徐自強(qiáng) 張 巖 沈龍捷

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 浙江 溫州 325000)

番茄紅素改善移植血管內(nèi)皮功能

徐自強(qiáng) 張 巖 沈龍捷

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 浙江 溫州 325000)

目的 探討番茄紅素對(duì)大鼠移植血管內(nèi)皮功能的改善作用。方法 實(shí)驗(yàn)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組，Lewis 大鼠接受Brown-Norway(BN)大鼠腹主動(dòng)脈移植；番茄紅素干預(yù)組(30 mg·kg-1·d-1)，Lewis 大鼠接受BN 大鼠腹主動(dòng)脈移植。于移植后28 d取移植動(dòng)脈,進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察、測(cè)量?jī)?nèi)膜厚度，免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)iNOS和ICAM-1表達(dá)。收集各組血漿， ELISA檢測(cè)cGMP濃度。結(jié)果 各組血管內(nèi)膜均出現(xiàn)增厚；番茄紅素干預(yù)組血管內(nèi)膜增厚與實(shí)驗(yàn)組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示, 與實(shí)驗(yàn)組相比, 番茄紅素干預(yù)組移植動(dòng)脈iNOS表達(dá)增高(P<0.05)。結(jié)論 番茄紅素通過調(diào)控NOS通路，改善內(nèi)皮功能，緩解移植動(dòng)脈的纖維化進(jìn)程以及內(nèi)膜的增生。關(guān)鍵詞：番茄紅素；移植物閉塞；移植

近年來，移植物的近期存活率已顯著改善。然而，移植物長(zhǎng)期存活率并沒有明顯提高，這主要是由慢性排斥反應(yīng)導(dǎo)致。移植物慢性排斥反應(yīng)共同病理學(xué)特征是血管病變。在移植物血管病的發(fā)生發(fā)展中，早期血管內(nèi)皮受損是導(dǎo)致移植物血管壁結(jié)構(gòu)改變和增殖的始動(dòng)因素[1]。番茄紅素(Lycopene, Lyc)是最有效的單線態(tài)氧滅活劑[2]。Lyc具有血管內(nèi)皮保護(hù)和抗血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。本研究旨在探討Lyc對(duì)早期的慢性移植物血管病變的影響和可能機(jī)制，為營(yíng)養(yǎng)干預(yù)防治慢性排斥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

供體為雄性 Brown-Norway(BN)和Lewis大鼠各16只，體質(zhì)量200～250 g。大鼠環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供。兔抗iNOS單克隆抗體和兔抗ICAM-1單克隆抗體均購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。番茄紅素為美國(guó)赫力仕公司產(chǎn)品。

1.2 大鼠腹主動(dòng)脈移植模型建立

切取供體大鼠腹主動(dòng)脈1.0～1.5 cm。受體大鼠取腹正中切口，暴露腹腔，于腎動(dòng)脈分支下、髂動(dòng)脈分支上分離腹主動(dòng)脈，無創(chuàng)血管夾夾閉后，離斷腹主動(dòng)脈，用10～0血管縫合線將供鼠離體血管與受鼠腹主動(dòng)脈端端縫合。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)共分兩組。移植實(shí)驗(yàn)組：以BN大鼠為供體，Lews大鼠為受體，共8只；移植Lyc干預(yù)組：以BN大鼠為供體，Lews大鼠為受體，共8只，手術(shù)當(dāng)天開始使用Lyc灌胃，30 mg·kg-1·d-1。術(shù)后 4周處死受體。取出移植動(dòng)脈用于病理學(xué)檢查及免疫組化檢測(cè)。收集血漿檢測(cè)環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)濃度。

1.4 移植動(dòng)脈組織病理學(xué)變化的觀察

切取大鼠的移植動(dòng)脈用10%甲醛固定后石蠟包埋、切片，行HE染色。應(yīng)用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)(JD-801型，江蘇捷達(dá))觀察移植動(dòng)脈的病理變化情況。每個(gè)標(biāo)本在高倍視野下隨機(jī)取5個(gè)視野，量取移植動(dòng)脈內(nèi)膜和中膜厚度，測(cè)量?jī)烧弑戎怠?/p>

1.5 外周血漿cGMP的檢測(cè)

大鼠血漿cGMP的含量測(cè)定，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA法)檢測(cè)。所有操作均按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 iNOs和ICAM-1表達(dá)

移植動(dòng)脈經(jīng)甲醛固定、包埋，4 μm切片。二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，3%過氧化氫室溫20 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，兔血清封閉20 min。甩干后滴加兔抗iNOs單克隆抗體(1：200稀釋)和ICAM-1單克隆抗體(1：100稀釋)，陰性對(duì)照以PBS代替。生物素標(biāo)記羊抗兔二抗(1：100稀釋，37 ℃孵育2 h)，每步之間均以PBS洗滌(5 min×3次)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后脫水封固鏡檢。每張切片在400倍光鏡下隨機(jī)采集5個(gè)不重疊視野，棕黃色為陽性染色區(qū)，采用圖像定量分析系統(tǒng)測(cè)量每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)表現(xiàn)

移植實(shí)驗(yàn)組和Lyc干預(yù)組術(shù)后4周出現(xiàn)典型的移植相關(guān)動(dòng)脈硬化，內(nèi)膜呈增生，管腔狹窄，新生內(nèi)膜見大量纖維細(xì)胞增生，內(nèi)膜可見單核細(xì)胞浸潤(rùn)。但干預(yù)組內(nèi)膜增厚程度輕。干預(yù)組內(nèi)膜和中膜比值(0.378±0.133)，同實(shí)驗(yàn)組比較(0.572±0.201)，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 免疫組化檢測(cè)iNOS和ICAM-1表達(dá)

