王臣榮，張振杰，李俊強，余復昌，曹建科，張龍現(xiàn)

(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南省人獸共患病國際聯(lián)合實驗室，鄭州 450002)

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進口奶牛十二指腸賈第蟲感染情況及其多位點基因序列研究

王臣榮，張振杰，李俊強，余復昌，曹建科，張龍現(xiàn)*

(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南省人獸共患病國際聯(lián)合實驗室，鄭州 450002)

摘要：為了解進口奶牛十二指腸賈第蟲感染情況及其集聚體和基因亞型分布特征，作者基于SSU rRNA、tpi、gdh和bg基因位點對奶牛十二指腸賈第蟲進行PCR檢測。結(jié)果如下：基于SSU rRNA基因位點進行PCR檢測，奶牛十二指腸賈第蟲感染率為9.5%(48/507)，48份陽性樣品均為十二指腸賈第蟲集聚體E；斷奶后犢牛感染率最高(20.70%)，不同年齡段奶牛十二指腸賈第蟲感染率統(tǒng)計學差異極顯著 (P<0.01)?；趖pi、gdh和bg基因位點分別擴增出48份陽性樣品中19、28和34個，1份在tpi基因位點呈集聚體A和E混合感染。多位點基因序列分析和種系進化樹分析結(jié)果顯示，該場進口奶牛應為引進后感染十二指腸賈第蟲。研究表明進口成年奶牛不易攜帶人獸共患十二指腸賈第蟲，引種場奶牛傳播人獸共患十二指腸賈第蟲風險較低。

關(guān)鍵詞：十二指腸賈第蟲；集聚體；基因亞型；奶牛

十二指腸賈第蟲(Giardiaduodenalis)可感染包括人在內(nèi)的多種脊椎動物，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為重要的人獸共患寄生蟲之一[1]。在亞洲、非洲和拉丁美洲約有2億人感染十二指腸賈第蟲，且每年新增約50萬有腹瀉、嘔吐等臨床癥狀的賈第蟲病患者[2]。成年奶牛感染十二指腸賈第蟲后多無臨床癥狀，犢牛感染十二指腸賈第蟲后可出現(xiàn)腹瀉、吸收不良和體重減輕等癥狀[3]。賈第蟲病生活史簡單，主要通過“糞-口”途徑或直接攝入被污染的食物或水途徑進行傳播，流行病學研究表明，奶牛是人類感染十二指腸賈第蟲的重要傳染源[4]。

基于分子生物學研究，十二指腸賈第蟲是一個復雜的集合體，已鑒定8個(A-H)集聚體，其中集聚體A和B為人獸共患集聚體，集聚體E主要感染偶蹄類動物[1]。近年來，包括人在內(nèi)的多種動物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了集聚體E感染，提示該集聚體存在人獸共患性[1，5]。在比利時、美國、加拿大、丹麥、澳大利亞、葡萄牙等國家，奶牛以集聚體E為優(yōu)勢感染集聚體；相比之下，在意大利、加拿大和新西蘭等少數(shù)國家報道奶牛以集聚體A和B為優(yōu)勢集聚體[6]。國內(nèi)在河南省和黑龍江省進行的調(diào)查發(fā)現(xiàn)奶?？筛腥炯垠wA、B和E，存在人獸共患風險[6-7]。目前，我國已成為世界上最大奶牛進口國，然而有關(guān)進口奶牛攜帶十二指腸賈第蟲情況及其集聚體分布特征尚未見報道。本研究對某場自澳大利亞新引奶牛進行十二指腸賈第蟲分子流行病學調(diào)查，采用多位點序列分型方法進行基因亞型鑒定，并比較引進地奶牛十二指腸賈第蟲集聚體分布特征，以解析十二指腸賈第蟲的遺傳穩(wěn)定性及其生物安全影響。

1材料與方法

1.1樣品采集

調(diào)查樣品來自河南省某規(guī)模化進口奶牛場，該場于2013年4月20日從澳大利亞引進1 000頭荷斯坦成年奶牛(除此之外無其他奶牛)，采用人工授精方式進行配種繁育。2014年6月至2014年12月對該場隨機經(jīng)直腸采集507頭奶牛新鮮糞便樣品，每份10～30 g，裝入潔凈自封袋中，記錄信息，帶回實驗室，置4 ℃保存。奶牛年齡劃分參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部《奶牛標準化規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范(試行)》，60 d以下為斷奶前犢牛，61～180 d為斷奶后犢牛，181～450 d為育成牛，450 d以上為成年牛。

