韓建文 申茂欣 蔡聯(lián)燊 楚電峰 李凱善 夏娜 杜元釗

摘 要：鴨瘟雞胚化弱毒活疫苗與鴨坦布蘇病毒病活疫苗通過肌肉注射途徑，同時接種21日齡健康易感肉鴨，檢測兩種活疫苗聯(lián)合免疫的安全性和免疫效力。將兩種活疫苗同時免疫雛鴨，免疫后14d檢測血清抗體值，并在14d時采用鴨瘟強毒和鴨坦布蘇病毒強毒株同時攻毒，觀察試驗組與對照組的攻毒保護情況。結(jié)果表明：兩種活疫苗聯(lián)合免疫健康易感雛鴨后，血清抗體上升快，可同時抵御鴨瘟強毒與鴨坦布蘇病毒強毒株的攻擊，保護效果良好。結(jié)論：鴨瘟與鴨坦布蘇病毒病活疫苗聯(lián)合免疫，對雛鴨安全，免疫保護效果好，避免多次免疫對雛鴨帶來的應(yīng)激反應(yīng)，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。

關(guān)鍵詞：鴨瘟；鴨坦布蘇病毒；聯(lián)合免疫

中圖分類號：S858.322.4 文獻標(biāo)識碼：B 文章編號：1673-1085（2016）02-0037-06

鴨瘟是由鴨瘟病毒引起的一種急性接觸性傳染病，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的最重要疾病之一，該病流行廣泛，傳播迅速，其特征為血管破壞、組織出血、淋巴器官損傷和實質(zhì)器官變性。病鴨體溫升高，兩腿麻痹、下痢、流淚和部分病鴨頭頸腫大；食道粘膜有小出血點，并有灰黃色假膜覆蓋或潰瘍，泄殖腔粘膜充血、出血、水腫和假膜覆蓋[1]。早在1923年荷蘭已有鴨瘟流行，以后在印度、比利時、意大利、英國、法國、德國和加拿大也有發(fā)現(xiàn)，1967年在美國東海岸流行，稱為鴨病毒性腸炎（Duck virus enteritis，DVE），我國1957年首次報道本病，目前我國采用的鴨瘟雞胚化弱毒活疫苗保護雛鴨免受強毒攻擊，效果良好。鴨坦布蘇病毒病是新發(fā)現(xiàn)的一種以蛋鴨產(chǎn)蛋下降為主要特征的傳染病，目前尚沒有商品化的疫苗可預(yù)防和控制該病。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所聯(lián)合青島易邦生物工程有限公司最新研制的鴨坦布蘇病毒弱毒活疫苗（FX2010-180P 株），能有效保護雛鴨抵御強毒攻擊，且對雛鴨安全，無任何免疫副反應(yīng)[2]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RNAiso Plus、RNA酶抑制劑（RRI）、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自大連寶生物（Takara）；PCR Mix（廣州東盛生物科技有限公司）；75%乙醇（用DEPC處理過的水配制）、無RNase的水、分析純的氯仿、異丙醇和乙醇；鴨坦布蘇病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所提供。

1.2 毒種和細胞 鴨坦布蘇病毒疫苗毒（FX2010-180P株）、檢驗用毒（FX2010株）及DF1細胞系由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所提供；鴨瘟雞胚化弱毒株和鴨瘟檢驗用強毒由青島易邦生物工程有限公司提供。

1.3 引物設(shè)計[4] 根據(jù)坦布蘇病毒（FX2010）E基因序列設(shè)計兩對特異性的重疊引物：

P1： 5'-AGACTGCTGGTGCAATGAGAC-3'；

P2： 5'-CGGTACCATAATCCTCCATCTCAGC-3'；

P3： 5'-CATAGGCTGGAATCTGGGAAC-3'；

P4： 5'-TCTGGATTCTGTCGTCACGTC-3'引物由上海Invitrogen公司合成，用DEPC水稀釋至終濃度為10μmol/L，分裝后凍存于-20℃。

1.4 病毒RNA的提取 取1.5ml Eppendorf管，向其內(nèi)加入500μl待檢病毒液、800μl Trizol（Invitrogen），靜置5min；加入0.2ml氯仿，振蕩15S，靜置2～3min；4℃離心10min，吸取上清并加入等體積的異丙醇，沉淀10min；4℃ 10800×g離心10min，棄上清，用75%酒精清洗沉淀，混勻后，10800×g離心10min；倒掉上清，RNA自然干燥，用20μl DEPC水溶解RNA。

1.5 反轉(zhuǎn)錄 將5μl RNA提取液與2μl Random 9（TaKaRa）混勻，70℃保溫10min，迅速冰浴2min，然后分別加入4μl 5×AMV Buffer、1μl RRI、1μl AMV（Takara）、lμl 10μmol/L dNTP、6μl DEPC水，共20μl，混勻后30℃保溫10min，42℃ lh，75℃ 10min。

