劉向萍，郭曉敏，李志騰，朱　靜，盛中偉，馬　騰，常國斌，竇新紅，王克華，陳國宏*

(1.江蘇省家禽科學研究所，揚州 225125； 2.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009)

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狼山雞NLRC5基因啟動子區(qū)SNP及其在先天免疫中的效應分析

劉向萍1#，郭曉敏2#，李志騰2，朱靜1，盛中偉1，馬騰2，常國斌2，竇新紅1，王克華1，陳國宏2*

(1.江蘇省家禽科學研究所，揚州 225125； 2.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009)

摘要：旨在通過檢測狼山雞NLRC5基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)位點，確定不同基因型的遺傳效應，并經(jīng)過后代分離群體驗證，以期篩選與先天免疫性狀相關的遺傳標記。本研究采用MALDI-TOF-MS技術對狼山雞群體NLRC5基因啟動子區(qū)SNPs位點進行掃描；同時測定部分免疫性狀，分析不同基因型個體免疫性狀的差異。結果發(fā)現(xiàn)，在g.628981處存在A/G突變，共AA、AG和GG 3種基因型，狼山雞不同基因型免疫指標間存在顯著差異，AA基因型個體的H/L值顯著低于GG基因型個體，而胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、淋巴細胞轉化率和IgG含量均顯著高于GG基因型個體(P<0.05)；在F2代AA和GG兩個分離群體中同樣發(fā)現(xiàn)AA型個體各項性狀值均優(yōu)于GG型個體。結合NLRC5基因在胸腺與脾組織中轉錄水平的差異，表明AA基因型個體表現(xiàn)出較好的先天免疫性能，NLRC5基因g.628981 (A/G)位點可作為先天免疫性狀有效的遺傳標記。

關鍵詞：雞；NLRC5基因；多態(tài)性；先天免疫

NLRC5蛋白是先天免疫系統(tǒng)中核苷酸結合寡聚結構域樣受體NLR(Nod-like receptor)家族的成員之一[1]，屬細胞內信號轉導受體，在免疫組織和器官中高水平表達，具有完整的傳遞識別病原體信號到引起特定的下游效應信號的能力[2]。NLRC5蛋白能夠通過阻止NF-κB通路中的IKKa和IKKb兩種關鍵激酶的磷酸化以及抑制IFN信號通路中外源RNA受體RIG-I和MDA5蛋白復合物的形成，從而達到抑制因這兩條通路活化所產生的炎癥反應[3]。NLRC5負向調控炎癥反應引起了國內外學者的關注，T.B.Meissner等[4]、E.Meylan等[5]在人和小鼠中均發(fā)現(xiàn)：NLRC5基因是調控先天免疫的關鍵分子，在動物機體的先天免疫中發(fā)揮重要作用。而且，人類NLRC5基因位點上的遺傳變異一定程度影響著炎癥或者某些傳染性疾病的易感性和防御性[6]，但至今關于禽類NLRC5基因的變異及其在先天免疫中的功能研究報道較少[7-8]。在現(xiàn)代家禽生產中，因各種因素導致的炎癥與先天免疫功能的損傷已成為困擾產業(yè)發(fā)展的突出問題。

鑒于NLRC5基因在維持先天性免疫穩(wěn)態(tài)及其抑制炎癥反應中發(fā)揮著極為重要的作用。本研究以狼山雞為研究素材，采用MALDI-TOF-MS技術對狼山雞群體的NLRC5基因啟動子區(qū)SNPs位點進行掃描，并且測定免疫指數(shù)(胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù))、淋巴細胞轉化率、異嗜性粒細胞/淋巴細胞比率(Heterophil/Lymphocyte，H/L)、IgG和IgM 6個免疫性狀，分析不同基因型免疫性狀的差異以及該基因的多態(tài)性對于免疫性狀的影響，以期為雞的抗病育種研究提供基礎資料。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗雞群來自江蘇如東狼山雞國家級保種場，選用同批出雛的健康狼山雞第一世代，按照常規(guī)飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)，整個試驗期雞群健康狀況良好，沒有發(fā)生疾病和其他不良情況。免疫程序見表1。在12周齡測定各免疫性狀值。按照第一世代NLRC5基因分型結果，根據(jù)基因型留種，公母比例1∶10，相同基因型個體間實行隨機交配與各家系等數(shù)留種得到第二世代，2種基因型個體在同一條件下飼養(yǎng)，營養(yǎng)水平和免疫程序相同，選取1、6、12周齡的每種基因型個體各20只(10公10母)進行屠宰。屠宰后取胸腺、脾組織，立即投入液氮速凍，速凍后樣品于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1雞群試驗期免疫程序

