李國(guó)輝，鐘其頂，王道兵，申世剛

(1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京　100015；2.全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京　100015；

3.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定　071001)

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氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜法測(cè)定發(fā)酵液中尿素δ13C和δ15N

李國(guó)輝1,2,3，鐘其頂1,2，王道兵1,2，申世剛3

(1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；2.全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京100015；

3.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定071001)

摘要：在酸性環(huán)境下，尿素與丙二醛-二甲基乙縮醛反應(yīng)生成2-羥基嘧啶，隨后由重氮甲烷甲基化形成2-甲氧基嘧啶。本研究以酵母發(fā)酵液為例，建立了氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜(GC-C-IRMS)法測(cè)定發(fā)酵液中尿素δ13C和δ15N，并對(duì)前處理方法和GC條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：尿素在不同13C(0~5%)和15N(0~10%)標(biāo)記豐度下，標(biāo)記量與GC-C-IRMS測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性良好，線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.998和0.999，說(shuō)明可在極低標(biāo)記濃度下對(duì)尿素中δ13C和δ15N進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。采用該方法測(cè)定了酵母發(fā)酵液尿素中δ13C和δ15N，其重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.21‰和0.30‰，再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.23‰和0.29‰。該方法精度高、準(zhǔn)確性好，可為低穩(wěn)定同位素標(biāo)記尿素示蹤實(shí)驗(yàn)以及尿素循環(huán)代謝研究提供方法基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：尿素；衍生化；氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜(GC-C-IRMS)；δ13C；δ15N

doi：10.7538/zpxb.youxian.2015.0044

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-09-09；網(wǎng)絡(luò)出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20150909.1515.004.html

尿素是生物體蛋白質(zhì)代謝的主要產(chǎn)物，研究尿素代謝循環(huán)可以準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)生物體的生理壓力、營(yíng)養(yǎng)狀況、飲食及藥物介入等情況。與傳統(tǒng)的化學(xué)計(jì)量代謝分析方法相比，穩(wěn)定同位素示蹤代謝分析方法更為準(zhǔn)確、直觀，已廣泛應(yīng)用于尿素代謝分析中，例如分析生物體內(nèi)尿素合成速率[1-3]、尿素氮在肝臟內(nèi)的氮循環(huán)[4-5]、蛋白質(zhì)合成與分解[6]以及醫(yī)學(xué)診斷[7-8]等。

目前，穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)主要是對(duì)尿素中碳和氮原子進(jìn)行標(biāo)記，測(cè)定其同位素組成的方法有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)[9-14]和高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法(HPLC-APCI-MS)[15]。GC/MS法需要復(fù)雜的前處理過(guò)程，如衍生、脲酶轉(zhuǎn)化等；而HPLC-APCI-MS法雖然可直接進(jìn)樣分析，但只能在99%以上標(biāo)記水平下進(jìn)行。受標(biāo)記物成本的限制，目前的示蹤實(shí)驗(yàn)只是在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)進(jìn)行，然而，在分析微生物代謝時(shí)，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模通常無(wú)法反映大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)的真實(shí)情況，降低了示蹤實(shí)驗(yàn)的標(biāo)記量。同樣，在精確分析人體尿素代謝動(dòng)力學(xué)或者藥物介導(dǎo)時(shí)，要有能夠測(cè)定低富集濃度下同位素比值微小變化的分析方法。新型的氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜(GC-C-IRMS)法具有測(cè)定精度高，可在0.0002APE下進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定[16-17]，該方法已應(yīng)用于血清和尿液中尿素13C豐度的測(cè)定[13,18-19]，但方法的前處理和測(cè)定效果差異較大，對(duì)15N豐度的測(cè)定效果較差。Heinzle等[20-21]利用GC-C-IRMS法在低標(biāo)記濃度(1%13C標(biāo)記)下測(cè)定蛋白氨基酸中的13C豐度，并分析了谷氨酸棒桿菌的代謝流量。微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的尿素可作為某些有害物質(zhì)的前體，因此，尿素的代謝能力是評(píng)價(jià)微生物的重要指標(biāo)[22-23]，但關(guān)于微生物發(fā)酵液中尿素同位素豐度的測(cè)定則鮮有報(bào)道。

