冉旭華,劉陽陽,聞曉波

(黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院,黑龍江 大慶 163319)

副黏病毒反向遺傳研究進展

冉旭華,劉陽陽,聞曉波?

(黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院,黑龍江 大慶 163319)

反向遺傳學是對已知的生物基因序列進行適當?shù)男揎椇透脑旌蟛@取相應的表型,進而研究基因的變化對表型的影響等。副黏病毒屬于單股負鏈RNA病毒,其反向遺傳研究對其病毒蛋白的功能、致病機理及重組病毒的開發(fā)利用具有重要的研究價值,本文綜述了副黏病毒反向遺傳近年來的研究進展,為副黏病毒及單股負鏈RNA病毒的深入研究提供參考。

反向遺傳;副黏病毒;致病機制;病毒拯救

經(jīng)典遺傳學的研究規(guī)律是首先認識生物的表征特點,然后以此為基礎對遺傳物質(zhì)的差異性及進化規(guī)律進行研究。而反向遺傳學則是對已知生物基因序列進行適當?shù)男揎椇透脑觳@得相應的表型,隨之發(fā)展而來的技術(shù)稱為反向遺傳技術(shù)。RNA病毒的反向遺傳的出現(xiàn)使得人們能夠在c DNA層面對RNA病毒進行操作,為RNA病毒的生物學特性研究、致病機理研究以及重組疫苗載體研究開辟了新的道路。第一個成功拯救的RNA病毒是Qβ噬菌體［1],研究人員將含有噬菌體全基因c DNA克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,并成功拯救具有活性的Qβ噬菌體,該系統(tǒng)的構(gòu)建使得在DNA層面對RNA病毒進行研究成為可能。將含有單股RNA(single st rand RNA,ss RNA)病毒基因組的感染性克隆cRNA轉(zhuǎn)染真核細胞可直接獲得重組病毒,而單股副鏈RNA(single negative strand RNA,-ssRNA)病毒則不適用于這一方法,其拯救系統(tǒng)較為復雜。

副黏病毒家族成員均為-ssRNA病毒,包含了一大群影響公共健康與經(jīng)濟發(fā)展并可引起人及動物嚴重疾病的病原體［2],因此開展疫苗研發(fā)及致病機制的研究為相關(guān)疾病的防制具有重要意義。由于副黏病毒基因組結(jié)構(gòu)簡單,序列明確且具有較為深厚的反向遺傳學研究基礎,因此利用反向遺傳技術(shù)探索副黏病毒生物學特性以及疫苗開發(fā)是目前的研究熱點。本文以副黏病毒為-ssRNA病毒的代表,通過對副黏病毒的反向遺傳進展進行綜述,期望可以為副黏病毒以及-ssRNA病毒相關(guān)研究提供些許幫助。

1 副黏病毒反向遺傳策略研究

1994 年,科研人員成功拯救狂犬病毒(rabies virus,RV)［3],該研究證明了從cDNA水平直接拯救-ssRNA病毒的可行性。自此之后,人們對于-ss-RNA病毒的反向遺傳研究進入了一個新的階段,多個種屬的-ssRNA病毒反向遺傳系統(tǒng)相繼被建立。副黏病毒家族最早實現(xiàn)病毒拯救的是仙臺病毒(Sendai virus,SeV)［4]、麻疹病毒(M V)［5]以及人呼吸道合胞體病毒(H RSV)［6]。在此之后大部分副黏病毒通過反向遺傳技術(shù)獲得拯救并得到初步應用。對副黏病毒的研究表明,當病毒核苷酸總數(shù)為6的倍數(shù)時病毒可進行有效復制,這一發(fā)現(xiàn)被稱為副黏病毒的“六堿基原則”。進一步的研究發(fā)現(xiàn),核蛋白特異性的與6個核苷酸發(fā)生結(jié)合以及“六堿基原則”的出現(xiàn)可能是由于核苷酸與N-phase context之間正確的識別定位所導致的［7]。副黏病毒家族大多數(shù)成員嚴格遵循這一原則,但也有特例,如呼吸道合胞體病毒(RSV)［8]。這一原則的發(fā)現(xiàn)提示研究人員在進行副黏病毒反向遺傳操作時,不論是進行內(nèi)源基因的缺失、改造還是外源片段的插入都應當準確考慮到重組病毒基因組的核苷酸數(shù)目,因為這可能會影響到病毒的拯救效率。目前反向遺傳的病毒拯救主要分為兩種方法,即細胞外轉(zhuǎn)錄與細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。