1.2DNA提取

每份糞便樣品取約200 mg，用美國OMEGA Bio-Tek公司生產(chǎn)的糞便DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Stool DNA Kit，D4015-02)，購于鄭州科貿(mào)生物技術(shù)有限公司，按說明書步驟操作，提取的DNA置-20 ℃保存。

1.3PCR擴增

基于小亞單位rRNA (SSU rRNA)基因?qū)λ袠悠愤M行賈第蟲檢測，引物及反應程序參照A.J.Appelbee等[8]的方法，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應體系：2 μL DNA (第2輪模板為第1輪PCR產(chǎn)物)，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，4 μL dNTPs (2.5 mmol·L-1)，12.5 μL 2×GC buffer II，0.25 μL LA rTaq 酶(5 U·μL-1)，加蒸餾水至25 μL?；赟SU rRNA基因鑒定出的陽性樣品，用磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)、谷氨酸脫氫酶(gdh)和β-賈第素(bg)位點進行基因亞型鑒定，引物及反應程序分別參照I.M.Sulaiman等[9]、S.M.Cacciò等[10]和M.Lalle等[11]的方法。反應體系：2 μL DNA，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，2 μL dNTPs (2.5 mmol·L-1)，2.5 μL 10 × Taq buffer，0.2 μL rTaq 酶(5 U·μL-1)，加蒸餾水至25 μL。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，置紫外凝膠成像儀內(nèi)觀察并拍照。

1.4測序

PCR產(chǎn)物測序委托北京諾賽基因有限公司完成，采用雙脫氧終止法進行雙向測序，測序儀為ABI PRISMTM 3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems，USA)。

1.5集聚體和基因亞型鑒定

序列經(jīng)拼接后，在GenBank上用Blast進行同源序列搜索，下載相應的參考序列應用Clustal X V2.0進行比對分析進而確定十二指腸賈第蟲集聚體的類型、基因亞型及不同序列間的堿基差異。

1.6種系發(fā)育分析

應用MEGA 6 (http：//www.megasoftware.net/) 軟件進行序列比對，在GenBank上用Blast進行同源序列搜索，采用鄰接法構(gòu)建種系進化樹，用bootstrap對進化樹進行可靠性分析，1 000個重復。

1.7統(tǒng)計學分析

采用χ2檢驗比較不同年齡段牛十二指腸賈第蟲感染率差異，P<0.05時為統(tǒng)計學差異顯著。

2結(jié)果

2.1十二指腸賈第蟲感染情況

基于SSU rRNA基因位點，奶牛糞便樣品中十二指腸賈第蟲感染率為9.5% (48/507)，其部分電泳結(jié)果見圖1。斷奶前犢牛、斷奶后犢牛和育成牛感染率分別為10.3% (17/165)、和20.7% (28/135)和2.9% (3/105)，成年牛未見感染。不同年齡段奶牛十二指腸賈第蟲感染率統(tǒng)計學差異極顯著(P<0.01)。

2.2集聚體和基因亞型鑒定

48條SSU rRNA序列經(jīng)比對鑒定，均為集聚體E。基于tpi、gdh和bg基因位點，對48份陽性樣品進行PCR擴增，分別擴增出19、28和34個。其中1份呈混合感染，在SSU rRNA基因位點鑒定為集聚體E，而在tpi基因位點為集聚體A。

基于tpi基因位點，18條集聚體E序列形成8個基因亞型，命名為E1～E8。E1 (n=7)是最主要的基因亞型，其序列與孟加拉奶牛源十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列一致(GenBank：KJ363351)；E2 (n=5) 序列與河南奶牛源(KF843945)、綿羊源(KP635102)和黑龍江奶牛源(JN162349)十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列一致；E8 (n=1) 序列與河南綿羊源(KP635101)和黑龍江綿羊源(JQ928713)十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列一致；E3 (n=1) 序列與河南綿羊源(KP635105)和澳大利亞綿羊源(GQ444457)十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列相比，分別有4和5個堿基的差異；E4 (n=1) 序列與吉林奶牛源(KM434077) 十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列有1個堿基差異，E5 (n=1) 序列與斯里蘭卡牛源(KF891310) 十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列有2個堿基差異，E6 (n=1) 序列與澳大利亞綿羊源(GQ444456) 十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列有1個堿基差異，E7(n=1) 序列與澳大利亞綿羊源(GQ444457)十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列有2個堿基差異。E1 (n=7)、E2 (n=5)、E3 (n=1)、E4 (n=1)、E5 (n=1)、E6 (n=1)、 E7(n=1)和E8 (n=1)分別和澳大利亞牛源(KF019197)十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列分別有4、3、6、3、5、5、3和3個堿基差異，見表1。本研究鑒定出的十二指腸賈第蟲集聚體A序列與河南牛源(KF843947)、澳大利亞牛源(GQ444447) 十二指腸賈第蟲分離株集聚體A序列一致。

