張文通 魏鳳 李峰 沈志強

摘 要：通過RA病原學(xué)研究、分子生物學(xué)研究、診斷方法研究、防治研究四個方面的闡述，了解目前鴨疫里氏桿菌病的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：鴨疫里氏桿菌??；研究進(jìn)展

中圖分類號：S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-1085（2016）02-0043-06

鴨疫里氏桿菌（Riemerella Aanatipestifer，RA）病，曾名鴨疫巴氏桿菌（Pasteurella AanatiPestifer）病，是家鴨、鵝、火雞及其它家禽和野禽的一種急性、接觸性、敗血性傳染病，又稱為新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥、鴨疫敗血癥和鴨傳染性漿膜炎。鴨疫里氏桿菌感染發(fā)病率可達(dá)10%～60%，死亡率為30%～90%，是造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟損失嚴(yán)重的傳染病之一[1]。到目前為止，美國、英國、西班牙、澳大利亞、加拿大、德國、新加坡、泰國、韓國等均有本病發(fā)生。我國，1982年郭璞玉等[2]首次報道北京郊區(qū)鴨場于1980～1981年曾發(fā)生過此病，并分離到了病原菌。隨后全國多個省份都相繼報道了此病。

1 RA病原學(xué)研究

1.1 分類地位 1932年美國學(xué)者Henderickson和Hilbert對病原菌進(jìn)行分離鑒定，并稱之為鴨疫斐佛氏菌（Pfeifferella anatiestlfer）[3]。1954年Bruner和Fabricant通過比較，建議采用鴨疫莫拉克氏菌（Moraxella anatipestifer）這一名稱[4]。此后，在第七版《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》中根據(jù)其形態(tài)與染色特性將其列入巴氏桿菌屬，命名鴨疫巴氏桿菌（Pasteurella AanatiPestifer）。1991年Rossau等對原來列入巴氏桿菌屬的鴨疫巴氏桿菌（Rasteorella anatipestifer，RA）與黃桿菌/噬纖維菌群的成員進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)它們具有較多的相似性[5]。1993年Segers等通過分析RA的rRNA（Segers et al.，1993），進(jìn)一步證實了以上觀點。但由于RA在蛋白質(zhì)及脂肪酸組成、培養(yǎng)特性、酶活性等許多方面又明顯不同于黃桿菌/噬纖維菌rRNA同源群中關(guān)系較近的其他細(xì)菌，因此Segers等提出將RA歸入黃桿菌/噬纖維菌rRNA同源群，并建議單列一屬，稱為里氏桿菌屬，其代表種為鴨疫里氏桿菌，并將該菌所引起的疾病命名為鴨疫里氏桿菌病[6]。

1.2 血清型 目前報道鴨疫里默氏桿菌共有21個血清型[7-8]，不同血清型之間缺乏交叉保護(hù)[9]，其中鴨疫里氏桿菌2型是國內(nèi)外被頻繁分離到的血清型。我國許多地區(qū)都有分離到本菌的報道，張大丙等證實國內(nèi)存在1、2、6、10、11、13和14共7種血清型[10]。

1.3 生物學(xué)特性 RA菌體呈桿狀或橢圓形，偶見個別長絲狀，多為單個，少數(shù)成雙或鏈狀排列。可形成莢膜，無芽孢，無鞭毛。革蘭氏染色陰性，印度墨汁染色可見莢膜著色，瑞氏染色時大部分細(xì)菌呈兩極著色特性[11]。韋強等通過電鏡首次觀察到了血清l、2型的RA的固體培養(yǎng)物經(jīng)負(fù)染或超薄切片后可觀察到約1/3的菌體具有特殊的贅生物形態(tài)結(jié)構(gòu)；其內(nèi)部有類似菌體的結(jié)構(gòu)，有一層類似于菌體的“細(xì)胞壁”，但較薄[12]。

本菌在巧克力瓊脂、血液瓊脂和胰酶大豆瓊脂中生長良好。多次繼代培養(yǎng)可在普通培養(yǎng)基上生長，在麥康凱瓊脂上不生長。在胰酶大豆瓊脂中添加0.05%酵母浸出物，5%新生牛血清以及含有5%～10%的CO2環(huán)境可促進(jìn)其生長。血液瓊脂上培養(yǎng)24h，形成邊緣整齊、透明、無色素的光滑型菌落，RA的最適生長溫度是37℃。