1.1 細胞外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄是較早開發(fā)出來的在DNA水平上對RNA表達進行調(diào)控的分子生物學方法,對于大部分非逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒來說其復制過程并不涉及DNA中間體,這就大大限制了在基因水平上對RNA病毒的研究,而細胞外轉(zhuǎn)錄技術(shù)的出現(xiàn)為研究RNA病毒基因調(diào)控及分子遺傳方面提供了新的思路。細胞外轉(zhuǎn)錄,即在無細胞系統(tǒng)中以DNA作為模板, NTP為原料,在RNA逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下模仿體內(nèi)轉(zhuǎn)錄機制生成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄所用DNA模板應滿足以下條件:首先DNA模板長度應不小于拯救病毒的RNA基因組,其次全長序列要在T7或其他啟動子的控制之下,另外為了提高轉(zhuǎn)錄效率通常在啟動子后面人為地加上2到3個鳥嘌吟(G)殘基。正常的RNA病毒其基因組的5′端常帶有病毒基因組共價結(jié)合連結(jié)蛋白(Virus genome-linked protein,VPg),該蛋白由NIa-Pro蛋白酶從NIa的氨基端水解而得到且對于病毒基因組的復制具有重要影響。因此,為了模擬該結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄獲得的RNA序列還要在5′端加上帽子結(jié)構(gòu)CAP(m7GpppG),所謂CAP結(jié)構(gòu)是指真核生物蛋白表達過程中轉(zhuǎn)錄出的mRNA 5′端的一個特殊結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)的加入除了可以提高轉(zhuǎn)錄效率之外還可以增加轉(zhuǎn)錄RNA的穩(wěn)定性,保護其不被細胞中的核酸酶降解。與5′端相對應,即在轉(zhuǎn)錄RNA 3′端同樣需要一個穩(wěn)定的序列來保證穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄,這個序列被稱為poly(A),對脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)的研究表明:RNA病毒復制與其3′端poly(A)尾序列有關(guān)［9],推測該結(jié)構(gòu)與RNA病毒的體外轉(zhuǎn)錄亦具有重要關(guān)系。1984年,Ahlquist及其同事［10]利用體外轉(zhuǎn)錄方法成功拯救具有感染性的雀麥花葉病毒(Brome Mosaic Virus,BMV)。該研究成功搭建了以DNA為模板研究RNA病毒的橋梁,為RNA病毒研究開辟了新的方向。

1.2 細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA病毒的細胞外轉(zhuǎn)錄技術(shù)雖應用較廣但也有它自己的不足之處,如較低的轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)錄的不穩(wěn)定性使得拯救的病毒由于缺乏完整性而無法繼續(xù)復制,另外因細胞外轉(zhuǎn)錄技術(shù)需要價格高昂的轉(zhuǎn)錄試劑。因此,為了克服上述缺點,細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄技術(shù)應運而生,而副黏病毒的反向遺傳系統(tǒng)多是以該技術(shù)開發(fā)的。最初科研人員嘗試直接將連有RNA病毒cDNA克隆的重組載體直接轉(zhuǎn)染真核細胞但未獲得重組病毒,究其原因是缺乏必要的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄條件及適合的轉(zhuǎn)錄起始信號。