Table 1Immune procedure of experimental birds

1.2免疫性狀的測定

1.2.1免疫指數(shù)的測定稱取左胸腺和脾重量，與體重比較所得比值即為胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，單位：g·kg-1。

1.2.2H/L值的測定翅靜脈采血后立即做血涂片，用改良瑞氏染色液(聚乙烯吡咯酮9.9 g，加入500 mL甲醇中，搖勻使其溶解。待全部溶解后加入瑞氏染粉2 g，搖勻，溶后即可使用)染色[9]。鏡檢，按照M.L.Alfred等[10]的白細胞分類方法進行細胞分類，并按照J.L.Campo等[11]的方法進行計數(shù)和計算。

1.2.3淋巴細胞轉化率的測定[12]采用MTT法測定淋巴細胞轉化率，每個樣本做3次重復，采用全自動生化分析儀(卓越330，南京科華公司)檢測在570 nm處的吸光值。

1.2.4IgG和IgM含量的測定常規(guī)分離血清后，采用ELISA試劑盒法，利用全自動生化分析儀在450 nm處測定吸光值，繪制標準曲線，計算相應樣本濃度。

1.3DNA提取

翅靜脈采血0.4 mL，肝素鈉抗凝，加裂解液4 mL，用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE中，4 ℃冷藏備用。

1.4MALDI-TOF-MS基因分型

根據(jù)GenBank雞NLRC5基因(ID：100857413)啟動子序列(g.627212-630962)，通過混合樣本測序、NCBI 的SNP 數(shù)據(jù)庫篩選等方法，利用美國Sequenom 公司Sque-nomMassARRAY?分子量陣列平臺中iPLEXGOLD3.1軟件，對每個位點設計多重PCR反應的特異引物和單堿基延伸所用的延伸引物，軟件自動計算Tm 值、引物長度、PCR 產物長度和延伸產物分子量大小。具體引物信息見表2(不包含無多態(tài)位點信息)。

表2SNPs位點的質譜技術基因型分型引物

Table 2Primers information of SNPs genotyping by MALDI-TOF-MS

1.5熒光定量

按照Trizol法提取各組織中總RNA，使用Nanodrop 1000(Thermo Fisher公司)檢測RNA的濃度和質量。根據(jù)FastQuant RT Kit(with gDNase)試劑盒(北京天根生化有限責任公司)說明書進行逆轉錄合成第一鏈cDNA，產物cDNA置于冰上用于后續(xù)試驗或低溫保存。

熒光定量PCR以β-actin為內參基因，采用SYBR Green I染料法，試劑盒使用UltraSYBR Mixture(With ROX)CW0956(北京康為世紀生物科技有限公司)，使用ABI 7500熒光定量PCR儀。20 μL反應體系：2×UltraSYBR Mixture(With ROX)10 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，模板2 μL，RNase-Free Water 6 μL，每個樣品設4個重復。熒光定量分析的引物信息見表3。采用兩步法進行PCR擴增，反應條件：95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火 1 min，循環(huán)40次；根據(jù)熔解曲線上單一峰的有無判斷PCR擴增的特異性。相對定量的結果采用2-ΔΔCt方法進行處理。

表3用于熒光定量分析的引物信息

Table 3Primer sequences for Q-PCR

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計基因型和等位基因頻率，并對基因型分布差異進行卡方檢驗和Hardy-Weinberg平衡檢測，利用Align IR (v 2.0)軟件進行序列比對和SNP位點分析。利用SPSS13.0軟件One-Way ANOVA法對不同基因型個體間免疫性狀差異進行方差分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示。

2結果

2.1MALDI-TOF-MS飛行質譜分型

對NLRC5基因的啟動子區(qū)進行SNP掃描，結果發(fā)現(xiàn)，在第一世代143只狼山雞群體中，僅在g.628981處檢測出SNPs，呈現(xiàn)3種基因型，AA、AG和GG，其頻率分別為0.53、0.43和0.04，表明MALDI-TOF-MS飛行質譜檢出率達到100%，結果可靠。其中，AA型個體的序列與GenBank中的序列一致，GG型為突變基因型，野生與突變等位基因頻率分別為0.745和0.255。經(jīng)卡方適合性檢驗，群體NLRC5基因的等位基因頻率分布處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P=0.345)。

