鐘　濤，張興磊，張　華，楊美玲，周　鵬，樂長高

(東華理工大學，江西省質譜科學與儀器重點實驗室，江西 南昌　330013)

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牙簽電噴霧電離質譜分析臍橙果汁成分

鐘濤，張興磊，張華，楊美玲，周鵬，樂長高

(東華理工大學，江西省質譜科學與儀器重點實驗室，江西 南昌330013)

摘要：在無需樣品預處理的前提下，采用牙簽電噴霧電離質譜(wooden-tip ESI-MS)法對臍橙果汁成分進行快速檢測。結果表明：在正離子模式下，檢測到的主要成分為膽堿、蔗糖、葡萄糖、脯氨酸、正壬醇等，其中膽堿和脯氨酸產生[M+H]+信號，蔗糖和葡萄糖產生[M+K]+信號；在負離子模式下，檢測到的主要成分是脂肪酸、酚酸、羥基酸等有機酸。同時，對抗壞血酸進行了半定量測定，方法檢出限為3.7 μg/L，相對標準偏差為7.4%~9.7%，單次檢測時間小于0.5 min。該方法無需樣品預處理、操作簡便、檢出限低、分析速度快，有望成為農產品品質分析的一種新方法。

關鍵詞：臍橙；果汁；成分；牙簽；電噴霧質譜

doi：10.7538/zpxb.youxian.2015.0043

網絡出版時間：2015-09-09；網絡出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20150909.1515.018.html

臍橙(Citrussinensis(L.) Osbeck)是蕓香科柑橘屬甜橙類的主要品種群，因其果實頂部開裂呈臍狀而得名臍橙。臍橙無核、味甜、清香，含有人體所必需的多種營養(yǎng)成分及黃酮類、檸檬苦素等活性成分[1]。人們在挑選臍橙時，不僅注重大小、色澤、品相等外部品質，對其口感、酸度、礦物質、維生素含量、可溶性固形物等內部品質也極為看重，因此，對臍橙的成分分析是非常必要的。目前，關于臍橙果實的成分分析方法主要有光譜法[2-4]、電化學法[5]、色譜法[1,6]、色譜-質譜聯(lián)用法[7-10]等。但上述方法均需對樣品進行預處理才能測定，如超聲提取[1]、液-液萃取[6-7]和固相微萃取[8-10]等，其操作繁瑣、耗時較長，難以實現(xiàn)樣品的快速分析。

質譜技術因具有靈敏度高、特異性好、響應速度快等特點，在食品安全、藥物分析和物證分析等領域得到了廣泛應用[11-12]。然而，傳統(tǒng)的質譜技術存在基體耐受性差，需進行繁瑣的樣品預處理過程等不足。2004年，Cooks課題組[13]提出了在無需樣品預處理情況下直接對表面樣品進行質譜分析的電噴霧解吸電離質譜(DESI-MS)技術，掀起了基于直接離子化技術的常壓質譜分析研究熱潮。目前，常見的常壓質譜分析技術主要包括實時在線分析(DART)[14]、介質阻擋放電電離(DBDI)[15]、低溫等離子體探針(LTP)[16]、空氣動力輔助離子化(AFAI)[17]、電噴霧輔助激光解吸電離(ELDI)[18]、表面解吸常壓化學電離(DAPCI)[19]和電噴霧萃取電離(EESI)[20]等。其中，一種衍生于電噴霧電離(electrospray ionization, ESI)技術的常壓電離質譜——固體基質電離質譜(solid-substrate electrospray ionization mass spectrometry)，因具有操作簡便、取樣量少、靈敏度高、分析速度快等特點，已應用于人體內臟、組織、血液以及尿液等復雜基體樣品化學成分的快速分析[21-26]。

本實驗在前期研究的基礎上[27]，應用牙簽電噴霧電離質譜(Wooden-tip ESI-MS)技術對臍橙果汁進行檢測，旨為果蔬等復雜基體樣品成分的快速分析提供方法參考。