1.2.1 T7 RNA聚合酶拯救系統(tǒng)隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展,相繼建立起來越來越多的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。目前副黏病毒應用較多的是基于T7 RNA聚合酶體內(nèi)轉(zhuǎn)錄拯救系統(tǒng)［11]。具體方法是將體外構(gòu)建的在T7啟動子控制下全長cDNA克隆及輔助蛋白表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染能夠穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的真核細胞。一旦重組質(zhì)粒進入細胞,T7 RNA聚合酶便會特異地識別T7啟動子下游的外源片段并轉(zhuǎn)錄出全長RNA或mRNA,然后進入病毒自身的復制周期產(chǎn)生重組病毒。構(gòu)建穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶細胞的方法通常是在轉(zhuǎn)染前對細胞預先感染能夠表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒(vT F7-3)或建立能夠穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的細胞系。副黏病毒早期拯救策略選用的痘苗病毒是基于牛痘病毒W(wǎng) R株構(gòu)建的穩(wěn)定表達噬菌體T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3,然而由于vTF7-3可以在哺乳動物細胞上進行有效復制但產(chǎn)生明顯的病變,因此可能影響病毒的拯救效率。為了解決這一問題,研究人員嘗試利用具有宿主復制范圍的MVA痘苗株并以其為載體表達T7 RNA聚合酶,而研究人員利用MVA-T7成功拯救出了牛瘟病毒(rinder pest virus,RPV)與人副流感病毒3型(human parainfluenza virus type 3,HPIV3)［12]。

運用輔助病毒進行拯救的方法盡管經(jīng)過優(yōu)化但仍存在某些缺陷,如在不同細胞系中輔助病毒的感染量存在差異且不易清除。穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶細胞系的建立為上述問題的解決找到了新的出路。1995年,Radecke及其同事［5]構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達麻疹病毒核蛋白、磷蛋白以及T7 RNA聚合酶的人胚胎腎293細胞系(human embryonic kidney 293 cellline)并利用該細胞系成功拯救麻疹病毒,隨后Takeda等［13]發(fā)現(xiàn)利用重組痘病毒及穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的細胞系均可成功拯救高致病性麻疹病毒株IC-B,且拯救效率無明顯差異。1999年,研究人員利用新霉素篩選成功構(gòu)建穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的BHK-21細胞,即BSR T7/5細胞系,隨后研究人員利用該細胞系成功拯救牛呼吸道合胞體病毒(BRSV),并發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白NS2并不是病毒復制的必需因素［14]。這些發(fā)現(xiàn)為副黏病毒的反向遺傳研究奠定了基礎。

1.2.2 RNA聚合酶II拯救系統(tǒng)除T7 RNA聚合酶之外,利用哺乳動物細胞固有的RNA聚合酶I或II對副黏病毒進行拯救亦是另一種可行且有效的方法,由于不涉及到預感染輔助病毒及構(gòu)建穩(wěn)定表達T7RNA聚合酶的細胞系,故該方法是目前為止較為簡便的病毒拯救策略。最先應用RNA聚合酶進行病毒拯救的是分節(jié)段A型流感病毒［15],RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNAs具有穩(wěn)定的5′cap及3′poly(A)尾結(jié)構(gòu),在與通常用于核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶I聯(lián)合利用時可極大地提高重組病毒的拯救效率?？梢员籖NA聚合酶Ⅱ識別的啟動子包括巨細胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)啟動子、β肌動蛋白(β-actin)啟動子以及猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40, SV40)啟動子等。2002年,Le Mercier及其同事［16]在研究缺陷型狂犬病毒(Rabies virus,RV)時發(fā)現(xiàn),在病毒全長基因組cDNA克隆的兩端加入錘頭狀核酶序列(hammerhead ribozyme,HamRz)以及丁肝病毒核酶序列(hepatitis delta virus ribozyme, HdvRz)可顯著影響重組病毒的拯救效率,主要原因在于HamRz自我切割及HdvRz的反式切割作用可獲得正確長度的病毒RNA基因組,這將有利于后期的核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)裝配及重組病毒粒子的穩(wěn)定增殖。Inoue等［17]利用RNA聚合酶II識別的CMV啟動子在多個哺乳動物細胞系上成功拯救具有感染性的狂犬病毒,隨后利用該系統(tǒng)成功拯救副黏病毒科的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)［18]以及小反芻獸疫病毒(Pestedes petits ruminants virus,PPRV)［19]。