2.2不同基因型個體間免疫性狀的比較

對狼山雞群體NLRC5基因啟動子區(qū)不同基因型與免疫性狀進行關聯(lián)分析，結果見表4和表5。在第一世代中，狼山雞不同基因型的免疫指標間存在顯著差異，AA基因型個體的H/L值顯著低于GG基因型；而胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、淋巴細胞轉化率與 IgG含量均顯著高于GG基因型(P<0.05)；第二世代中，1～12周齡，AA與GG基因型之間相應的免疫指標同樣存在顯著差異(P<0.05)，呈現(xiàn)出與第一世代類似的趨勢，進一步表明AA基因型個體表現(xiàn)出較好的先天免疫性能。

表4第一世代不同基因型個體間免疫性狀的差異比較

Table 4Comparisons of immunity index of individuals with different genotypes in F1generations

同一列不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。下同

Values in the same column with different superscript letters mean significant difference(P<0.05).The same as below

表5第二世代不同基因型個體間免疫性狀的差異比較

Table 5Comparisons of immune traits of individuals with different genotype in F2generations

2.3不同基因型之間NLRC5表達比較

由圖1可知，第一世代與第二世代中各個生長階段胸腺與脾組織中，AA基因型個體NLRC5基因的表達水平大都顯著高于GG型個體。在不同周齡的胸腺組織中，AA基因型與GG型個體間表達差異水平基本穩(wěn)定，而在脾組織中，兩種基因型在前期差異水平較低，后期差異水平逐步增加，基本反映了雞的胸腺與脾組織發(fā)育的特點，胸腺作為中樞免疫器官，早在胚胎期開始發(fā)育，而脾為外周免疫器官，發(fā)育相對遲，同時也表明NLRC5基因與雞先天免疫功能的相關性。

3討論

NLRC5作為NLRs家族中分子結構最龐大的一員，引起諸多學者的關注，現(xiàn)有報道均證明該基因對動物機體的天然免疫反應起關鍵作用[13]，但作為家禽細胞內主要的免疫信號受體，其功能至今未闡明。本課題組先后克隆出雞NLRC5序列全長轉錄本，并提交至GenBank(登錄號：JQ044414)，同時發(fā)現(xiàn)雞NLRC5與哺乳動物同源性較低，其轉錄、表達水平亦存在差異[14]；因此本研究針對NLRC5啟動子序列進行SNPs掃描，探討該基因轉錄調控機制及其相應功能。研究發(fā)現(xiàn)，在狼山雞群里共檢測到3種基因型，2個等位基因，且處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。AA基因型為野生型，其序列與紅色原雞一致；AA基因型個體在兩個世代雞群的胸腺與脾組織中mRNA 表達水平顯著高于突變型個體，這表明該SNP位點可能影響機體的免疫功能。

本研究選取胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)作為檢測雞免疫器官發(fā)育差異的主要指標。胸腺的免疫功能主要是誘導T細胞的分化、成熟以及抗體的產生，脾作為抗體產生的主要組織，60%的B細胞由脾產生[15]。丁雁等[16]研究發(fā)現(xiàn)，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)可直接反映免疫器官的發(fā)育狀態(tài)，與機體先天免疫密切相關。研究表明，肉雞和蛋雞的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)遵循先變大后逐漸變小，最終達到一個平衡的狀態(tài)規(guī)律，其中胸腺指數(shù)值最大[17-18]，這與本研究的結果基本一致，表明本研究的試驗設計與免疫程序比較合理，并未影響免疫器官的正常發(fā)育規(guī)律。在兩個世代雞群里，AA基因型個體的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著高于GG型個體，表明不同基因型之間免疫器官發(fā)育存在一定的差異。同樣，在NLRC5 mRNA 表達水平方面，無論是在第一世代還是后代分離群體中任何發(fā)育階段，均發(fā)現(xiàn)兩種基因型存在差異；雖然在小鼠等其他動物中未見相關報道，但從本研究結果可以認為NLRC5啟動子區(qū)突變通過對其轉錄水平調控進而影響雞免疫性能。