1實驗部分

1.1主要儀器與試劑

Tip-spray裝置示于圖1；LTQ-XL線性離子阱質譜儀：美國Finnigan公司產品，配有Xcalibur數據處理系統(tǒng)。

圖1　Tip-spray裝置示意圖Fig.1　Experimental setup of Tip-spray

臍橙樣品：由興國縣豐硒農業(yè)發(fā)展有限責任公司提供，分別采摘自贛南果溪、安溪、永興3個自然村；木牙簽(長約6.4 cm，尖端直徑約0.6 mm)：浙江雙槍竹木有限公司產品；膽堿、脯氨酸、正壬醇：均為標準品，上海晶純生化科技股份有限公司產品；L-抗壞血酸(分析純)：西隴化工股份有限公司產品；實驗用水為二次蒸餾水。

1.2實驗方法

分別隨機取每個產地新鮮臍橙9個，清洗、拭干，對半縱切2次平分為4瓣，各取其中1瓣進行果肉和果皮分離，果肉經兩層干凈紗布擠壓過濾盛于燒杯中，將榨汁后的囊瓣從果皮上扯下放入潔凈紗布中，再將果汁全部壓出，合并于棕色試劑瓶中。測定抗壞血酸所用果汁應在2~3 min內榨取完成，木牙簽(截至長約2 cm)浸入臍橙果汁中，10 min后取出直接進行質譜分析。

1.3質譜條件

采用正、負離子兩種檢測模式，噴霧電壓4.5 kV，離子傳輸管溫度180 ℃，離子透鏡及檢測系統(tǒng)由LTQ Tune功能自動優(yōu)化，其他為LTQ缺省條件，質量掃描范圍m/z50~600。牙簽延長線與質譜入口同軸，牙簽尖端與質譜入口的距離為3~4 mm。二級質譜記錄時間為10 s，選定離子的隔離寬度為1.0~1.6 u，碰撞時間為30 ms，碰撞誘導解離(CID)的碰撞能量為15%~30%。

2結果與討論

2.1正離子模式成分分析

在優(yōu)化的實驗條件下，采用正離子檢測模式對3個不同產地的臍橙果汁成分進行質譜分析，得到它們的化學指紋譜圖，示于圖2。從圖中可以看出，它們均含有m/z104、130、144、182、219、287、318、381等特征信號峰。其中，果溪樣品含有m/z198特征信號峰，安溪和永興樣品則含有m/z274、513、541特征信號峰，這可能是由臍橙生長環(huán)境，如氣候、土壤成分、灌溉等原因引起的品質差異[29-30]。因此，可利用指紋譜圖差異進行不同產地的識別。

從圖2可見，所有臍橙樣品均有信號較強的m/z144離子峰，推測為正壬醇本身質子轉移后的離子峰，對其進行串聯(lián)質譜分析，二級質譜圖示于圖3a。正壬醇存在于甜橙、苦橙、柚和橡苔等精油中，烷基鏈較長，可發(fā)生卷曲形成五元環(huán)或六元環(huán)過渡態(tài)結構，在形成環(huán)狀過渡態(tài)時發(fā)生氫重排而生成[M—H2O]+，相應的碎片離子為m/z126，這與圖3a相吻合。進一步對m/z126進行三級質譜分析，得到碎片離子m/z108、98、84(圖3a中插圖)，它們分別是由母離子m/z126丟失 H2O、C2H4、C3H6基團所形成的。根據這些碎片離子的特征，推斷m/z144為正壬醇的離子峰，其特征碎片離子與正壬醇標準品的二級和三級質譜圖吻合。

注：a.果溪；b.安溪；c.永興圖2　不同產地臍橙果汁的指紋圖譜Fig.2　Fingerprints of navel orange juicefrom different origins

