陳興銀，張玉晶，張凱凱，楊 鵬，石建明

(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

瀕危植物珙桐大小孢子形成和雌雄配子體發(fā)育觀察

陳興銀，張玉晶，張凱凱，楊 鵬，石建明*

(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

利用石蠟切片法對不同發(fā)育階段的珙桐花器官進行解剖并研究。結(jié)果表明：花藥壁的發(fā)育類型是雙子葉型，小孢子母細胞減數(shù)分裂過程中的胞質(zhì)分裂為同時型，四分體為四面體型。成熟花粉粒為二細胞型，具有3個萌發(fā)溝。珙桐的胚珠為直立胚珠，厚珠心，單珠被，胚囊為單孢子發(fā)生類型，為典型的蓼型胚囊發(fā)育方式，通過連續(xù)切片的觀察，沒有發(fā)現(xiàn)大小孢子發(fā)生及雌雄配子體形成的異常。

珙桐；大孢子；小孢子；雄配子體；雌配子體

珙桐(DavidiainvolucrateBaill.)具有鴿子樹的美稱，中國特有的單型屬植物。珙桐科僅一種和一變種，即珙桐和光葉珙桐(D.involucratevar.vilmoriniana(Dode)Wanger)[1-2]。珙桐具有很高的觀賞價值，不僅是世界上認可的著名觀賞樹種，也是綠化園林的理想樹種。自珙桐被發(fā)現(xiàn)后，被大量引種繁殖，目前的分布范圍已跨越自生自然生長環(huán)境的地理分布，其趨勢是北移和低海拔[3]。1897年法國傳教士從中國帶回珙桐種子開始，“中國鴿子樹”珙桐開始走出國門，被北美和歐洲廣為種植，成為世界著名的觀賞樹種。江蘇、浙江、福建、河北、北京、安徽、鄭州、南京、上海、武漢等城市已成功引入珙桐[4-5]。珙桐起源古老，是第三紀古熱帶植物的孑遺樹種，屬國家一級保護植物[6-8]。珙桐是一種更新困難，種子發(fā)芽率低的樹種，有關珙桐的研究主要集中在珙桐的生長環(huán)境、生物學特性、群落特征、遺傳多樣性、生理生化等方面，而有關珙桐的細胞學生物學研究較為少見[9-11]。本研究利用石蠟切片方法，對珙桐大、小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育過程進行了解剖觀察，為珙桐的胚胎學研究積累資料，揭示珙桐的繁育特性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

材料采自貴州省林業(yè)科學研究院和貴州省植物園，從花芽分化到果實成熟各個階段的材料均有采集，花芽或花序用50%FAA固定液固定。

1.2 實驗方法

本實驗采用石蠟切片法[12]。材料經(jīng)過酒精梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(厚度8～10 μm)、番紅-固綠染色、加拿大樹膠封片等過程。再用Olympus SZ 61體視鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子發(fā)生和雄配子體的形成

2.1.1 小孢子形成

珙桐花藥中孢原細胞經(jīng)過分裂，形成初生造孢細胞，初生造孢細胞再分裂，形成次生造孢細胞(圖1：a)。次生造孢細胞排列緊密，其進一步發(fā)育為小孢子母細胞，小孢子母細胞體積較大，無顯著液泡，細胞核為染色較深的圓球體(圖1：b)。

小孢子母細胞進入減數(shù)分裂第一次分裂，即細線期(圖1：c)，細胞體積迅速增長，核中出現(xiàn)細長纏繞成團的染色質(zhì)絲。隨后同源染色體進行配對，染色質(zhì)絲清晰可見，即為偶線期(圖1：d)、絲狀染色體增粗變短，進入粗線期(圖1：e)、之后染色體變粗縮短，二價染色體交叉形成V字形、十字形，即為雙線期(圖1：f)、雙線期后，進入終變期(圖1：g)、終變期結(jié)束后進入減數(shù)第一次分裂中期(圖1：h)、同源染色體分離且數(shù)目減半，即減數(shù)第一次分裂后期(圖1：i)、染色體移至兩極后開始消失，減數(shù)第一次分裂末期(圖1：g)，隨后進入第二次減數(shù)分裂，即間期Ⅱ(圖1：k)、前期Ⅱ(圖1：l)、中期Ⅱ(圖1：m)、后期Ⅱ(圖1：n)、末期Ⅱ(圖1：o)，最后形成四分體(圖1：p)。在減數(shù)分裂時期，珙桐小孢子母細胞的胞質(zhì)分裂為同時型，四分體時期，珙桐小孢子四分體為四面體型。