在先天免疫性能指標方面，本研究以淋巴細胞轉化率、H/L值、IgG和IgM 4個性狀值作為評判依據(jù)。淋巴細胞轉化率值的高低反映機體細胞免疫功能的好壞，這在人類疾病診斷中已經(jīng)得到了廣泛應用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，1周齡狼山雞的淋巴細胞轉化率最小，而12周齡時最大，這表明隨著日齡的增加，機體抵抗外界病原微生物的能力正在增加。AA基因型個體在各個階段均表現(xiàn)出較高的淋巴細胞轉化率，與GG型存在顯著差異，表明兩種基因型在抵抗病原微生物能力方面存在差異。H/L值是細胞介導免疫的重要性狀之一，可以作為應激反應和抗逆性的指標。王存波等[21]研究表明，文昌雞和狼山雞的免疫抗應激和抗病性優(yōu)于外來品種安卡雞。本研究結果表明，狼山雞中AA基因型個體的H/L值顯著低于GG型，表明野生型抗應激能力要優(yōu)于突變型。免疫球蛋白方面，AA基因型個體IgG含量顯著高于GG型，IgM含量在兩種基因型個體間差異雖然不顯著，但總體上反映了不同基因型雞只體液免疫應答的能力差異，H.K.Parmentier等[22]證實，IgG等免疫球蛋白水平高的群體對感染性疾病的抗性優(yōu)于低的群體；綜合上述性狀差異分析表明，不同基因型個體間免疫功能確實存在一定差異，且野生型個體先天免疫性能優(yōu)于突變型。另外，在飛行質譜結果中發(fā)現(xiàn)，在紅色原雞、藏雞、茶花雞等野生種群以及近緣種群里只有野生基因型這一類型，而在現(xiàn)代商用白羽肉雞群體中只有突變型(未發(fā)表)，這也充分表明野生型雞種——紅色原雞、藏雞、茶花雞等具有先天免疫性能較強的特點。但是對于AA型成為有利基因型的遺傳機制還需要進一步研究，通過NLRC5基因調控區(qū)與轉錄因子的結合機制進行深入分析，探明NLRC5基因在不同種群中的轉錄調控機制，為雞的抗病育種研究提供了重要參考依據(jù)。

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(編輯郭云雁)

SNPs of Promoter Region ofNLRC5 Gene and Its Genetic Effect on Innate Immune Traits in Langshan Chicken Breeds

LIU Xiang-ping1#，GUO Xiao-min2#，LI Zhi-teng2，ZHU Jing1，SHENG Zhong-wei1，MA Teng2，CHANG Guo-bin2，DOU Xin-hong1，WANG Ke-hua1，CHEN Guo-hong2*

(1.JiangsuInstituteofPoultrySciences，Yangzhou225125，China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

Key words:chicken；NLRC5 gene；polymorphism；innate immune

Abstract:This study was conducted to detect single nucleotide polymorphisms(SNPs)inNLRC5 gene promoter region of Langshan chicken，and further determine genetic effects of different genotypes which were verified by progeny segregating group，aiming to develop genetic markers associated with innate immune traits.MALDI-TOF-MS method was applied to scan SNPs inNLRC5 gene promoter region；afterwards，some immune traits and their differences between individuals with different genotypes were analyzed.The SNP scanning results found A/G mutation at g.628981 site，along with 3 genotypes，namely，AA，AG and GG.The immune indexes presented significant difference among individuals with different genotypes.The H/L value of individuals with AA genotype was significantly lower than that of individuals with GG genotype，but spleen index，thymus index，lymphocyte transformation rate and content of IgG were significantly higher than that of individuals with GG genotype (P<0.05)；it was also found that the traits of individuals with AA genotype were better than that of individuals with GG genotype in F2generation of AA and GG segregating groups.Collectively，combining with the transcription differences ofNLRC5 gene in thymus and spleen tissues，our study indicate that birds with AA genotype show better performances of innate immunity and g.628981(A/G) site ofNLRC5 gene can be used as an effective genetic marker of innate immune traits.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.006

收稿日期：2015-01-26

基金項目：國家自然科學基金(31301966)；“十三五”國家科技計劃課顆(2015BAD03B03)

作者簡介：劉向萍(1977-)，女，江蘇張家港人，副研究員，主要從事家禽遺傳資源評價、保護與利用研究，E-mail：poultry@163.com;郭曉敏(1990-)，女，河北魏縣人，碩士生，主要從事家禽遺傳資源評價、保護與利用研究，E-mail：1083866231@qq.com。劉向萍和郭曉敏為并列第一作者 *通信作者：陳國宏，教授，E-mail：ghchenyzdx@163.com

中圖分類號：S813.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0041-07