圖3　正壬醇(a)、膽堿(b)、脯氨酸(c)、[蔗糖+K]+(d)的串聯(lián)質譜圖Fig.3　Tandem spectrum of 1-nonanol (a), choline (b), proline (c) and [sucrose+K]+(d)

臍橙果汁質譜圖中m/z104離子的二級質譜圖示于圖3b。推測m/z104為[膽堿+H]+，其碎片離子m/z87、86、58是由母離子分別丟失—OH、H2O、CH3CH2OH所形成的。經標準品對照后確認該離子為[膽堿+H]+。

臍橙果汁質譜圖中m/z116離子的二級質譜圖示于圖3c，其特征碎片離子m/z98、70是由母離子(m/z116)經CID分別丟失H2O和CO+H2O基團所形成的。根據這些特征碎片離子，推斷其為[脯氨酸+H]+，經標準品驗證，與其二級質譜圖吻合，且與文獻[28]采用HPLC-MS2檢測的結果一致。

從圖2可見，臍橙樣品均有較明顯的m/z219、381離子峰，推測m/z219為[葡萄糖+K]+、m/z381為[蔗糖+K]+。其中，m/z381經CID產生特征碎片離子m/z363、345、219和201，分別是由母離子丟失H2O、2H2O、葡萄糖的特征糖元殘基(—C6H10O5—：Δ=162 u)和一分子葡萄糖所形成的，其質譜圖示于圖3d。

Wooden-tip ESI-MS法與色譜法或色譜-質譜聯(lián)用法相比，其檢測成分相對較少。但該方法對復雜基體樣品具有較強的承受能力，在無需樣品預處理的情況下即可高通量地實現(xiàn)臍橙樣品中糖類、生物堿、氨基酸等物質的直接質譜分析，其在正離子模式下的檢測結果列于表1。

2.2負離子模式成分分析

水果中常見的有機酸有檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乙酸、丁二酸和草酸等，這些有機酸具有抑菌、抗病毒、增加冠脈流量、抑制腦組織脂質過氧化物生成、消炎、抗突變和抗癌等作用[31]。有機酸的種類和含量會影響水果的口感和品質，因此對其進行分析和測定是非常必要的。

在優(yōu)化的實驗條件下，選擇負離子檢測模式分析臍橙果汁中的有機酸成分，結果列于表2。采用Wooden-tip ESI-MS法共檢出13種有機酸，包括丙二酸、丁二酸、壬二酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、α-酮基戊二酸等脂肪酸，芥子酸、咖啡酸、沒食子酸等酚酸，蘋果酸、檸檬酸、抗壞血酸等羥基酸。為排除假陽性信號，對所檢測的物質進行串聯(lián)質譜分析，蘋果酸、沒食子酸、抗壞血酸和咖啡酸的二級串聯(lián)質譜圖示于圖4。

表1　正離子模式下，臍橙果汁的成分分析

表2　臍橙果汁中的有機酸

圖4　蘋果酸(a)、沒食子酸(b)、抗壞血酸(c)和咖啡酸(d)的二級串聯(lián)質譜圖Fig.4　Tandem spectrum of malic acid (a), gallic acid (b), ascorbic acid (c) and caffeic acid (d)

水果中有機酸分析一般需經提取、凈化、衍生化等過程，操作繁瑣費時，而采用Wooden-tip ESI-MS法無需樣品預處理過程，可實現(xiàn)臍橙果汁中有機酸成分的快速分析。

2.3抗壞血酸的半定量測定

抗壞血酸，即維生素C，是維持機體正常生命活動所必需的一類小分子有機酸，普遍存在于水果和蔬菜中。本實驗對臍橙果汁中抗壞血酸進行了半定量測定，同時考察了方法的檢出限和精密度。

