張妍茹++佟少明++侯和勝

摘 要：植物螯合肽合成酶（phytochelatin synthase，PCS）可在重金屬離子激活下，以谷胱甘肽（GSH）及其巰醇鹽為雙底物催化合成植物螯合肽（phytochelatins，PCs），從而解除生物體內(nèi)重金屬的毒性。遠(yuǎn)源同源蛋白分析揭示了PCS屬于木瓜蛋白酶超家族，其催化機(jī)制類似于Cys蛋白酶。

關(guān)鍵詞：植物螯合肽合成酶；催化機(jī)制；重金屬離子

中圖分類號(hào)：Q946.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.02.005

Research Progress of Catalytic Mechanism of Phytochelatin Synthase

ZHANG Yanru， TONG Shaoming， HOU Hesheng

（School of Life Science， Liaoning Normal University， The Key Laboratory of Plant Biotechnology of Liaoning Province， Dalian， Liaoning 116081， China）

Abstract： Activated by heavy metal ions， phytochelatin synthase（PCS） catalyzes the synthesis of plant phytochelatins（PCs） using GSH and related thiols as bisubstrate， which contributes to heavy metal detoxification. Analysis of distant homologous protein revealed that the PCS belongs to papain protein superfamily and its catalytic mechanisms were analogous to Cys protease.

Key words： phytochelatin synthase； catalytic mechanism； heavy metals

近年來，由于人類對(duì)重金屬需求不斷增加，致使針對(duì)于重金屬的開采、冶煉、加工等活動(dòng)日益增多，造成不少重金屬如鉛、汞、鎘、鈷等進(jìn)入大氣、水、土壤中，在引起嚴(yán)重環(huán)境污染的同時(shí)，對(duì)生物體的生長(zhǎng)及發(fā)育等造成嚴(yán)重的影響。一般而言，細(xì)胞對(duì)于重金屬離子的解毒作用是通過合成具有高親和性結(jié)合位點(diǎn)的螯合劑，來抑制重金屬與生物功能分子中重要功能基團(tuán)的結(jié)合。研究表明，在高等植物中分離最多的重金屬螯合肽是PCs，PCs具有解除重金屬對(duì)植物細(xì)胞的毒害以及維持細(xì)胞內(nèi)必需金屬離子濃度相對(duì)穩(wěn)定的作用[1]。

1 PCs和PCS

PCs在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和蛇根草（Rauvolfia serpentine）細(xì)胞懸浮液中首次發(fā)現(xiàn)[2-3]，隨后在真菌、藻類、維管植物及無脊椎動(dòng)物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[4-6]。PCs具有（γ-Glu-Cys）n Xaa（n=2-11，Xaa通常是Gly）的典型結(jié)構(gòu)，是在γ-谷氨酰半胱氨酸二肽基轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamylcysteine dipeptidyltranspeptidase），即植物螯合肽合成酶（phytochelatin synthase，PCS）催化下合成的[7]。PCS催化GSH合成PCs活性是Grill等[8]在懸浮培養(yǎng)的植物細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)，隨后，Grill等[9]又從麥瓶草的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中分離純化出具有活性的PCS。從1999年開始，研究者先后從植物、真菌[7，10]和無脊椎動(dòng)物[11-12]中成功克隆到PCS基因。序列分析表明該基因編碼蛋白的分子量為42～70 KDa，N端序列保守，相似性高達(dá)40%～50%，C末端序列多變。

2 PCS的催化機(jī)制

2.1 重金屬離子激活PCS的催化活性

Grill等人的體外活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCS只有在金屬離子存在時(shí)才有催化活性，且在所測(cè)試的金屬中Cd2+激活效果最好，Pb2+、Zn2+、Cu2+、Sb3+、Ag+、Hg2+和一些其他離子也可激活PCS。該結(jié)論被純化的擬南芥AtPCS1所證實(shí)。這種依賴金屬離子的PCs合成反應(yīng)被認(rèn)為是一種通過反應(yīng)產(chǎn)物捕獲激活離子的自我終止反應(yīng)。

最初，研究者認(rèn)為重金屬離子對(duì)于真核PCS的激活是通過其直接結(jié)合于該酶N端保守結(jié)構(gòu)域中的Cys殘基上實(shí)現(xiàn)的[6]。然而，后期研究表明，反應(yīng)中重金屬離子結(jié)合底物而不直接結(jié)合酶。Vatamaniuk等人[14]通 過AtPCS1-FLAG催化動(dòng)力學(xué)分析直接證明了酶的激活不是與游離Cd2+直接結(jié)合，而是通過Cd2+與底物GSH結(jié)合形成Cd-GS2 復(fù)合物來激活A(yù)tPCS1。在Cd-GS2復(fù)合物中，Cd2+與GSH中巰基結(jié)合，阻塞巰基活性。進(jìn)一步的研究表明，如果以阻塞巰基的GSH衍生物作為底物，例如用S-烷基-GSH作為底物合成S-烷基-PCs，AtPCS1在缺少金屬離子的培養(yǎng)基中，仍顯示出高催化效率，證明了在沒有重金屬的情況下，阻塞的巰基也足夠激活PCS。這暗示了PCS催化活性的決定性因素是提供含巰基被阻塞的GSH類似物。

關(guān)于真核PCS如何被金屬離子激活，研究者提出金屬離子可能從GS-金屬?gòu)?fù)合物轉(zhuǎn)移到PCS蛋白，從而激活它。如上所述，細(xì)胞中游離的Cd2+不可直接與酶結(jié)合。然而，PCS蛋白攜帶高親和性的結(jié)合位點(diǎn)，金屬離子可以從低分子量配體轉(zhuǎn)移到PCS蛋白。通過肽掃描技術(shù)，研究者檢測(cè)到Cd2+可與PCS蛋白結(jié)合。因而，目前認(rèn)為金屬離子是從GS-金屬?gòu)?fù)合物轉(zhuǎn)移到PCS蛋白，從而激活酶的活性。