2 副黏病毒反向遺傳的應用

2.1 基因功能研究對目的基因進行適當修飾或者干擾相應蛋白的表達以研究其在病毒復制周期中的作用是目前研究病毒及宿主功能蛋白較為可行的方法。研究人員利用反向遺傳學技術(shù)成功拯救缺失部分非結(jié)構(gòu)N S2的重組B R S V,進一步研究發(fā)現(xiàn)缺乏完整N S2蛋白的重組病毒復制效率顯著低于野生親本毒株,進而推測N S2蛋白雖不直接構(gòu)成病毒粒子但在病毒復制的過程中也起到了重要作用［14]。2000年,S chmidt及其同事［20]構(gòu)建了F及H N蛋白被B PIV3替換的重組HPIV3,將該重組病毒人工感染恒河猴并發(fā)現(xiàn)相比于對照重組病毒在恒河猴上呼吸道以及下呼吸道的增殖及致病能力顯著下降,以上結(jié)果表明PIV3表面糖蛋白與病毒在宿主體內(nèi)的復制密切相關(guān)。

2.2 致病機理研究病毒結(jié)構(gòu)與功能有著密不可分的關(guān)系,特別是一些與病毒毒力相關(guān)的致病因子,利用反向遺傳學技術(shù)研究毒力因子的致病方式將有助于相關(guān)預防及治療藥物的開發(fā)與利用?？蒲腥藛T對新城疫病毒(N D V)不同分離株的研究發(fā)現(xiàn),融合蛋白F上的裂解位點是病毒毒力強弱的關(guān)鍵［21], Peeters等［22]在拯救NDV弱毒株的研究中將cDNA上F蛋白裂解位點突變?yōu)閺姸局甑臉酥拘孕蛄胁⒊晒φ染哂袕娭虏⌒缘腘DV重組毒株,該試驗再次證明了F蛋白裂解位點與NDV致病性的重要關(guān)系且為探索強毒株與弱毒株之間的進化規(guī)律找到了新的研究方法。為了研究副黏病毒P基因編碼產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白V與病毒毒力的關(guān)系,研究人員利用反向遺傳的方法構(gòu)建了V蛋白表達受限的重組NDV,對重組NDV在雞胚上增殖情況的研究發(fā)現(xiàn),V蛋白除了會影響病毒本身的增殖能力可能還介導了病毒在宿主細胞中的致病過程［23]。

2.3 弱毒疫苗制備傳統(tǒng)的弱毒疫苗制備大多是通過理化致弱或在異源動物或組織培養(yǎng)物中連續(xù)傳代獲得弱毒株,這種方法由于存在毒力返強、周期長且預期結(jié)果未知等風險,在應用上存在一定限制。而利用分子生物學方法如反向遺傳技術(shù)對病毒基因進行適當?shù)男揎棌母旧蠈Σ《镜纳飳W特性進行改造,在不影響病毒正常復制的前提下降低其致病性且保留較高的免疫原性,無回復突變至毒力返強的風險,且大大地縮短了研發(fā)周期,獲得可用于疫苗開發(fā)的致弱株。目前反向遺傳技術(shù)是疫苗研發(fā)中較為可行的方法,其他病毒疫苗的研發(fā)已經(jīng)提供了切實的例證,如禽流感疫苗的研發(fā)。