配制濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μg/L抗壞血酸標準溶液，按1.2節(jié)方法測定，得到二級質譜中扣除背景后特征碎片離子m/z157的信號強度值。每個濃度標準溶液測定5次，其凈響應信號強度平均值及相對標準偏差依次為38(8.8%)、43(7.5%)、48(9.7%)、57(9.5%)、68(9.4%)。

對信號強度與樣品濃度分別取對數，繪制工作曲線。在0.01~100 μg/L范圍內，離子強度對數(y)與濃度對數(x)具有較好的線性關系，線性回歸方程為y=0.062x+1.511，相關系數r=0.992。對0.01 μg/L標準樣品進行測定，獲得凈響應信號強度為38(n=5)，并測得空白樣品的3倍標準偏差為14.3(S/N=3，n=20)，根據文獻[32]計算本方法的檢出限為 3.7 μg/L。對果溪、安溪、永興3個產地臍橙樣品進行測定，單個樣品連續(xù)測定5次，得到凈響應信號強度平均值，由線性回歸方程求得3個產地臍橙樣品中抗壞血酸含量分別為344、256、403 mg/kg。

3結論

采用牙簽電噴霧電離質譜技術在無需樣品預處理的前提下，對臍橙果汁中的成分進行快速分析。在正離子模式下，檢測到的主要成分為膽堿、蔗糖、葡萄糖、脯氨酸、正壬醇等；在負離子模式下，檢測到的主要成分為脂肪酸、酚酸和羥基酸等。為排除假陽性信號，對所檢測到的物質進行了二級串聯(lián)質譜分析。此外，對果汁中的抗壞血酸含量進行了半定量分析，方法檢出限為3.7 μg/L，相對標準偏差為7.5%~9.7%。與傳統(tǒng)的分析方法相比，Wooden-tip ESI-MS法具有無需樣品預處理、取樣量少、操作簡便、檢出限低、無化學試劑引入等優(yōu)點，可用于水果、蔬菜類復雜基體物質的快速成分分析。

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Analysis of Navel Orange Juice Components

by Wooden-Tip Electrospray Mass Spectrometry

ZHONG Tao, ZHANG Xing-lei, ZHANG Hua, YANG Mei-ling,

ZHOU Peng, LE Zhang-gao

(JiangxiKeyLaboratoryforMassSpectrometryandInstrumentation,

EastChinaInstituteofTechnology,Nanchang330013,China)

Abstract:The chemical components of navel orange juice were analyzed by wooden-tip electrospray ionizaion mass spectrometry (wooden-tip ESI-MS) without any sample pretreatment. The results show that signals of choline, proline, glucose and sucrose are rapidly obtained in positive ion detection mode. Among them, choline and proline give a signal of [M+H]+, and glucose and sucrose produce a signal of [M+K]+. While in negative ion detection mode, organic acids including fatty acid, phenolic acids and hydroxyl acids are readily detected. Meanwhile, wooden-tip ESI-MS is developed for semi-quantification determination of ascorbic acid in navel orange juice. The limit of detection (LOD) is 3.7 μg/L, the relative standard deviations (RSD) are 7.4%-9.7%, and the analytical time of each detection is less than 0.5 min. Wooden-tip ESI-MS has the advantages of minor or no sample pretreatment, convenient operation, sensitivity and high analytical speed, which will being an attractive method to rapidly screen the quality of agricultural products.

Key words：navel orange; juice; components; wooden-tip; electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)

通信作者：樂長高(1967—)，男(漢族)，江西撫州人，教授，從事有機質譜分析研究。E-mail: zhgle@ecit.cn

作者簡介：鐘濤(1982—)，男(漢族)，江西瑞金人，博士研究生，從事質譜分析研究。E-mail: zt20311@163.com

基金項目：國家自然科學基金項目(21465002，21305011)；長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目(IRT13054)；江西省科技支撐計劃項目(20144BBB70008)資助

收稿日期：2015-02-05;修回日期：2015-04-17

中圖分類號：O657.63

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2997(2016)01-0075-07