本菌不同的血清型，即使同一血清型的不同菌株的生化反應(yīng)也不盡相同?？偟膩碚f，不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，也不發(fā)酵半乳糖、乳糖、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、甘露糖和棉實糖。極少數(shù)菌株發(fā)酵麥芽糖和肌醇。硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、VP、甲基紅試驗、硫化氫產(chǎn)生、尿素分解均為陰性。氧化酶、觸酶試驗為陽性。多不溶血，多液化明膠[11]。

2 RA的分子生物學(xué)研究

目前，國內(nèi)外學(xué)者從16SrRNA、外膜蛋白、莢膜、質(zhì)粒、耐藥性、致病性及相關(guān)因子等方面開展了RA的分子生物學(xué)研究。Subramandam等對4株RA編碼16srRNA的基因序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，同時與產(chǎn)吲哚黃桿菌、粘黃桿菌等相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行了同源性分析，結(jié)果表明4株RA處于黃桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹上；對PCR擴增的16SrRNA基因經(jīng)限制片段長度多態(tài)性（RFLP）分析表明：即使是同一血清型的不同RA菌株，16SrRNA基因仍有差異[13]。Rimler等運用DNA指紋技術(shù)進(jìn)行了鴨疫里默氏菌DNA指紋圖譜的研究，用限制性核酸內(nèi)切酶HinfⅠ對從美國、英國、澳大利亞、加拿大、德國和以色列6個國家分離的89株RA進(jìn)行了DNA指紋圖譜分析，結(jié)果表明不同來源的RA其DNA指紋圖譜存在明顯差異，即使是同一地區(qū)同一禽類分離的RA菌株，其DNA指紋圖譜也有所不同[14]。

Chang等對60株RA的質(zhì)粒進(jìn)行了分子生物學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)77%的RA菌株至少帶有1個質(zhì)粒，60%的RA菌株含3.9kb的質(zhì)粒，12%的RA菌株含6.5kb和16.0kb的質(zhì)粒，5%的RA含2.0kb、16.0kb、18.0kb的質(zhì)粒；23%的RA菌株不帶質(zhì)粒。他們挑選了3.9kb的質(zhì)粒作DNA序列分析，發(fā)現(xiàn)G+C含量為27%，含3966bP和4個開放讀碼區(qū)（ORF）即vapDI、VapD2、RepAI、RepA2。RA質(zhì)粒的RepA讀碼區(qū)的上游有一富含AT的區(qū)段，并連有4個由2lbp組成的完全重復(fù)的區(qū)段和1個由20bp組成的不完全重復(fù)的區(qū)段。對含或不含質(zhì)粒的RA菌株進(jìn)行VapD1序列的PCR檢查，表明VapD1序列僅存在于含質(zhì)粒的RA菌株中[15]。

目前國內(nèi)外己經(jīng)對RA的一些免疫原性蛋白進(jìn)行了研究，蘇敬良等用提純的RA莢膜免疫7日齡北京雛鴨后，可100%抵抗同源菌株攻擊[16]。程安春等對流行于我國的l、2、4和5型RA外膜蛋白多肽的組成及免疫原性進(jìn)行了研究，試驗結(jié)果證實1型RA的44KDa、2型的40KDa、4型的75KDa和5型的39KDa外膜蛋白是主要的免疫原蛋白[17]。Subramaniam等對RA的一種優(yōu)勢免疫原性O(shè)mpA的特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)OmpA由外膜蛋白樣結(jié)構(gòu)構(gòu)成的羧基端保守區(qū)和一個氨基端可變區(qū)組成，這與其他一些革蘭氏陰性菌的OmpA結(jié)構(gòu)相似，所不同的是RA的OmpA具有6個EF一手銬結(jié)合域和2個PEST結(jié)構(gòu)域，這些基序的出現(xiàn)表明它們在外膜蛋白毒力方面有重要作用，而且編碼外膜蛋白的基因存在于RA標(biāo)準(zhǔn)株和所有血清型參照株中[18]。