移植物血管平滑肌層iNOS表達(dá)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組(4.80±1.11)和Lyc干預(yù)組(5.78±1.76)。兩者比較P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Lyc干預(yù)組iNOS的表達(dá)升高。移植血管ICAM-1表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組比較[(24.10±3.35)：(22.75±3.29)],P>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 ELISA檢測(cè)血漿中cGMP水平

術(shù)后4周收集大鼠的血漿，采用ELISA檢測(cè)cGMP濃度：實(shí)驗(yàn)組(47.37±7.97 pmol/mL)和Lyc干預(yù)組(55.46±12.05 pmol/mL)。兩者比較P>0.05，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討 論

HONG等發(fā)現(xiàn)在大鼠移植動(dòng)脈硬化病變模型中，iNOS在調(diào)控移植血管內(nèi)膜增厚中發(fā)揮重要作用：iNOS上調(diào)可以引起NO及cGMP增加，NO可以直接阻礙血管內(nèi)血小板和白細(xì)胞聚集，抑制黏附分子和趨化分子的表達(dá)[3]。cGMP濃度升高，一方面使細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)攝取鈣離子增加，并且抑制鈣離子通道，減少鈣離子內(nèi)流，使平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度下降，擴(kuò)張血管；另一方面，可以抑制RhoA激酶的活性，調(diào)控血管收縮，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖。因此我們推測(cè)通過調(diào)控NO/cGMP，維持移植物血管收縮和舒張平衡是早期防止移植物血管病變的關(guān)鍵因素。

Lyc是最主要的類胡蘿卜素之一，具有很強(qiáng)抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期服用番茄紅素，可以清除氧自由基，增加NO-cGMP含量，有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成[4]。但對(duì)于慢性移植物血管病變未見報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)移植術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組和Lyc干預(yù)組均出現(xiàn)慢性移植物血管病變改變，表現(xiàn)為移植血管內(nèi)膜的增厚，平滑肌細(xì)胞增殖并向內(nèi)膜遷移，但Lyc干預(yù)組內(nèi)膜增生較實(shí)驗(yàn)組減輕。iNOs表達(dá)在干預(yù)組中較實(shí)驗(yàn)組明顯增加。Lyc干預(yù)組血漿中cGMP濃度同實(shí)驗(yàn)組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。cGMP主要在平滑肌細(xì)胞漿中發(fā)揮作用，分泌到血漿中量少，通過測(cè)血漿中cGMP濃度，觀察兩者差異可能不明顯。本研究表明，移植術(shù)后長(zhǎng)期服用Lyc可以改善受損的血管內(nèi)皮功能，抑制平滑肌細(xì)胞增殖遷移，可能的機(jī)制之一是通過上調(diào)NO-cGMP通路。此外，移植血管內(nèi)皮受損后，還可導(dǎo)致多種炎癥細(xì)胞局部浸潤(rùn)，刺激血管內(nèi)膜增生，激活平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。所以局部炎癥反應(yīng)也是促進(jìn)移植物血管病的重要機(jī)制之一。Lyc可以通過抑制TNF-α誘導(dǎo)ICAM-1的表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞局部浸潤(rùn)[5]。

通過本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)番茄紅素可以改善移植血管慢性排斥反應(yīng)的早期改變，其可能的機(jī)制是通過上調(diào)NO-cGMP通路和抑制炎癥細(xì)胞局部浸潤(rùn)。

[1]HAYRY P, AAVIL E, SARWAL M, et al. Chronic rejection: prospects for therapeutic intervention in fibroproliferative vascular disease[J]. Exp Clin Transplant, 2003,1(1):35-38.

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[4]唐湘宇, 王蕾, 郭芳, 等. 番茄紅素對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化形成和氧化損傷的影響[J]. 中國(guó)心血管疾病研究雜志, 2005,13(6): 462-464.

[5]HUNG C F, HUANG T F, CHEN B H,et al. Lycopene inhibits TNF-alpha-induced endothelial ICAM-1 expression and monocyte-endothelial adhesion[J]. Eur J Pharmacol,2008,586(1/3):275-282.

Lycopene Improves Endothelial Function Vasculopathy of Rat

XU Ziqiang， ZHANG Yan, SHEN Longjie

(Transplantation Center,First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

Objective The purpose of the current study was to evaluate the effects of lycopene on chronic allograft early vasculopathy. Methods Rat abdominal aorta transplantation was performed between Brown-Norwai rats as donors and male Male Lewis rats as recipients. The recipients were divided into 2 groups: Group A (BN-Lewis):that was no treatment; Group B (BN-Lewis) that received lycopene (30 mg/kg per day). Rats were humanely killed at 28 days after surgery. The grafted aortas were analyzed by histology and immunohistochemistry analysis. Plasma of mice was test by elisa. Results The aortas intimal of group B were significantly thinner compared with group C. iNOs protein expression in the group B were significantly higher than those in group A. Conclusion Lycopene has positive effects of chronic allograft vasculopathy.

lycopene；graft occlusion； transplantation

1006-446X(2016)03-0025-03

2015 - 12 - 10

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Y20120157);浙江省自然科學(xué)基金(LQ16H100002)

TS 202.3

A