陳銳君 佟韜 李超 吳賢 陳瓊 陳曉男 徐明 陳柏叡

(福州市皮膚病防治院，福州 350001)

熒光染色法和KOH濕片法在診斷淺部真菌感染中的效果比較

陳銳君 佟韜 李超 吳賢 陳瓊 陳曉男 徐明 陳柏叡

(福州市皮膚病防治院，福州 350001)

目的 探討熒光染色法在淺部真菌鏡檢中的應(yīng)用價(jià)值。方法 收集100例皮膚科門診疑似真菌感染的患者標(biāo)本，分別運(yùn)用熒光染色法和KOH濕片法對這些標(biāo)本進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 熒光染色法共檢出56例真菌陽性，而KOH濕片法只有39例陽性。熒光染色法的陽性檢出率明顯高于KOH濕片法 (χ2=5.79，P<0.05)。結(jié)論 熒光染色法是一種快速、準(zhǔn)確的真菌檢測方法，值得在皮膚科對真菌感染早期診斷的推廣使用。

熒光染色法；KOH濕片法；真菌感染

[Chin J Mycol，2016，11(6):378-380]

淺部皮膚真菌病是最常發(fā)生于人類的真菌感染，主要由真菌侵犯表皮、毛發(fā)和甲引起的傳染性皮膚病，它包括頭癬、手足癬、體股癬、甲真菌病和花斑癬等。淺部皮膚真菌病傳染性極強(qiáng)，且病情頑固，易傳播和交叉感染，為人類健康帶來嚴(yán)重危害[1]。臨床用于真菌檢測的方法包括直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、免疫學(xué)檢查等。目前KOH濕片法由于其操作簡單、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，仍是早期快速診斷真菌的常用檢測方法。但因其敏感性低以及存在主觀誤差，臨床上漏診率較高。本院引進(jìn)的真菌熒光染色法，可針對各種疑似真菌感染的標(biāo)本進(jìn)行檢測，該法通過特殊的熒光素與真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和纖維素相結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見真菌清晰的輪廓，便于觀察。本實(shí)驗(yàn)通過使用立特晰-真菌熒光染色液 (一步法)對臨床疑似真菌感染的標(biāo)本進(jìn)行檢測，并與KOH濕片法進(jìn)行對比，探討熒光染色法在診斷淺部真菌中的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

取自2016年6月9～14日期間本院皮膚科門診擬診為淺部真菌感染者，共100例。取材部位包括：手足部34例，甲部16例，體股部43例，頭面部7例。

1.2 材料

立特晰-真菌熒光染色液 (一步法)：由安徽德萊康生物醫(yī)療科技有限公司提供，試劑主要組分包括10%KOH、熒光素和復(fù)染劑；10%KOH溶液：稱取10 g KOH溶于100 mL純水中；20%KOH溶液：稱取20 g KOH溶于100 mL純水中；奧林巴斯CX31普通光學(xué)顯微鏡，萊卡熒光顯微鏡。

1.3 方法

分組 將同一患者取出的標(biāo)本隨機(jī)分為兩份，一份用于KOH濕片法檢測，另一份用于熒光染色法檢測。

取材 用75%酒精在皮損處消毒，取活動(dòng)性邊緣的皮屑，指 (趾)甲取病甲內(nèi)側(cè)或者近端甲屑，頭癬取病發(fā)及其周圍鱗屑，酒精消毒后迅速取材，同時(shí)采集2份標(biāo)本放置在2張載玻片上送檢。

熒光染色法 直接向樣本滴加1滴染色液，染色液以覆蓋或淹沒整個(gè)樣本為準(zhǔn)，停滯數(shù)秒。蓋上蓋玻片，使用棉簽或紙巾壓片，吸去多余染液。熒光顯微鏡下觀察、拍圖。

KOH濕片法 向載玻片上滴加1滴10%KOH溶液，蓋上蓋玻片后，酒精燈火焰上方微加熱使標(biāo)本溶解后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察、拍圖。如為毛發(fā)或者指 (趾)甲，采用20%KOH溶液。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

兩種方法的檢驗(yàn)結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

熒光染色后，真菌 (菌絲和孢子)被標(biāo)記熒光，在鏡下可見清晰的亮藍(lán)色真菌輪廓，菌絲典型的橫隔結(jié)構(gòu)和孢子的出芽形態(tài)也能被呈現(xiàn)出來，易于識別。在熒光顯微鏡下，背景及雜質(zhì)為暗黑色，真菌熒光與背景形成強(qiáng)烈反差 (見圖1)。而KOH濕片法背景雜亂，真菌與背景反差小，真菌結(jié)構(gòu)不易分辨和判斷 (見圖2)。

圖1 熒光染色法各部位標(biāo)本真菌染色效果 (×400)：a.手足部真菌，b.體股部真菌，c.頭面部真菌，d.甲部真菌 圖2 KOH濕片法各部位標(biāo)本真菌染色效果 (×400)：a.手足部真菌，b.體股部真菌，c.頭面部真菌，d.甲部真菌

Fig.1 The fluorescent staining effect of fungi in specimensfrom different parts of body (×400):a.Fungi of the hand and foot,b.Fungi of the body and thigh,c.Fungi of the head and face,d.Fungi of the nail Fig.2 The staining effect of fungi specimes from different parts of body in KOH wet method (×400):a.Fungi of the hand and foot,b.Fungi of the body and thigh,c.Fungi of the head and face,d.Fungi of the nail

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，100例臨床可疑診斷患者中，熒光染色法共檢出56例陽性標(biāo)本，其中手足部11例，體股部24例，頭面部9例，甲12例。而KOH濕片法共檢出39例陽性標(biāo)本，其中手足部6例，體股部18例，頭面部4例，甲11例 (見表1)。熒光染色法總陽性檢出率明顯高于KOH濕片法 (χ2=5.79,P<0.05)。而且從不同部位標(biāo)本的結(jié)果對比也發(fā)現(xiàn)，熒光染色法陽性率均高于KOH濕片法 (見圖3)。