1.6 套式RT-PCR方法的建立 第一輪PCR采用25μl反應(yīng)體系：l2.5μl PCR Mix，1μl P1（10 μmol/L），lμl P2（10μmol/L），1μl cDNA模板，滅菌ddH2O補加至25μl。置于PCR儀中，94℃預(yù)變性4min；94℃變性30S，53℃退火30S，72℃延伸lmin，進行25個循環(huán)；最后72℃延伸10min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。第二輪PCR采用25μl體系：取第一輪PCR反應(yīng)液1μl為模板，12.5μl PCR Mix、lμl P3（10μmol/L）、lμl P4（10μmol/L），滅菌ddH2O補加至25μlL，置于PCR儀中。94℃預(yù)變性4min；94℃變形30S，53℃退火30S，72℃延伸30S，進行25個循環(huán)；最后72℃延伸10min。1.0%瓊脂糖電泳，陽性樣品應(yīng)該出現(xiàn)299bp特異性條帶，并用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

1.7 試驗動物 SPF胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司；21日齡商品肉鴨購自壽光某養(yǎng)殖場。

1.8 活疫苗的制備

1.8.1 鴨瘟活疫苗制備 鴨瘟雞胚化弱毒株用滅菌PBS（0.01mol/L，pH7.2）100倍稀釋后經(jīng)過絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚，0.2ml/枚，37℃孵育，收集48～120h死亡的雞胚，置2～8℃冷卻后，收獲死亡胎兒，經(jīng)研磨、凍融及80目濾網(wǎng)過濾后上清液加入一定比例的5%蔗糖脫脂奶穩(wěn)定劑凍干制備1000羽/瓶規(guī)格的疫苗。

1.8.2 鴨坦布蘇病毒病活疫苗制備 鴨坦布蘇病毒疫苗毒（FX2010-180P株）接種單層原代雞胚成纖維細胞，37℃孵育，待細胞出現(xiàn)70%以上CPE時，收獲病毒液，加一定比例的明膠蔗糖保護劑凍干制備200羽/瓶規(guī)格的疫苗。

1.9 疫苗安全性觀察 32只21日齡商品肉鴨隨機分成4組，8只/組，分別標(biāo)記為A、B、C、D組，按如下分組進行免疫，免疫后連續(xù)觀察14d，記錄試驗鴨采食、精神狀態(tài)及14d后剖檢臟器的病變情況，見表1。

1.10 免疫與攻毒 將43只21日齡經(jīng)過檢測鴨坦布蘇及鴨瘟抗原、抗體均陰性的商品肉鴨隨機分成4組，分別標(biāo)記為E、F、G、H組，按如下分組進行編號和免疫，分別于免疫前和免疫后14d，腳跟靜脈釆血監(jiān)測抗體水平，并于免疫后14d按試驗分組分別攻擊相應(yīng)毒株，持續(xù)觀察16d，記錄試驗鴨采食、精神狀況。其中攻擊鴨坦布蘇強毒的試驗鴨（連同對照組）從攻毒后第4天開始每隔3d采血2只并處死取脾、肺、腎及腦部臟器進行病毒分離，而攻擊鴨瘟組在攻毒結(jié)束采集脾臟和腦部組織進行病毒分離和PCR檢測，見表2。

1.11 鴨坦布蘇病毒PCR檢測 將采的脾臟按1g加1ml PBS的比例研磨，按1.4～1.6操作進行PCR檢測。

1.12 病毒分離 將同一試驗動物采集臟器組織混合研磨，4℃ 8000rpm離心10min取上清，按終濃度100IU/ml加入青鏈霉素，其中鴨瘟攻毒組處理后的組織液經(jīng)過絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚，每個樣品接種3枚，0.2ml/枚，37℃孵育120h，對未死亡雞胚進行盲傳一代，觀察雞胚死亡情況；鴨坦布蘇病毒攻毒組處理的組織液接種DF1細胞進行病毒分離，將70%長滿的48孔細胞單層棄液后用無血清DMEM清洗3遍，每孔加入待檢組織毒10μl，每個樣品加3孔，37℃細胞培養(yǎng)箱感作1.5h，每孔補加2%胎牛血清DMEM200μl，培養(yǎng)6d，盲傳2代觀察細胞病變情況。

2 結(jié)果

2.1 試驗疫苗質(zhì)量檢測 鴨瘟活疫苗：104.13ELD50/羽[3]，鴨坦布蘇毒活疫苗：104.0TCID50/羽。

2.2 疫苗安全性觀察結(jié)果 從表3“疫苗安全性觀察結(jié)果”和表4“安檢動物剖檢結(jié)果”來看，鴨瘟活疫苗和鴨坦布蘇病活疫苗無論單獨使用還是兩者聯(lián)合使用于21日齡商品肉鴨，均未對商品肉鴨造成采食、精神狀態(tài)以及內(nèi)部臟器等的損害，說明兩種疫苗聯(lián)合使用是安全的。