目前，應(yīng)用GC-C-IRMS法測(cè)定尿素時(shí)，需要對(duì)尿素進(jìn)行衍生處理，常用的衍生試劑為二甲氨基亞甲基(dimethylaminomethylene，DAM)[13,18]和甲基硅烷化試劑(bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，trimethyl-silylether)[9,11-12]，但衍生過(guò)程復(fù)雜，且反應(yīng)過(guò)程需要高溫加熱，額外引入的C、N原子對(duì)測(cè)定精度造成了較大的誤差。

本研究以釀酒酵母為研究對(duì)象，在溫和條件下，利用衍生試劑將代謝生成的尿素引入外源原子較少、穩(wěn)定性較好的2-甲氧基嘧啶，以建立GC-C-IRMS法測(cè)定微生物發(fā)酵液中尿素δ13C和δ15N，并進(jìn)行13C和15N標(biāo)記分析微生物的尿素代謝，旨在節(jié)約標(biāo)記成本，同時(shí)也為在生產(chǎn)中大規(guī)模標(biāo)記實(shí)驗(yàn)及示蹤分析的應(yīng)用提供方法參考。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器

6890氣相色譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，配有FID檢測(cè)器；DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.30 μm)：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；Delta V advantage同位素比值質(zhì)譜儀(內(nèi)測(cè)精度≤ 0.065‰)、Isolink燃燒轉(zhuǎn)化裝置、Flash 2000元素分析儀：均為美國(guó)Thermo-Fisher公司產(chǎn)品；錫杯：美國(guó)Element Microanalysis公司產(chǎn)品；Biosafer超聲波細(xì)胞破碎儀：賽飛(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；3K15高速離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；LGJ-IA-80冷凍干燥儀：北京恒奧德儀器儀表有限公司產(chǎn)品；MTN-2800D氮吹儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品； ES 225SM-DR分析天平(十萬(wàn)分之一)：瑞士Precisa公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

2-甲氧基嘧啶(純度99.8%)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；重氮甲烷-正己烷(2M in hexanes)：美國(guó)Alfa Aesar公司產(chǎn)品；丙二醛-二甲基乙縮醛(Malondialdehydbis(diamathylacetal)，純度97%)：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；EA-IRMS標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(IAEA600(δ13CPDB=(-27.771±0.043)‰)和USGS-34(δ15NPDB=(-1.8±0.2)‰))：由國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)提供；15N2-尿素(純度99%)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；13C-尿素(純度99%)：美國(guó)Fluka公司產(chǎn)品；正己烷、甲醇(色譜純)：德國(guó)CNW公司產(chǎn)品；37%鹽酸、尿素、液氮：均為優(yōu)級(jí)純。

5%丙二醛-二甲基乙縮醛水溶液的制備：取500 μL丙二醛-二甲基乙縮醛溶液，用去離子水定容至10 mL，于4 ℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

釀酒酵母：某酒廠提供的生產(chǎn)用釀酒酵母(內(nèi)部編號(hào)：scff-02)。

酵母無(wú)機(jī)培養(yǎng)基：制備方法見(jiàn)文獻(xiàn)[24]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1尿素溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取5 mg標(biāo)記和未標(biāo)記的尿素，用去離子水定容至50 mL，將13C和15N標(biāo)記的尿素溶液和未標(biāo)記的尿素溶液按一定比例混合，得到含不同標(biāo)記的尿素溶液。其中，13C尿素的百分含量分別為0%、0.5%、1%、2%、5%；15N尿素的百分含量分別為0%、1%、2%、5%、10%。隨后，各取5 mL系列溶液進(jìn)行冷凍干燥，干燥后的殘留物保存于氮?dú)獗Ｗo(hù)的室溫環(huán)境。

1.3.2發(fā)酵液的預(yù)處理釀酒酵母菌種經(jīng)活化后接入無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期，取10 mL酵母發(fā)酵液，加入10 mL乙醇，渦旋混勻，置于200 W超聲細(xì)胞破碎儀中超聲30 min使菌體破壁，然后以8 000 r/min離心5 min，取上清液，冷凍干燥，于4 ℃保存。

1.3.3氣相色譜條件載氣為氮?dú)?；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初溫40 ℃，保持2 min，以7 ℃/min升至120 ℃，再以30 ℃/min升至275 ℃，保持5 min；檢測(cè)器溫度250 ℃。