基于gdh基因位點，28條集聚體E序列形成7個基因亞型，分別命名為E1～E7。E1 (n=17)是最主要的基因亞型，其序列與河南奶牛源(KF843925)、澳大利亞牛源(AY178740)十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列一致；E2 (n=1)序列與河南奶牛源(KF843924)+二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列一致； E3 (n=6)序列河南奶牛源(KF843923) 十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列一致；E4 (n=1)、E5 (n=1)、E6 (n=1)和E7 (n=1)序列分別與河南奶牛源(KF843925)十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列有1、1、2和2個堿基差異，見表1。

基于bg基因位點，34條集聚體E序列形成7個基因亞型，分別命名為E1～E7。E1 (n=18)是最主要的基因亞型，其序列與河南綿羊源(KP635114)十二指腸賈第蟲分離株集聚體E序列一致；E2 (n=5)、E3 (n=6)、 E4 (n=1)、E5 (n=2)、E6 (n=1)和E7 (n=1)序列分別與上述序列有2、1、1、1、3和2個堿基差異，見表1。

2.3種系發(fā)育分析

基于tpi基因序列建立種系發(fā)育系統(tǒng)進化樹，分為兩個系群，集聚體A和集聚體E，見圖2。如圖所示，確定分離到的集聚體A1亞型屬AI亞群。優(yōu)勢基因亞型E1和E2與孟加拉奶牛源、河南省奶牛源和綿羊源十二指腸賈第蟲序列在一個進化支上，形成一個亞群；E3和E6各形成一個亞群；E4和E8與河南奶牛源、吉林奶牛源和黑龍江綿羊源十二指腸賈第蟲序列形成一個亞群；E5與吉林奶牛源和斯里蘭卡牛源十二指腸賈第蟲序列形成一個亞群；E7與澳大利亞綿羊源和澳大利亞牛源十二指腸賈第蟲序列形成一個亞群。在gdh和bg基因位點，十二指腸賈第蟲核酸序列變異較小，未作種系發(fā)育分析。

表1十二指腸賈第蟲集聚體E在gdh、tpi和bg位點的核苷酸序列變異

Table 1Mutations in thegdh，tpiandbggenes amongG.duodenalisassemblage E isolates from cattle

堿基位置標號分別以參考序列KJ363351、KF843925和KP635114來確定，堿基位置1表示參考序列第1個核酸；“-”表示堿基相同

The sequence of KJ363351，KF843925 and KP635114 is regarded as reference sequence respectively，for example，the number one of base positions is the first nucleic acid；“-” represent the same as reference sequence

3討論

賈第蟲的流行病學調(diào)查常采用的標記基因有SSU rRNA、tpi、gdh、bg和延伸因子1-α (el1-α)等，其中tpi基因序列多態(tài)性變異較大，廣泛用于賈第蟲集聚體和基因亞型的分類研究[12]。本次調(diào)查，河南省某規(guī)?；瘓鲞M口奶牛十二指腸賈第蟲感染率為9.5%，略高于河南省(7.2%，128/1 777)、黑龍江省(6.4%，41/643)和寧夏回族自治區(qū)(2.12%，29/1 366)奶牛的感染率[6-7，13]。J.Ng等[14]報道澳大利亞西部和新南威爾士州小于4月齡犢牛十二指腸賈第蟲總感染率為26.9%(98/364)，而K.A.Becher等[15]報道澳大利亞西部犢牛感染率高達89% (48/54)。感染率差異往往受多種因素影響，如樣本采集量、檢測方法、地理環(huán)境、不同的管理方式和季節(jié)等。此次調(diào)查采用PCR方法檢測，奶牛十二指腸賈第蟲感染率高于國內(nèi)采用顯微鏡檢測法的報道[6，16-17]，低于澳大利亞采用PCR方法檢測的報道，表明不同檢測方法和不同地域奶牛十二指腸賈第蟲感染率存在差異。