劉穎等用PCR技術(shù)擴增26株鴨疫里默氏菌的部分螺旋酶gyrA序列，通過與大腸桿菌（ABA36537）比較氨基酸序列找到了對喹諾酮類抗生素耐藥菌株的基因突變熱點和突變規(guī)律[19]。

Weng等報道了一個3.9kb的質(zhì)粒pCFC1和一個5.6kb質(zhì)粒pCFC2，分子生物學(xué)研究表明，質(zhì)粒pCFC2很可能與RA的致病性相關(guān)[20]。Crasta等首次對RA的CAMP溶血素進(jìn)行研究，鑒定出CAMP溶血素決定簇所需的最小DNA片段為3566bp，含一個l026bp的ORF。將CAMP基因cam經(jīng)PCR擴增后克隆到E.coli M15表達(dá)CAMP溶血素，SDS-PAGE和Western-blot分析證實了重組菌表達(dá)一種37KDa的蛋白，該蛋白具有免疫原性，能協(xié)同其它細(xì)菌產(chǎn)生溶血作用，可能與致病性有關(guān)[21]。

3 RA診斷學(xué)研究

3.1 RA的流行病學(xué)研究 本病主要感染家鴨，曾有報道鵝、火雞自然暴發(fā)鴨疫里默氏桿菌病，從雛雞、珍珠雞、鶴鶉、澳州長尾錐和其它水禽中也曾分離到鴨疫里默氏桿菌。1～8周齡的鴨都易感，但尤以2～3周齡的小鴨最易感。

本病一年四季均可發(fā)生，但以冬春季發(fā)病最多。可通過污染的飼料、飲水、飛沫、塵土經(jīng)呼吸道、消化道、刺破的足部皮膚的傷口、蚊子叮咬等多種途徑傳播，庫蚊是RA的重要傳播媒介。本病潛伏期的長短與菌株的毒力、感染途徑以及應(yīng)激等因素有關(guān)。

3.2 臨床診斷及病理變化 病鴨精神沉郁，食欲下降，縮頭垂翅，羽毛蓬松，呼吸困難，閉目，眼鼻分泌物增多，呼吸困難，腿軟，走動困難，多伏地。部分病鴨關(guān)節(jié)腫大，跛行或頭頸扭斜，并伴有頭部震顫等神經(jīng)癥狀，扎堆，拉黃色或黃綠色稀糞。2～3d內(nèi)死亡，死前出現(xiàn)痙攣、搖頭、角弓反張等癥狀。病死鴨剖檢發(fā)現(xiàn)：心包變厚，內(nèi)有大量含纖維素性絮狀滲出液體；心包膜和胃腸粘膜表面有厚薄不均的纖維蛋白粘附；心外膜、心冠肝、脾、胰、肌胃及腸管出血明顯；肝腫大呈暗紅色或土黃色，表面大小不一的壞死灶；鼻腔有多量的粘液，關(guān)節(jié)面粗糙，附有干酪樣物質(zhì)，關(guān)節(jié)變厚，內(nèi)有大量淡紅色液體；腦膜、腦組織充血、出血。

3.3 診斷方法研究

3.3.1 分離鑒定 適于分離的病料有病鴨的心血、腦、氣囊、肝和病變的滲出物。根據(jù)其在普通培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上不生長，及其培養(yǎng)和生長特性、生化實驗結(jié)果等可作出判定。

3.3.2 瓊脂凝膠免疫擴散試驗 瓊脂凝膠免疫擴散試驗（Agargeli～unodiffosion，AGID）簡稱瓊擴試驗，是在瓊脂凝膠中進(jìn)行的抗原抗體免疫沉淀反應(yīng)，可用于血清學(xué)定型，簡便快捷。

3.3.3 凝集試驗 凝集試驗分為玻片凝集試驗和試管凝集試驗兩種。應(yīng)用玻片凝集試驗可以實現(xiàn)細(xì)菌的快速鑒定，并對分離到的菌株的血清型進(jìn)行大范圍的粗略篩選，但要準(zhǔn)確定型還必須依賴于試管凝集試驗。試管凝集試驗可以更準(zhǔn)確的進(jìn)行血清型鑒定、血清流行病學(xué)調(diào)查以及抗體效價檢測。當(dāng)供試菌與參照菌的凝集效價相等或僅差l個滴度時，一般可認(rèn)為二者屬于相同的血清型；當(dāng)凝集效價相差3個或3個以上滴度時，一般可認(rèn)為該二者屬于不同的血清型[22]。