1.3.4燃燒-同位素比值質(zhì)譜儀條件設(shè)定燃燒管溫度為1 000 ℃，當(dāng)測(cè)定δ13C時(shí)，選用CO2測(cè)定模式，自動(dòng)調(diào)用m/z44、45、46的離子源參數(shù)；當(dāng)測(cè)定δ15N時(shí)，選用N2測(cè)定模式，自動(dòng)調(diào)用m/z30、29、28的離子源參數(shù)；并將連通燃燒管與質(zhì)譜儀的毛細(xì)管置于液氮冷阱中以固定樣品燃燒產(chǎn)生的CO2，每測(cè)定10個(gè)樣品后，將冷阱去掉以釋放固定住的CO2，防止堵塞該毛細(xì)管。

1.3.5EA-IRMS測(cè)定方法氧化管溫度980 ℃，還原管溫度680 ℃，柱溫60 ℃，氦氣流速100 mL/min。稱取約0.1 mg粉末樣品于錫杯中，包好后待測(cè)；每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，得到樣品的δ13C和δ15N；同時(shí)測(cè)定樣品系列中的2個(gè)參考物質(zhì)，依據(jù)Nelson等[25]報(bào)道的方法進(jìn)行校正，得到樣品的δ13CPDB和δ15NPDB。

1.3.6衍生原理與方法根據(jù)丙二醛-二甲基乙縮醛在酸性條件下迅速分解為丙二醛的原理，丙二醛與尿素發(fā)生親核加成反應(yīng)生成2-羥基嘧啶，然后與重氮甲烷反應(yīng)生成2-甲氧嘧啶，其原理示于圖1。

向存有尿素標(biāo)記溶液或者發(fā)酵液殘留物的衍生管中加入400 μL 5%丙二醛-二甲基乙縮醛水溶液和640 μL濃鹽酸(37%)，渦旋混勻后于室溫下反應(yīng)1 h，40 ℃下氮?dú)獯蹈?；殘?jiān)鼜?fù)溶于400 μL甲醇中，加入400 μL重氮甲烷-正己烷，渦旋反應(yīng)；然后用氮?dú)獯蹈?，加?00 μL正己烷復(fù)溶，于4 ℃保存，待分析。

圖1　尿素經(jīng)丙二醛-二甲基乙縮醛和重氮甲烷衍生的原理Fig.1　Principle for the conversion of urea into 2-methoxypyrimidine

2結(jié)果與討論

2.1衍生方法研究

通過(guò)對(duì)2-甲氧基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品、尿素標(biāo)記品和發(fā)酵液中尿素衍生產(chǎn)物(2-甲氧基嘧啶)的測(cè)定，確定了氣相色譜的最佳升溫程序(見(jiàn)1.3.3節(jié))。在該條件下，化合物的分離度好，目標(biāo)峰無(wú)雜質(zhì)干擾，2-甲氧基嘧啶的保留時(shí)間為15.2 min。

Wolthers等[9,19]提出尿素反應(yīng)生成2-羥基嘧啶的時(shí)間為1 h，因此本研究?jī)H對(duì)2-羥基嘧啶生成2-甲氧基嘧啶的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為1、2、3、5、8、10、20 min，反應(yīng)溫度為室溫、35 ℃和45 ℃，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)該反應(yīng)的影響情況示于圖2。結(jié)果表明，溫度對(duì)反應(yīng)無(wú)影響，衍生反應(yīng)在2 min后達(dá)到平衡，衍生產(chǎn)物可以穩(wěn)定存在24 h，因此，確定2 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。該反應(yīng)溫和快速、原子引入量少、衍生反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定、無(wú)需預(yù)處理即可進(jìn)樣分析，提高了方法的可操作性。

圖2　反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)重氮甲烷與2-甲基嘧啶反應(yīng)的影響Fig.2　Effect of derivative reaction of diazomethane and 2-methylpyridine for time and temperature

2.2發(fā)酵液前處理方法研究

微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的尿素一部分被分泌到細(xì)胞外，另一部分則留在細(xì)胞內(nèi)。為了準(zhǔn)確測(cè)定微生物的代謝過(guò)程，需要同步測(cè)定細(xì)胞內(nèi)外的尿素。釋放細(xì)胞內(nèi)尿素需要破壞細(xì)胞壁，目前關(guān)于酵母破壁的方法主要有酶法、機(jī)械研磨、高壓勻漿、酸水解和超聲破壁等。酶法處理的專一性強(qiáng)，但是成本高、處理時(shí)間長(zhǎng)；機(jī)械研磨和高壓勻漿法容易造成破碎不徹底；酸水解方法的處理徹底，但同時(shí)會(huì)將菌體蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生大量的氨基酸，且酸水解需要在高溫下進(jìn)行，不適合處理熱不穩(wěn)定的代謝物；超聲波破碎法的成本低、破碎完全，且形成的副產(chǎn)物少[26-29]。由于尿素的熱穩(wěn)定性差，氨基酸和蛋白質(zhì)類(lèi)產(chǎn)物會(huì)影響尿素的衍生測(cè)定，因此本研究采用細(xì)胞超聲破碎儀對(duì)發(fā)酵液中的細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。

