10(s, 3H, OCH3), 4.14(s, 3H, OCH3), 4.86(br s, 1H, 14-H), 5.28(s, 1H, 14-OH), 6.08(s, 1H, ArH), 7.39(s, 1H, ArH), 7.59(s, 1H, ArH), 7.85(s,1H, ArH); ESI-MSm/z: 410{[M+H]+}。

1.3　體外細(xì)胞毒性測(cè)定

采用MTT法[10]測(cè)定DCB-3501對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、人胃癌細(xì)胞BGC-823、人肝癌細(xì)胞HepG-2、人宮頸癌細(xì)胞HeLa和人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460的體外細(xì)胞毒性，阿霉素為對(duì)照藥物。用DMSO溶解DCB-3501，用培養(yǎng)基稀釋制得六個(gè)不同濃度[(1.0, 0.33, 0.10, 0.033, 0.010和0.0033) mmol·L-1]溶液，分別取六種濃度的溶液10 μL加至含有90 μL培養(yǎng)基(約5 000個(gè)細(xì)胞)的板孔中，于37 ℃孵育72 h，每孔加入10 μL 的MTT溶液 (5 mg·mL-1)，于37 ℃孵育4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，在570 nm處，用酶標(biāo)儀測(cè)量每個(gè)孔的OD值，根據(jù)公式計(jì)算抑制率和相應(yīng)的IC50。

2結(jié)果與討論

2.1　合成

在將二苯乙烯類(lèi)衍生物合成菲環(huán)(即由1合成2)的過(guò)程中，我們首先使用三氟醋酸鉈介導(dǎo)二苯乙烯類(lèi)衍生物1關(guān)環(huán)[11-12]，通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件的探索優(yōu)化， 2的收率85%左右，但會(huì)形成菲環(huán)的多聚體；文獻(xiàn)[13]報(bào)道m(xù)-CPBA/TFA系統(tǒng)能夠有效介導(dǎo)二苯乙烯類(lèi)衍生物的氧化偶聯(lián)反應(yīng)，我們嘗試了該方法，沒(méi)有得到目標(biāo)關(guān)環(huán)產(chǎn)物。Wang等[14]采用過(guò)量的無(wú)水三氯化鐵介導(dǎo)二苯乙烯類(lèi)衍生物合成菲環(huán)，反應(yīng)條件溫和，后處理簡(jiǎn)便，本文選擇該方法合成2。

在嘗試將5應(yīng)用付克酰基化反應(yīng)合成吲哚里西丁時(shí)，本文分別使用路易斯酸無(wú)水AlCl3和無(wú)水FeCl3作為催化劑，但是均未得到目標(biāo)吲哚環(huán)關(guān)環(huán)產(chǎn)物(Scheme 2)，與Rapoport H等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

多聚磷酸(PPA)是一種常用的?；噭?，Chauncy B等[15]將N-菲-9-亞甲基-L-脯氨酸在PPA中加熱，L-脯氨酸的羧基與菲環(huán)發(fā)生付克?；磻?yīng)得到酮式中間體。參考該方法，我們通過(guò)摸索反應(yīng)條件使5在PPA的作用下反應(yīng)合成關(guān)鍵的酮式中間體。

Rapoport H等利用谷氨酸二異丙酯在菲環(huán)9-位引入N-谷氨酸二異丙酯側(cè)鏈，該側(cè)鏈經(jīng)環(huán)化后構(gòu)建DCB-3501的E環(huán)，再經(jīng)水解與付克?；磻?yīng)構(gòu)建D環(huán)，D、E環(huán)上的羰基分別經(jīng)過(guò)還原得到DCB-3501。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)2,3,6,7-四甲氧基-9-菲醛與L-脯氨酸反應(yīng)直接在菲環(huán)9-位引入E環(huán)，再經(jīng)付克?；磻?yīng)和一步羰基還原反應(yīng)得到DCB-3501，簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟。

Scheme 2

CompIC50/μmol·L-1HCT116BGC-823HepG-2HeLaH460DCB-350120.050.92.165.830.8 Adriamycinhydrochloride1.41.50.51.01.0

2.2　體外細(xì)胞毒性

DCB-3501對(duì)五種腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，DCB-3501對(duì)HepG-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性最強(qiáng)(IC50=2.1 μmol·L-1)，對(duì)HCT116等其他四種細(xì)胞具有一定的增殖抑制活性(IC50=20.0～65.8 μmol·L-1)，表明其對(duì)不同來(lái)源瘤株的敏感性存在差異，但對(duì)相應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性均弱于對(duì)照藥物阿霉素(IC50=0.5～1.4 μmol·L-1)。

3結(jié)論

以取代苯甲醛與苯乙酸為原料，經(jīng)7步反應(yīng)全合成了娃兒藤堿類(lèi)似物DCB-3501。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：DCB-3501對(duì)不同來(lái)源腫瘤細(xì)胞的敏感性存在差異，對(duì)HepG-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性最強(qiáng)(IC50=2.1 μmol·L-1)。

該研究工作為娃兒藤堿及其類(lèi)似物的抗腫瘤活性研究提供參考。

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·快遞論文·

Total Synthesis and Cytotoxicity of Tylophorine Analogue DCB-3501

LI Song-tao1*,LIU Jiang2,HUANG Xue-shi2

(1.Hebei Key Laboratory of Study and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Chengde Medical

University, Chengde 067000, China; 2. Institute of Metabolic Disease Research and Drug Development,

China Medical University, Shenyang 110122, China)

Abstract：The tylophorine analogue DCB-3501 was totally synthesized by a seven-step reaction including Perkin condensation, free radical oxidative coupling, Swern oxidation, reductive amination and Fridel-Crafts acylation, using 3,4-dimethoxy-benzaldehyde and 3,4-dimethoxy-phenylacetic acid as the raw materials. The structure was confirmed by1H NMR and ESI-MS. The in vitro cytotoxicity results showed that the IC50of DCB-3501 against human colon cancer cell HCT116, human gastric cancer cell BGC-823, human hepatic cancer cell HepG-2, human cervical cancer cell HeLa and human large-cell lung cancer cell H460 were 20.0 μmol·L-1, 50.9 μmol·L-1, 2.1 μmol·L-1, 65.8 μmol·L-1and 30.8 μmol·L-1, respectively.

Keywords：3,4-dimethoxy-benzaldehyde; 3,4-dimethoxy-phenylacetic acid; tylophorine analogue; DCB-3501; Perkin condensation; Swern oxidation; Fridel-Crafts acylation; total synthesis; cytotoxicity

中圖分類(lèi)號(hào)：O621.3; O626

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.01.15279

作者簡(jiǎn)介：李松濤(1983-)，漢族，遼寧朝陽(yáng)人，博士，助理研究員，主要從事有機(jī)合成化學(xué)研究。 Tel. 0314-2290640, E-mail: songtao-li@hotmail.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30600783)； 承德醫(yī)學(xué)院博士基金資助項(xiàng)目(201303)

收稿日期：2015-07-27