2.3 免疫與攻毒前后鴨坦布蘇抗體監(jiān)測 從表5“免疫與攻毒前后鴨坦布蘇抗體檢測結(jié)果”來看，試驗鴨在經(jīng)歷含鴨坦布蘇病活疫苗免疫及鴨坦布蘇強毒攻擊前后，鴨坦布蘇ELISA抗體阻斷率均有不同程度的升高，其中F組（鴨坦布蘇病活疫苗單苗）與G組（鴨坦布蘇病活疫苗+鴨瘟活疫苗聯(lián)合使用）在免疫前后ELISA抗體阻斷率雖然均為全部轉(zhuǎn)陽，但阻斷率為G組優(yōu)于F組；而經(jīng)過鴨坦布蘇強毒攻擊14d后，H組ELISA抗體阻斷率上升幅度最高，相對而言G組上升幅度低于其他各組，說明鴨坦布蘇病活疫苗+鴨瘟活疫苗兩種疫苗聯(lián)合使用不但不相互抑制反而起到互補作用。

2.4 攻毒觀察結(jié)果 從表6“鴨瘟攻毒組攻毒后觀察結(jié)果”和表7“鴨坦布蘇攻毒組攻毒后觀察結(jié)果”來看，鴨瘟活疫苗和鴨坦布蘇病活疫苗無論單獨使用還是兩者聯(lián)合使用，均能耐受鴨瘟和鴨坦布蘇病毒強毒株的攻擊，均未表現(xiàn)出特異性臨床癥狀，攻擊鴨瘟強毒對照組試驗動物（H1～H4）從攻毒后第5天開始出現(xiàn)發(fā)病或死亡現(xiàn)象并于第9天全部死亡；攻擊鴨坦布蘇強毒對照組試驗動物（H5～H14）從攻毒后第2天開始出現(xiàn)共濟失調(diào)現(xiàn)象并持續(xù)到第9天，累計發(fā)病比例達9/10（90%）。

2.5 病毒分離結(jié)果 從表8“鴨瘟攻毒組病毒分離結(jié)果”和表9“鴨坦布蘇病毒攻毒組病毒分離結(jié)果”來看，無論兩種疫苗單獨使用還是聯(lián)合使用，免疫組攻毒后均不能從臟器中分離到病毒，而攻毒對照組只有鴨坦布蘇對照組有1只未分離到病毒外其余均分離到病毒。

2.6 鴨坦布蘇攻毒組臟器PCR檢測 見圖1。從鴨坦布蘇病毒攻毒組攻毒后脾臟含毒PCR檢測結(jié)果來看對照組除1只（H13）外其余發(fā)病個體均檢測到病毒，而鴨坦布蘇單苗組和鴨瘟與鴨坦布蘇聯(lián)合免疫組在攻毒后7內(nèi)檢測到病毒但7d以后無法檢測。結(jié)合病毒分離結(jié)果，表明該檢測毒不具活性，無法進行病毒復(fù)制。

3 討論

3.1 疫苗安全性 突出兩種疫苗聯(lián)合免疫對肉鴨不產(chǎn)生副反應(yīng)。

在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，疫苗的安全性尤為重要，疫苗的安全性極大地限制了疫苗的使用。在本研究中，對21日齡商品肉鴨免疫鴨瘟活疫苗與鴨坦布蘇病活疫苗，觀察肉鴨所產(chǎn)生的副反應(yīng)，結(jié)果表明：聯(lián)合免疫這兩種疫苗，并不會產(chǎn)生不良副反應(yīng)。具有單獨免疫的安全性。這為鴨瘟活疫苗與鴨坦布蘇病活疫苗兩種疫苗的聯(lián)合免疫奠定基礎(chǔ)。

3.2 疫苗聯(lián)合免疫作用 在疫苗安全性得到保證的前提下，保證免疫效果是疫苗使用的又一重要目標(biāo)。鴨瘟活疫苗與鴨坦布蘇病活疫苗兩種疫苗聯(lián)合免疫，從血清抗體結(jié)果上來看，高于單獨免疫的抗體。并且對鴨坦布蘇攻毒后脾臟含毒PCR檢測及病毒分離結(jié)果來看，聯(lián)合免疫有助于疫苗抗體提升。這說明，聯(lián)合免疫這兩種疫苗，減少了免疫次數(shù)，但是卻能獲得比單獨免疫更高的抗體水平。

3.3 客戶的使用選擇 疫苗的宗旨是安全、有效、方便。本研究中，我們對比了聯(lián)合免疫鴨瘟活疫苗與鴨坦布蘇病活疫苗。該方法既保證了使用的安全性，又提高了抗體水平，減少了免疫次數(shù)，真正做到了安全、有效、方便。為水禽養(yǎng)殖戶在鴨瘟和鴨坦布蘇病毒病的預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻：

[1] 蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，第四版2001：330-333.

[2] 吳曉剛，高旭元，余磊，等.鴨坦布蘇病毒活疫苗（FX2010-180P株）毒種保存期的研究[J].中國動物傳染病學(xué)報，201422（3）：14-18.

[3] 陳樨，陳晟生.鴨瘟活疫苗雞胚效檢與免疫攻毒保護的平行關(guān)系[J].福建畜牧獸醫(yī)，2010，32（6）：29-30.

[4] 顏丕熙，李國新，吳曉剛，等.應(yīng)用套式RT-PCR快速檢測鴨坦布蘇病毒[J].中國動物傳染病學(xué)報，2011，19（3）：34-37.