實(shí)驗(yàn)設(shè)定超聲功率為200 W，分別對(duì)2個(gè)發(fā)酵液樣品進(jìn)行超聲破壁處理，超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min，超聲后離心樣品，取上清液，凍干，衍生后經(jīng)GC-FID測(cè)定尿素衍生物2-甲氧基嘧啶的峰面積，以確定最優(yōu)的超速破壁時(shí)間，其結(jié)果示于圖3。

圖3　不同超聲時(shí)間時(shí)細(xì)胞壁破碎效率對(duì)比Fig.3　Comparison of ultrasonic crushing efficiencyin different ultrasonic time

由圖3可知，在功率200 W時(shí)，超聲破碎30 min后，尿素衍生物的峰面積趨于穩(wěn)定，表明發(fā)酵液中的細(xì)胞已經(jīng)完全破碎，因此確定發(fā)酵液超聲處理時(shí)間為30 min。此外，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入乙醇有利于細(xì)胞壁碎片和蛋白質(zhì)的沉淀，可降低衍生以及測(cè)定過(guò)程中的基質(zhì)干擾。

2.3GC-C-IRMS法測(cè)定2-甲氧基嘧啶δ13C和δ15N

根據(jù)1.3.3節(jié)條件，對(duì)2-甲氧基嘧啶進(jìn)行GC-C-IRMS法分析，尿素衍生物中13C和15N的離子流圖示于圖4。根據(jù)圖4中保留峰的情況，可確定在700 s前和1 000 s后打開(kāi)反吹，去掉溶劑峰和衍生試劑峰，以減少干擾、延長(zhǎng)儀器使用壽命。

在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣10次，以及在5天內(nèi)分別進(jìn)樣(每天進(jìn)樣10次取平均值)，測(cè)定2-甲氧基嘧啶δ13C和δ15N的穩(wěn)定性，其結(jié)果列于表1和表2。結(jié)果表明，2-甲氧基嘧啶δ13C和δ15N的重復(fù)性分別為0.13‰和0.24‰，再現(xiàn)性分別為0.20‰和0.26‰，穩(wěn)定性良好。

圖4　尿素衍生物2-甲氧基嘧啶的δ13C和δ15N離子流圖Fig.4　Ion current of δ13C and δ15N of 2-methoxypyrimidine

測(cè)定次數(shù)δ13C/‰δ15N/‰測(cè)定次數(shù)δ13C/‰δ15N/‰測(cè)定次數(shù)δ13C/‰δ15N/‰1-16.57-2.575-16.53-2.849-16.73-2.982-16.68-2.386-16.79-2.2810-16.68-2.893-16.48-2.737-16.80-2.37平均值/‰-16.63-2.634-16.44-2.498-16.60-2.74標(biāo)準(zhǔn)偏差/‰0.130.24

表2　2-甲氧基嘧啶δ13C和

2.4樣品測(cè)定穩(wěn)定性研究

2.4.1重復(fù)性分析取同一干燥處理后的發(fā)酵液樣品，經(jīng)衍生化后測(cè)定衍生物2-甲氧基嘧啶δ13C和δ15N分析方法的精密度。在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣10次測(cè)定方法的重復(fù)性，結(jié)果列于表3。發(fā)酵液中尿素衍生物δ13C和δ15N的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.21‰和0.30‰。

2.4.2再現(xiàn)性分析選取同一發(fā)酵液樣品為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在5天內(nèi)分別經(jīng)衍生化后測(cè)定衍生物2-甲氧基嘧啶δ13C和δ15N分析方法的再現(xiàn)性，每天分析10次，結(jié)果列于表4。結(jié)果表明，尿素衍生物2-甲氧基嘧啶δ13C和δ15N測(cè)定的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.23‰和0.29‰。

表3　發(fā)酵液中尿素衍生物2-甲氧基嘧啶δ13C和δ15N重復(fù)性測(cè)定分析(n=10)

表4　發(fā)酵液中尿素衍生物2-甲氧基嘧啶δ13C和

分析結(jié)果顯示，該方法對(duì)酵母發(fā)酵液中尿素δ13C和δ15N測(cè)定的重復(fù)性和再現(xiàn)性良好，符合穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜測(cè)試的要求。

