丁麗艷，何寶國，宋 斌，郭曉梅，郭立宏，海 龍，李同豹，李信濤

(1.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005;2.齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000;3.齊齊哈爾市家畜繁育指導站，黑龍江 齊齊哈爾 161000;4.吉林省松原職業(yè)技術學院，吉林 松原 138000)

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哺乳動物胚胎切割技術研究及應用進展

丁麗艷1，何寶國2，宋 斌1，郭曉梅3，郭立宏1，海 龍1，李同豹1，李信濤4

(1.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005;2.齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000;3.齊齊哈爾市家畜繁育指導站，黑龍江 齊齊哈爾 161000;4.吉林省松原職業(yè)技術學院，吉林 松原 138000)

胚胎切割是研究細胞分化、早期胚胎發(fā)育、胚胎遺傳性能的主要方法，也是早期胚胎性別鑒定的必要手段。文章介紹了胚胎分割技術研究進展，不同發(fā)育階段胚胎分割方法，影響分割胚胎的成活效果因素以及胚胎分割技術的應用，以作參考。

哺乳動物；胚胎分割；顯微操作

胚胎切割是哺乳動物胚胎工程的重要組成內容，是應用顯微手術的方法，將一枚胚胎分割成二分、四分甚至八分胚，經體內或者體外培養(yǎng)，然后移植入受體中，獲得同卵雙生或同卵多生后代的技術。胚胎分割是擴大胚胎數(shù)量的有效方法，也是胚胎克隆技術的一種，其不僅增加了優(yōu)秀個體數(shù)量，而且還可將同卵雙生后代用于各種試驗研究，能排除遺傳特性差異所帶來的影響，在科學研究和畜牧生產中具有重要的意義。

1 哺乳動物胚胎切割技術的研究進展

1901年Spemann首次將蛙的兩個卵裂球分離開，人工產生了雙胞胎。1970年Mullen等將小鼠2-細胞胚胎的兩個卵裂球分開，經過體外培養(yǎng)后再移植給受體，產生了哺乳動物的首次人工雙胞胎。1978 Moustafa等將小鼠桑椹胚一分為二，得到雙胞胎。1979年Willadsen[1]和Meineck-Tillmann等分別將綿羊2-細胞胚胎和桑椹胚一分為二，獲得同卵雙胞胚。80年代以來，哺乳動物胚胎分割技術飛速發(fā)展。Willadsen[2]等在總結前人的基礎上，對胚胎分割進行了系統(tǒng)的研究，創(chuàng)造出了毛細管分離法，并先后分離2、4、8細胞綿羊胚胎，獲得后代羔羊。毛細管分離法雖然具有較高的同卵多生的優(yōu)點，但需要瓊脂包埋和中間體的體內培養(yǎng)，很難做到與受體同期化，且操作復雜。1982年，Ozil等[3]把分割后的牛的半胚分別裝入空透明帶內，移植獲得同卵后代。后來，Gatica等(1984)簡化的操作方法，將細胞團從切開的透明帶中取出，用玻璃針一分為二，再將半胚分別移入空透明帶中直接移植，獲得了7只雙胎。1984年，Williams等[4]用顯微手術刀分割牛桑椹胚和早期囊胚，獲得9頭雙胎犢牛。

后來，胚胎切割和性別鑒定技術結合起來，以及嵌合體的應用，為胚胎切割技術擴大了應用和推廣的范圍。

我國胚胎切割技術的發(fā)展與應用20世紀80年代發(fā)展迅速。1988年，譚麗玲[5]等分割兔半胚產仔，1989年張涌等[6]山羊凍胚分割產羔，90年代前后分割牛羊成功，郭志勤等于1989年獲得奶牛凍胚分割植后產同卵雙犢和1992年綿羊鮮胚分割四分胚移植產同卵羔[7-8]；1989年牛四分胚成功產犢。

通過胚胎分割技術還可獲得性別和遺傳上完全相同的同卵孿生或多生后代，為遺傳學、生理學、營養(yǎng)學等研究提供寶貴試驗材料。目前二分胚成功的有小鼠、兔、綿羊、山羊、牛、馬和人。四分胚成功的有兔、綿羊、豬、牛、馬，八分胚成功的有兔、綿羊、豬。

2 胚胎切割方法

2.1 微細管吹吸法

借助顯微操作儀，在D-PBS培養(yǎng)液中，左手持固定吸管吸住胚胎，右手操作玻璃微針切開胚胎透明帶，細胞團即從透明帶中脫出，用毛細管吹吸胚胎，得到單個卵裂球，再將其裝入空透明帶中，體外培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚期，移植入同類受體中。此方法適于分離二細胞期到八細胞期卵裂球。