3.3.4 熒光抗體法 郭玉璞等應(yīng)用直接熒光抗體法檢測急性病例，涂片標(biāo)本上可見黑暗的背景有帶綠色熒光的菌體，本法特異性強，快而簡便，效果良好[23]。朱琪等建立間接免疫熒光抗體試驗，對發(fā)病小鴨的檢測結(jié)果表明，鴨腦組織鼻竇及肝臟等細(xì)菌檢出率較高[24]。

3.3.5 PCR快速檢測法 胡清海等根據(jù)已發(fā)表的鴨疫里默菌15型CVLI10/89株編碼42KDa主要外膜蛋白的基因序列，在國內(nèi)外首次成功地建立了運用一對引物檢測出不同鴨疫里默菌的PCR方法，可以用于該菌的快速診斷和快速鑒別診斷以及流行病學(xué)調(diào)查[25]。2006年曲豐發(fā)等建立了基于鴨疫里氏桿菌16SrRNA PCR檢測方法[26]。2007年楊苗等根據(jù)鴨疫里氏桿菌16SrRNA基因保守序列設(shè)計特異引物建立了一種檢測鴨疫里氏桿菌的PCR方法[27]。楊建遠(yuǎn)等根據(jù)GenBank中25株RA的外膜蛋白A（OmpA）基因序列，在其高度保守區(qū)設(shè)計了一對特異性引物，建立了一種檢測鴨疫里氏桿菌的PCR方法[28]。2010年馮金牛等利用16SrRNA保守序列設(shè)計特異引物PCR擴增鑒定鴨疫里氏桿菌，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與GenBank上分布的RA的16SrRNA同源性達(dá)到99.99%[29]。

3.3.6 間接免疫酶組織化學(xué)法 劉維平等應(yīng)用鴨源血清1型鴨疫里默菌作為抗原，免疫兔制備兔抗RA的lgG并加以純化，建立了檢測雛鴨感染鴨疫里默菌的間接免疫酶組織化學(xué)法（indirect inununo histochemical technique），在對雛鴨人工感染RA病例和疑似病例的各組織器官進(jìn)行檢測中發(fā)現(xiàn)，RA抗原分布于細(xì)胞漿、組織間隙和血液[30]。

3.3.7 間接ELISA法 張鶴曉等用裂解的l型RA菌體作為包被抗原，建立間接ELISA方法，檢測鴨血清中抗RA抗體[31]。胡清海等用脂多糖（LPS）作為包被抗原，建立了間接ELISA方法，人工感染RA的鴨在感染72h即可檢出抗體[32]。程安春等用超聲裂解法分別制備2型RA的裂解物包被酶標(biāo)版，成功的制備了分別針對這四種血清型的ELISA方法[33]。Huang等使用一種被推測為RA表面抗原P45末端片段41KDa的重組蛋白rP45N'作為包被抗原建立的間接ELISA方法能成功的檢測出1、10、15、19四種血清型的RA和ATCC11845菌株免疫鴨的血清[34]。周祖濤用大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白OmpA建立了RA抗體OmpA-ELISA檢測方法，試驗結(jié)果證實能夠應(yīng)用于臨床RA抗體檢測[35]。

4 RA防治研究

加強飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生是最重要的預(yù)防措施。做好鴨舍消毒和通風(fēng)，冬天要做好保暖等措施。在此基礎(chǔ)上還包括藥物防治和疫苗防治。

4.1 藥物防治 鴨RA病藥物防治主要為抗生素和磺胺類藥物，但RA對抗生素的敏感性各地報道不盡相同。劉穎等對全國各地85株RA菌進(jìn)行藥敏檢測發(fā)現(xiàn)，100%對氨節(jié)西林、阿莫西林等青霉毒類藥物和頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢噻吩等頭孢菌素類、西環(huán)素等四環(huán)素類藥物敏感[36]。鐘登科等[37]通過藥敏試驗證實鴨疫里氏桿菌1型對頭孢曲松、復(fù)方新諾明高度敏感。