與KOH濕片法相比，熒光染色法的總陽性檢出率顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。χ2=5.79,P<0.05。

表1 兩種方法在不同部位標(biāo)本真菌鏡檢結(jié)果比較

Tab.1 Comparison of two methods for fungal microscopic examination in specimens from different parts of body

部位熒光染色法KOH濕片法例數(shù)陽性陰性例數(shù)陽性陰性手足33112233627體股372413371819頭面13941349甲部1712517116總計(jì)10056441003961

圖3 兩種方法在不同部位標(biāo)本的陽性檢出例數(shù)對比

Fig.3 Positive numbers of cases with two methods in detecting specimens from different parts of body

3 討 論

臨床上KOH濕片法是直接鏡檢使用最早的方法，該法操作簡單、快捷，技術(shù)容易掌握，不需要特殊儀器。但缺點(diǎn)明顯，例如背景雜亂、檢出率偏低，甲屑標(biāo)本尤為明顯，且孢子類結(jié)構(gòu)易與氣泡、脂滴混淆，容易造成錯(cuò)診。熒光染色法通過特殊熒光素與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合[2]，而且親和力高，反應(yīng)時(shí)間只需數(shù)十秒鐘即可完，大大提高臨床真菌檢測靈敏度和效率。在熒光顯微鏡特定的激發(fā)光波段下 (340～400 nm)，菌絲或孢子發(fā)出明亮的藍(lán)綠色熒光，真菌輪廓和黑暗背景可形成強(qiáng)烈對比反差，真菌形態(tài)結(jié)構(gòu)較KOH濕片法更為清晰，非常便于找尋和識別。而且真菌熒光染色液也含10%KOH，溶解角質(zhì)，使組織透化。值得注意的是，熒光染色法也能標(biāo)記植物纖維素，空氣和玻片上存在的少量纖維，在熒光顯微鏡下發(fā)熒光。但纖維形態(tài)一般不規(guī)則，大小、粗細(xì)、亮度等都與真菌有很大差異，沒有典型的真菌橫隔和出芽結(jié)構(gòu)，憑經(jīng)驗(yàn)一般可以避免假陽性情況的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)所使用的試劑立特晰-真菌熒光染色液 (一步法)為單劑型染色液，不僅在操作上與KOH法步驟一致，只需數(shù)十秒即可鏡下觀測 (甲屑需延長1～2 min)。而且標(biāo)本中菌絲、孢子熒光標(biāo)記后結(jié)構(gòu)清晰，顯著提高了菌體辨識度。已經(jīng)有大量文獻(xiàn)證明熒光染色法能提高真菌檢測陽性率[3-6]。本實(shí)驗(yàn)通過收集我院皮膚科門診疑似淺部真菌感染患者的標(biāo)本，將熒光染色法與KOH濕片法對比，也發(fā)現(xiàn)熒光染色法在診斷淺部真菌感染中顯著提高真菌檢出陽性率。在具備熒光顯微鏡的條件下，熒光染色法可取代傳統(tǒng)的KOH濕片法，成為常規(guī)真菌鏡檢的一種優(yōu)良檢測方法。

[1] 許超，謝光洪，曹永國，等.真菌性皮膚病檢測方法研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008,29(S1)：27-29.

[2] 張宏，吳紹熙.深部真菌病快速診斷的新實(shí)驗(yàn)方法[J].國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊，1995,21(1)：12-14.

[3] 楊通，何煉圖，陳濤，等.熒光染色劑Calcofluor white在活檢組織中真菌染色的應(yīng)用[J].分子診斷與治療雜志，2014，6(2)：307-311.

[4] 張偉宏，王麗婭，韓雷，等.KOH濕片鏡檢法與CFW熒光染色法診斷真菌性膜炎的效果比較[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，45(2)：193-195.

[5] Honig PJ，Sullivan K，McGowan KL.The rapid diagnosis of tinea capitis using calcofluor white[J].Pediatr Emerg Care，1996,12(5):333-335.

[6] Ramos L，Mellado S，Ramadan S，et al.The use of calcofluor white for studying Malassezia species by direct microscopy[J].Rev Argent Microbiol，2006,38(1)：4-8.

[本文編輯] 王 飛

·真菌病治療·

Comparison of fluorescent staining method and KOH wet method for diagnosis of superficial fungal infections

CHEN Rui-jun，TONG Tao，LI Chao，WU Xian，CHEN Qiong，CHEN Xiao-nan，XU Ming，CHEN Bo-rui

(FuzhouDermatosisPreventionHospital,Fuzhou350001)

Objective To explore the application value of fluorescent staining method for superficial fungal microscopic examination.Methods One hundred cases with suspected fungal infection were collected in the department of dermatology.Fluorescent staining method and KOH wet method were used respectively to detect these samples,and the results were compared.Results A total of 56 cases of fungal positive were detected with fluorescent staining method,while there were only 39 cases of fungal positive with KOH wet method.The positive detection rate of fluorescent staining method was higher than that of KOH wet method (χ2=5.79，P<0.05).Conclusion The fluorescent staining method is a rapid and accurate method to detect fungi.It is worth to be used in the department of dermatology for the early diagnosis of fungal infection.

fluorescent staining method;KOH wet method;fungal infection

福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目 (2013-S-128-4)

陳銳君，女 (漢族)，本科，初級檢驗(yàn)技師.E-mail:mone882003@qq.com

徐明,E-mail:15359725945@163.com

R 446.5

A

1673-3827(2016)11-0378-03

2016-08-03