2.2 顯微手術法

在顯微操作儀的幫助下，在D-PBS液內，用固定吸管吸住胚胎，用玻璃針或顯微手術刀將胚胎對稱切割。這種方法適于分割桑椹胚和囊胚期胚胎。

2.3 徒手分割法

在立體顯微鏡下，徒手握住特制切割刀，在皿底部輕輕劃痕，然后將胚胎輕輕推入劃痕處，通過增大摩擦力來固定住胚胎，將刀片自上而下垂直切割胚胎，操作過程要快，一刀切開。這種方法多用于切割桑椹胚和囊胚。

3 影響切割胚成活效果的因素

3.1 胚胎發(fā)育時期

不同發(fā)育時期的胚胎分割后，其發(fā)育能力是有差異的。1984年，Williams 等[4]用顯微手術刀分割5.5～7.5日齡牛胚胎，晚期桑椹胚、早期囊胚和囊胚的半胚移植妊娠率分別為47.5%、60.4%和53.6%。1989年，張涌等[6]分別利用不同發(fā)育時期的羊半胚切割移植，結果晚期桑椹胚、囊胚、孵出囊胚和孵出增大胚泡各組半胚生產羔羊的成功率分別為12.5%、20%、25%、62.5%。1995年，馬寶華[8]報道，安哥拉山羊早期囊胚、囊胚和擴張囊胚的半胚移植后成羔率分別為28.6%、33.3%和9.5%。由以上報道可以看出囊胚半胚的成犢率高于來自于桑椹胚的半胚。

3.2 胚胎切割次數(shù)

四分胚的成活力、妊娠率、雙胎率都遠低于二分胚。1992年竇忠英[9]等將18枚7日齡奶牛胚胎一分為四分割的半胚移植給受體，只有9頭受孕 ，受孕率為50%。Rho等[10](1998 )發(fā)現(xiàn)四分牛的桑椹胚和囊胚只得到一個四分胚后代。

3.3 透明帶的完整性

透明帶可以阻止微生物和病毒進入胚胎內部，對胚胎具有一定的保護作用。但桑椹胚和囊胚時期，半胚有無透明帶對妊娠率沒有太大影響。1995年，馬保華等[8]用鏈霉蛋白酶液軟化透明帶后分割胚胎，試驗結果發(fā)現(xiàn)可降低半胚存活率。Sotomaru等[11]曾發(fā)現(xiàn)，有透明帶的分割胚比無透明帶的分割胚對凍融有更高的抵抗力。2000年賴雙英[12]等用酶分離小白鼠早期胚胎，獲得的卵裂球沒有透明帶也能夠繼續(xù)發(fā)育。張涌等[6](1989)對稱分割山羊孵出增大胚泡，不裝透明帶移植其裸半胚，仍可繼續(xù)發(fā)育形成正常胎兒，而且獲得較高的同卵雙生率。

3.4 植入半胚的數(shù)量

許多學者研究表明，移植1枚半胚妊娠率低于同時移植2枚半胚的妊娠率。Lambeth 等 (1983)對半牛胚移植研究表明，同等條件下，移植1枚或2枚半胚于受體牛的黃體側子宮角后，妊娠率分別為 16.7%(1/6) 和62.5%( 5/8)，而且后者獲3對同卵雙生。Maurer等 (1988)將2枚綿羊半胚移植于受體羊黃體側或雙側子宮角各1枚時，妊娠率分別為57.1%和20.0%。馬保華等[8](1995) 的實驗也同樣證明將2枚裸半胚同時移植于受體羊黃體側子宮角后，獲得了較好的結果。

3.5 半胚在體外停留時間

Bader(1985)研究證明鮮胚分割后用血清PBS液培養(yǎng)4h以上后妊娠率降低。陶濤等[13](1991) 對奶牛胚胎分割實驗發(fā)現(xiàn) ，半胚在體外滯留時間超過4 h和受體的黃體發(fā)育不佳均顯著降低半胚的受胎率。DearmasR(1986)報道在20% FCS- PBS液中培養(yǎng)2h的半胚，其存活力最高。可見，半胚在體外停留時間對半胚成活力的影響較大，超過4個小時后存活力會大大降低。

4 胚胎切割技術的應用

4.1 胚細胞核移植

胚胎切割可為基因治療和基因活性的研究提供有利的動物模型。早期胚胎細胞是一群遺傳上同質的細胞，以胚胎細胞作為核供體，進行動物核移植，可為各項研究提供大量材料。Meng[14]等(1997)將獼猴的單個卵裂球進行卵母細胞注射，經過體外培養(yǎng)和移植后，生出一對不同性別的兩個后代。1998年，Le[15]等分離牛的單個卵裂球作為核供體，生出克隆牛。

4.2 構建異胚重構體

將供體的細胞核，移植到處于第二次減數(shù)分裂中期的去核卵母細胞中，在卵母細胞相關因子的作用下，細胞核發(fā)生重編程恢復到發(fā)育的起點狀態(tài)，重構胚具有重新發(fā)育成新個體的能力。制作重構胚并將其移植到受體中，讓其生長發(fā)育成為新的動物，這也是制備轉基因動物的方法。