4.2 疫苗防治 由于不同血清型對異型強毒沒有保護(hù)力或保護(hù)力很低，所以有必要做好RA血清型的監(jiān)測工作，有利于生產(chǎn)出針對性強的疫苗。目前國內(nèi)外RA的疫苗類型有以下幾種：

4.2.1 RA滅活菌苗的研究 張鶴曉等用間接ELISA檢測不同疫苗在免疫鴨后抗體消長規(guī)律發(fā)現(xiàn)油佐劑的效果最好，甲醛滅活苗二次免疫次之，甲醛滅活苗一次免疫效果最差[31]。黃渝等比較了滅活鋁膠苗、滅活蜂膠苗以及滅活油乳劑苗的免疫效果，結(jié)果表明三種不同佐劑菌苗的保護(hù)效果逐漸增強，但同時這三種佐劑的副作用也逐漸增加[38]。

4.2.2 RA弱毒活菌苗的研究 Sandhu等選擇1、2、5型的RA自然弱毒株，并經(jīng)鴨體回傳10代無毒力返強，用這些弱毒株研制了三價活毒苗，經(jīng)飲水和氣霧免疫1日齡雛鴨，對攻毒和野外感染均有較好的保護(hù)效果[39]。Higgins等在研究不同RA疫苗的免疫應(yīng)答機制時，選用分離的1型RA野毒株，經(jīng)連續(xù)62代的肉湯和血瓊脂培養(yǎng)基傳代，篩選出弱毒株，通過皮下注射、氣霧和飲水途徑免疫雛鴨，應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測血清抗體，通過淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移實驗（LTT）研究其細(xì)胞免疫應(yīng)答，結(jié)果該弱毒菌苗不僅產(chǎn)生長時間高水平抗體，而且引發(fā)了較強的細(xì)胞免疫應(yīng)答[40]。

4.2.3 亞單位疫苗 林世棠等也對亞單位成分（莢膜和外膜蛋白）進(jìn)行了提取并測定其免疫原性，結(jié)果表明RA亞單位成分免疫保護(hù)效果與提取物中的蛋白濃度呈正相關(guān)[41]。Pathanasophon用1、19型RA培養(yǎng)基無細(xì)胞濾液（Cell-free CultureFiltrate，CCF）免疫雛鴨后能很好地抵抗同型菌株的攻擊，CCF制作的疫苗有免疫原性，可能是濾液中的亞單位成分在發(fā)揮作用，因為RA在培養(yǎng)過程中有部分莢膜要分離菌體[42]。蘇敬良采用十六烷基二甲醛澳化按（CTAB）提取出1型RA的莢膜成分，其粗提物與純化物免疫雛鴨后對同型菌株的攻毒保護(hù)率分別為90%和70%[43]。呂敏娜等證實，主要成分為蛋白質(zhì)多糖復(fù)合物的可溶性莢膜抗原較全菌滅活苗有著更好的免疫效果[44]。蘇敬良等提取了l型RA的OmpA，通過研究也證明RA外膜蛋白是具有良好免疫保護(hù)效果的一種亞單位成分[45]。

4.2.4 改進(jìn)的液體培養(yǎng)和鴨胚培養(yǎng)工藝苗 鮑國連等用從浙江省發(fā)病鴨廠病死鴨中分離鑒定的RA-J、RA-L菌株研制疫苗，采用改進(jìn)的液體和鴨胚培養(yǎng)工藝進(jìn)行增菌培養(yǎng)，制備的疫苗有較高的保護(hù)率。另外，他們還發(fā)現(xiàn)疫苗中加入左旋咪唑作為免疫增強劑，可促進(jìn)外周免疫活性細(xì)胞功能，誘導(dǎo)早期T細(xì)胞分化成熟，促進(jìn)淋巴因子產(chǎn)生，從而增強免疫功能[46]。

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Abstract：By etiology， molecular biology， diagnostic methods， revention research of RA described in four areas， understand the current duck anatipestifer disease research.

Key words：Riemerella anatipestifer； Research