早期的RSV疫苗使用的弱毒株是化學方法篩選出的溫度敏感型,盡管在RSV陰性血清的黑猩猩身上表現(xiàn)出高度的致弱現(xiàn)象,但在臨床試驗中該疫苗在部分兒童體內(nèi)展現(xiàn)出了較高的復制能力與毒性,類似的情況也出現(xiàn)在其他候選疫苗中,安全有效的免疫原性與致弱性良好的疫苗株很難同時獲得。為了解決這一問題,1999年White head及其同事［24]利用反向遺傳學的方法對已有RSV弱毒株cpts248/ 404的L基因進行定點突變,獲得了充分減毒的重組疫苗株,該試驗的成功為本已遭遇到瓶頸的RS V弱毒疫苗開發(fā)找到了新的突破口。N-糖鏈是位于副黏病毒囊膜表面糖蛋白上的特殊結(jié)構(gòu),研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)與病毒侵入宿主細胞有關(guān)且影響著病毒的致病性,Panda等［25]利用反向遺傳方法構(gòu)建了HN蛋白N-糖鏈缺失的重組NDV病毒,對該重組病毒的進一步研究發(fā)現(xiàn),缺失N-糖鏈并不會對病毒的復制能力產(chǎn)生顯著影響且獲得的重組毒株毒力要低于親本株。PIV3是一種嚴重危害嬰幼兒的呼吸道病原體,為了開發(fā)安全有效的PIV3減毒疫苗,研究人員利用反向遺傳技術(shù)將PIV3囊膜表面糖蛋白的胞外區(qū)替換為PIV2弱毒疫苗的部分抗原結(jié)構(gòu),結(jié)果獲得了充分致弱的重組毒株,為PIV3弱毒疫苗研發(fā)提供了技術(shù)基礎。

2.4 嵌合病毒制備嵌合病毒是利用基因工程的方法人為創(chuàng)造具有多個親本毒株生物特性的重組病毒。在自然環(huán)境中個別病毒也會發(fā)生重組現(xiàn)象,但人們對新出現(xiàn)重組病毒的生物學特性未知,有一些毒株的致病力會減弱但有一些可能會增強,甚至出現(xiàn)新的高致病性毒株,而利用反向遺傳學方法創(chuàng)建的嵌合毒株由于親本基因序列及生物學特性已知,因此獲得重組病毒具有更高的可控性及安全性,另外部分寄生于不同物種之間的副黏病毒基因組較高的同源性以及種間差異對病毒復制的影響也為重組嵌合病毒的成功拯救以及安全使用提供了必要的先決條件。2000年,研究人員將BPIV3的F及HN編碼基因替換為HPIV3并成功構(gòu)建PIV3嵌合病毒rBPIV3-FHHNH,血清學試驗表明:新獲得的重組嵌合病毒可在靈長類動物身上有效誘導較高水平的HPIV3中和抗體［20],該重組病毒可開發(fā)為HPIV3候選疫苗及作為一種對抗其他病原的活疫苗載體。Buchholz等［26]通過反向遺傳學將牛RSV囊膜表面糖蛋白F和G替換為人RSV F和G,獲得重組人/牛嵌合RSV減毒重組疫苗,在黑猩猩身上的試驗表明該重組疫苗是安全有效的,而該疫苗的成功構(gòu)建也為新型人用RSV疫苗開發(fā)奠定了技術(shù)基礎。

2.5 活載體疫苗副黏病毒作為活載體疫苗具有極大的優(yōu)勢。首先,由于是RNA病毒其復制階段不存在DNA中間體因此不會整合到宿主基因組中;其次,副黏病毒可在多種細胞系中增殖,易于培養(yǎng)及大規(guī)模生產(chǎn);另外,副黏病毒基因組可裝載長度較大的外源片段且插入的外源蛋白具有較高的表達效率、穩(wěn)定性及免疫原性,而反向遺傳技術(shù)的出現(xiàn)使得外源片段的插入變得更為簡便［19,27]。截至目前副黏病毒載體主要為人和動物的呼吸道病毒,如SeV、BPIV3、HRSV以及NDV等。Schmidt及其同事以人/牛嵌合PIV3弱毒株為載體成功表達RSV糖蛋白G以及F,新獲得的重組病毒保留了PIV3載體病毒的致弱特點且可在靈長類動物身上有效誘導產(chǎn)生較高水平的PIV3與RSV抗體滴度［27-28],這意味著該毒株可被開發(fā)成為一種有效的人用PIV3/RSV二聯(lián)疫苗來對抗目前影響嬰幼兒呼吸系統(tǒng)的兩種主要病原體。Liang等［29]將RSV F蛋白插入到嵌合PIV3毒株基因組不同蛋白編碼序列之間,并以此來研究外源片段的插入位點與表達量的關(guān)系,結(jié)果表明除所有重組毒株增殖未受影響之外,當外源片段插入位置越靠近PIV3基因組3′端時其表達量越高且在F基因被插入到N-P基因之間、P-M基因之間以及HN-L基因之間時獲得的重組病毒溫度敏感性增強。Sawada及其同事［30]以重組麻疹疫苗株AIK-C為載體,將HRSV F基因(A2)插入到AIK-C P與M基因之間,誘導出的中和抗體可以對抗兩個病毒亞群,在棉鼠試驗中該重組毒株可賦予棉鼠較強的對抗HRSV-A亞群的能力,肺部平均病毒載量降低大于2.3 log;攻毒試驗中的交叉保護力對于異源B亞群較弱,肺部病毒載量僅減少0.5 log。