資料顯示，不同年齡段奶牛十二指腸賈第蟲感染率存在著較大差異。R.M.O’Handley等[18]報道澳大利亞2～3月齡斷奶后犢牛十二指腸賈第蟲感染率最高為16%，而M.P.Mark-Carew等[19]調(diào)查發(fā)現(xiàn)紐約市31～60日齡斷奶前犢牛感染率較高，為2.5%。本研究發(fā)現(xiàn)斷奶后犢牛十二指腸賈第蟲感染率最高，成年牛未發(fā)現(xiàn)十二指腸賈第蟲感染，與R.M.O’Handley等[18]報道相一致，而與國內(nèi)河南省斷奶前犢牛十二指腸賈第蟲感染率(22.7%)和黑龍江省調(diào)查發(fā)現(xiàn)斷奶前犢牛十二指腸賈第蟲感染率(16.1%，22/131)最高存在差異[6-7]。分析其原因，可能與管理方法、動物健康狀態(tài)和飼喂環(huán)境等因素相關(guān)。

在東北地區(qū)的研究顯示，奶牛主要感染十二指腸賈第蟲集聚體E[12]；河南省奶牛除了感染集聚體E，人獸共患集聚體A亦常見[6]；而在黑龍江省則發(fā)現(xiàn)奶牛更常見感染人獸共患集聚體B，集聚體E次之[7]。在澳大利亞的調(diào)查顯示，奶牛最常見感染十二指腸賈第蟲集聚體E，偶見人獸共患集聚體A和集聚體B[14-15，18]。本研究基于SSU rRNA基因位點檢測到48份十二指腸賈第蟲均為集聚體E，基于tpi基因位點鑒定1份為集聚體E和A混合感染，表明該場奶牛感染的十二指腸賈第蟲人獸共患風險較低。

本研究基于多位點序列分析和種系進化樹分析，該場奶牛所感染的十二指腸賈第蟲主要基因亞型與澳大利亞牛源和綿羊源基因亞型差異較大，與河南省當?shù)啬膛Ｔ春途d羊源基因亞型序列差異較小，提示進口奶牛應為引進后感染十二指腸賈第蟲。此外，十二指腸賈第蟲常呈混合感染，應采用不同基因位點同時進行鑒定，以確定其基因型及序列多態(tài)性。

4結(jié)論

不同檢測方法和不同地域奶牛十二指腸賈第蟲感染率存在差異，所檢測進口成年奶牛不易攜帶人獸共患十二指腸賈第蟲，引種場奶牛傳播人獸共患十二指腸賈第蟲風險較低。

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(編輯白永平)

The Investigation of Infection and Multilocus Sequence ofGiardiaduodenalisin Dairy Cattle from an Imported Farm

WANG Chen-rong，ZHANG Zhen-jie，LI Jun-qiang，YU Fu-chang，CAO Jian-ke，ZHANG Long-xian*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，InternationalJointResearchLaboratoryforZoonoticDiseasesofHenanProvince，Zhengzhou450002，China)

Key words:Giardiaduodenalis；assemble；genotypes；dairy cattle

Abstract:We investigated the infection ofGiardiaduodenalisin dairy cattle from an imported farm，and then we analyzed the distribution of the genotypes and assemblage ofG.duodenalis.The detection ofG.duodenalisin dairy cattle base on the locus of SSU rRNA，tpi，gdhandbgby PCR. Results indicated that the prevalence ofG.duodenalisin dairy cattle is 9.8% (48/507) based on SSU rRNA by PCR，and 48 positive samples were identified assemblage E.The prevalence ofG.duodenalisin post-weaning calves was the highest (20.70%)，the difference of the prevalence ofG.duodenalisin cattle in different ages was significant.The 48 positive samples were amplified 19，28 and 34 base ontpi，gdhandbglocus respectively，one sample was mixed infection (assemblage A and assemblage E).Multilocus sequence and phylogenetic analysis indicated thatG.duodenalisinfecting dairy cattle from an imported farm may be from the local area. The results indicate that imported adult dairy cattle is not ease to carry ZoonoticG.duodenalis，dairy cattle from an imported farm have a lower risk to transmite ZoonoticG.duodenalis.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.022

收稿日期：2015-06-20

基金項目：十二五國家重大科技專項課題(2012ZX10004220)；河南省科技創(chuàng)新杰出人才計劃(134200510012)；河南省高?？蒲袆?chuàng)新團隊項目(012IRTSTHN005)

作者簡介：王臣榮(1985-)，男，河南南陽人，碩士生，主要從事人獸共患寄生蟲學研究，E-mail：1203431811@qq.com *通信作者：張龍現(xiàn)，教授，E-mail：zhanglx8999@henau.edu.cn

中圖分類號：S855.99

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0165-07