2.5樣品測(cè)定準(zhǔn)確性研究

分別對(duì)1.3.1節(jié)配制的不同穩(wěn)定同位素含量豐度的尿素進(jìn)行測(cè)定(每個(gè)樣品測(cè)定3次取平均值)，所得的δ13C和δ15N與13C和15N標(biāo)記尿素含量的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.998和0.999，說(shuō)明該方法可在0.5%和1%標(biāo)記含量下對(duì)尿素δ13C和δ15N進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，結(jié)果示于圖5。此外，選取3個(gè)不同來(lái)源的尿素樣品，分別采用GC-C-IRMS法和EA-IRMS法測(cè)定其δ13C和δ15N，并對(duì)比分析兩種方法測(cè)定的δ15N值(各樣品δ13C值相近)，線性相關(guān)系數(shù)R2為1，說(shuō)明所建立的方法對(duì)尿素衍生物測(cè)定的準(zhǔn)確性良好，結(jié)果示于圖6。

圖5　13C和15N標(biāo)記尿素含量與衍生物δ13C(a)和δ15N(b)測(cè)定值的相關(guān)性Fig.5　Relationship of δ13C (a) and δ15N (b) vs13C and15N labeled level of urea

3結(jié)論

本研究采用丙二醛-二甲基乙縮醛和重氮甲烷為衍生試劑，通過(guò)對(duì)前處理和測(cè)定條件系統(tǒng)的優(yōu)化，建立了氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜法測(cè)定發(fā)酵液中尿素δ13C和δ15N。該方法的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可為利用穩(wěn)定同位素13C或15N在低標(biāo)記情況下示蹤分析尿素代謝提供方法參考。

圖6　GC-C-IRMS法和EA-IRMS法測(cè)定尿素δ15N值的相關(guān)性Fig.6　Relationship of δ15Nof urea measured by GC-C-IRMS and EA-IRMS

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Determination ofδ13C andδ15N of Urea in Fermentation Broth

by Gas Chromatography-Combustion-Isotope Ratio Mass Spectrometry

LI Guo-hui1,2,3, ZHONG Qi-ding1,2, WANG Dao-bing1,2, SHEN Shi-gang3

(1.ChinaNationalInstituteofFoodandFermentationIndustries,Beijing100015,China;

2.NationalStandardizationCenterofFood&FermentationIndustry,Beijing100015,China;

3.KeyLabofAnalyticalScienceofHebeiProvince,CollegeofChemistryandEnvironmentalScience,

HebeiUniversity,Baoding071001,China)

Abstract:A method for the determination ofδ13C andδ15N of urea in yeast fermentation broth by gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry (GC-C-IRMS) was established. Urea was derived as 2-methoxypyrimidine by malonaldehydebis (dimethyl acetal) (MDBMA) and diazomethane in acidic condition, and then was analyzed by GC-C-IRMS. Sample pretreatment method and GC conditions were confirmed and optimized by GC-FID. The results show that the linear correlations of labeled level ofδ13C (0-5% labeled) andδ15N (0-10% labeled) and measured value of GC-C-IRMS are well. The correlation coefficients ofδ13C andδ15N are 0.998 and 0.999, respectively. The repeatability ofδ13C andδ15N of urea in yeast fermentation broth are 0.21‰ and 0.30‰, and the reproducibility are 0.23‰ and 0.29‰.δ15N of urea from three different sources was analyzed by EA-IRMS and GC-C-IRMS, and the correlation coefficient is 1. This method has high accuracy and good repeatability, which can provide foundation and technical support to low stable isotope labeling urea tracer experiment and analysis of urea cycle metabolism.

Key words：urea; derivatization; gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry (GC-C-IRMS);δ13C;δ15N

通信作者：鐘其頂(1980—)，男(漢族)，廣西人，高級(jí)工程師，從事穩(wěn)定同位素分析研究。E-mail: zhongqiding@163.com

作者簡(jiǎn)介：李國(guó)輝(1986—)，男(漢族)，內(nèi)蒙古人，博士研究生，從事微生物代謝流量分析研究。E-mail: liguohui193@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101333)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAK17B11)；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(2015FA31720)；質(zhì)檢公益項(xiàng)目(201210104)資助

收稿日期：2015-03-05;修回日期：2015-04-30

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2997(2016)01-0060-08