所有的病毒載體都應符合三個要求:①疫苗株在體內(nèi)能夠被有效弱化;②疫苗能夠?qū)共《镜膹椭埔约盀樯舷潞粑捞峁┍Ｗo;③能夠高效生產(chǎn)病毒種子。非人源載體如SeV和B PIV3的使用應避免機體對于該載體的免疫應答,因為這將會顯著降低疫苗的效價。這些載體被認為對人類的影響較小,它們雖然可以感染人但不會造成嚴重疾病。即便如此,它們還是受宿主限制的,因此更深入的研究應當是放在這些載體轉(zhuǎn)染人類細胞的能力以及對于目標的有效性上。

3 展望

隨著反向遺傳技術(shù)的不斷完善和發(fā)展,越來越多的副黏病毒可以通過反向遺傳技術(shù)來進行基因復制與表達調(diào)控機理、病毒與宿主間相互作用關(guān)系、病毒蛋白功能、致病機制、基因治療研究、構(gòu)建新型病毒載體表達外源基因和病毒重組疫苗制備等領(lǐng)域的研究,為更加深入了解這一類病毒的遺傳進化、生物特點提供理論支撐,也有利于相關(guān)特效治療藥物和高效安全疫苗的研發(fā)從而更好防控這一類疾病提供新的研究方向和科學依據(jù)。同時,由于人工合成的具有生物活性的轉(zhuǎn)錄本,在病毒復制時可能發(fā)生重組和基因突變等,可能產(chǎn)生出不可預知的新病毒,因此在進行反向遺傳相關(guān)操作時要充分考慮到生物安全問題,以避免基因污染,使這一技術(shù)更好地為人類服務。

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Update of reverse genetics for Paramyxoviruses

Ran Xuhua,Liu Yangyang,Wen Xiaobo*
(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

Reverse genetics provides an important tool by which the function of gene of interest can be analyzed after the specific modification and deletion in the given gene is generated.Paramyxoviruses belong to single negative strand RNA virus family and development of the reverse genetics system,especially for single negative strand RNA viruses including paramyxoviruses,enables to facilitate the studies of viral protein function,pathogenic mechanism,as well as vaccine preparation based on recombinant viruses by reverse genetics.This paper reviews the newest research progress of reverse genetics for the members in Paramyxovirus family in an attempt to providing reference.

Reverse genetics;Paramyxovirus;Pathogenic mechanism;Viral rescue

S852.65

A

1672-9692(2016)10-0053-07

2016-08-02

冉旭華(1978-),女,博士,副教授,研究方向:分子免疫學。

聞曉波(1977-),男,博士,副教授,研究方向:分子病毒學。

黑龍江省農(nóng)墾總局“十二五”重點科技計劃項目(HNK125B-11-08A,HNK125B-11-02);“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2012BAD12B03-3);黑龍江八一農(nóng)墾大學研究生創(chuàng)新科研項目(YJSCX2016-Y27)。