4.3 生產嵌合體

應用顯微操作技術，將同種或異種胚胎的卵裂球分離出來，裝入同一個透明帶內，將兩個半胚融合在一起，經體外培養(yǎng)后移植入受體中，嵌合體動物對于研究種間妊娠中母胎之間的相互作用和母體的免疫識別有重要意義。

4.4 胚胎性別鑒定

在胚胎移植前將胚胎切割約十分之一，然后將取下的部分通過染色體分析、H-Y抗原抗體免疫學和PCR技術進行性別鑒定，在胚胎早期即可得知胚胎性別，進而生產出已知性別的動物，在動物的性別需要育種中意義重大。

4.5 生產同卵雙生后代

在牛上不僅可以移植半胚生產同卵雙胎，增加后代數(shù)量，而且可避免異性雙胎不孕現(xiàn)象的發(fā)生。清家升[16](1991)報道，每頭受體牛移植兩枚半胚和一枚半胚的胚胎著床率分別53.8%和48.4%，同時移植兩枚半胚的雙犢率為15.4%，而分別移植半的同卵雙犢率為45.2%。

4.6 保存珍稀家畜動物的種質資源

胚胎分割技術可以增加優(yōu)秀種畜、瀕危珍稀動物以及有價值的轉基因動物的數(shù)量，并且根據(jù)需要可長期保存這些動物的物種。

5 小結

胚胎切割技術可使胚胎數(shù)量成倍地增長，獲得到同卵雙生后代，在試驗研究和瀕危動物的保種中具有重要的應用價值。但胚胎分割技術也存在半胚移植后的妊娠率和產仔率不高，后代體質弱、體重低等問題，這需要研究者從胚胎分割方法、分割胚的有效培養(yǎng)、保存方法等方面進一步研究，提高分割胚的妊娠率，同時隨著生物技術的不斷發(fā)展，胚胎分割技術的應用價值也會有更廣闊的應用前景。

[1] Willadsen S M. A method for culture of micromanipulated sheep embryos and its use to produce monozygotic twins[J].Nature，1979，277：298-300.

[2] Willadsen S M.Cloning of sheep and cow embryos[J].Gamete Res，1989，22：257-263.

[3] Ozil JP. Production of monozygotic twins by micromanipulation and cervical transfer in the cow[J].Veterinary Record，1982：126-127.

[4] Williams TJ, Elsden RP, Seidel GE. Pregnancy rates with bisected bovine embryos[J]. Theriogenology, 1984, 22(5): 521-531.

[5] 譚麗玲，李樂義，廖和模，等.奶牛四分胚分割研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，1992，23(4)：289-294.

[6] 張涌，錢菊芬. 山羊胚胎分割及同卵雙生試驗[J].畜牧獸醫(yī)學學報，1989，20(2)：97-101.

[7] 郭志勤. 家畜胚胎工程[M].北京：中國科技出版社，1998.

[8] 馬寶華. 安哥拉山山羊胚胎徒手分割和移植試驗[D].西北農業(yè)大學碩士論文，1995.

[9] 竇忠英，王新莊，樊敬莊，等. 奶牛胚胎一分為四移植試驗[J].西北農業(yè)大學學報，1992，20(2)：1-4.

[10] Rho GJ, Johnson WH, Betteridge KJ. Cellular composition and vilbility of demi-and quarter-embryos made from bisected bovine morulae and blastocysts produced in vitro[J]. Theriogenology, 1998,50:885-895.

[11] Sotomaru Y, Kato Y, Tsunoda Y. Production of monozygotic twins after freezing and thawing of bisected mouse embryos[J]. Cryobiology, 1998, 37:139-145.

[12] 賴雙英，菊林花，晁玉慶，等. 用酶分離小鼠早期胚胎的研究[J]. 內蒙古農業(yè)大學學報，2000，21(3)：46-49.

[13] 陶濤，朱裕鼎. 奶牛胚胎分割和移植的研究[J]. 山東農業(yè)大學學報，1992，22(1)：11-16.

[14] Meng L, Ely JJ, Stouffer RL, et al. Rhesus mondeys puoduced nuclear transfer[J].Biol Reprod,1997, 57:454-459.

[15] Le Bourhis D, Chesne P, Nibart M, et al. Nuclear transfer from sexed parent embryo sincattle:efficiency and birth of offspring[J]. J Reprod Fertil,1998,113:343-348.

[16] 清家升，汪連濤. 牛半胚移植技術的應用[J]. 國外畜牧學，1991，5：16-18.

2016-07-19

丁麗艷(1971-)，女，黑龍江綏化人，研究生，研究員，研究方向：分子生物育種。

10.19369/j.cnki.2095-9737.2016.10.005

S814

A

2095-9737(2016)10-0011-02