2.1.2 雄配子體發(fā)育

四分體時期，胼胝質(zhì)壁溶解，單核小孢子從四分體中游離出來，單核小孢子細胞壁薄，胞質(zhì)濃厚，核位于細胞中央。隨后，細胞核和細胞質(zhì)被移向細胞的一側(cè)，此時花粉進入單核靠邊期(圖1：q)。最后，單核花粉粒進行一次不均等的有絲分裂形成含有一個營養(yǎng)細胞和生殖細胞的二細胞的花粉粒，即成熟花粉(圖1：r)。

2.1.3 花藥壁的發(fā)育

珙桐花藥含有4個花粉囊，兩側(cè)兩個花粉囊相通，中間為藥隔。花粉囊內(nèi)含有許多花粉粒(圖1：s)。花藥在發(fā)育的初期，結(jié)構(gòu)簡單，外圍一層幼齡的表皮，內(nèi)側(cè)為一群形態(tài)相同的分生細胞。隨著花藥的發(fā)育，在花藥四角的表皮內(nèi)方，出現(xiàn)一些分裂旺盛的細胞，即孢原細胞。

孢原細胞進行平周分裂，形成外層壁細胞和內(nèi)層造孢細胞。壁細胞繼續(xù)進行平周分裂和垂周分裂，由外向內(nèi)逐漸形成藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層，和表皮一起組成了花粉囊的壁(圖1：b)。在小孢子母細胞減數(shù)分裂形成小孢子的過程中，藥室內(nèi)壁細胞徑向延長，纖維加厚，又稱為纖維層，其作用被認為有助于花藥的開裂。藥室內(nèi)壁在形成纖維層時，在2個花粉囊交接處的外側(cè)，留下一狹條形的薄壁細胞，即唇細胞，花粉粒成熟以后，花藥在此處開裂，花粉隨即散出?；ㄋ幊墒鞎r，花粉壁僅?；ㄋ巸?nèi)壁和殘存的表皮，中層細胞逐漸吸收解體；在四分體時期，絨氈層在原位出現(xiàn)解體的跡象，為分泌型絨氈層(圖1：q)。

圖1 珙桐小孢子發(fā)生和雄配子體的形成Fig.1 The Microsporogensis and Development of Male Gametophyte ofDavidia involucrate a.造孢細胞；b.小孢子母細胞時期；c.減數(shù)分裂第一次前期Ⅰ細線期；d.偶線期；e.粗線期；f.雙線期；g.終變期；h.減數(shù)分裂第一次中期Ⅰ,箭頭示染色體排列在赤道板兩側(cè)；i.后期Ⅰ，箭頭示染色體均等分布在兩極；j.末期Ⅰ；k.減數(shù)分裂第二次間期Ⅱ；l.前期Ⅱ；m.中期Ⅱ；n.后期Ⅱ；o.末期Ⅱ；p.四分體時期；q.單核靠邊期；r.成熟花粉時期；s.花橫切；Ep.表皮；En.藥室內(nèi)壁；MI.中層；Ta.絨氈層細胞；MMC.小孢子母細胞；

2.2 大孢子形成及雌配子體發(fā)育

2.2.1 大孢子形成

珠心組織是一團相似的薄壁細胞，在靠近珠孔一端表皮下分化出單一的孢原細胞。孢原細胞進行一次平周分裂，形成周緣細胞和造孢細胞。周緣細胞進一步發(fā)育為珠心組織。造孢細胞(圖2：b)發(fā)育為大孢子母細胞，大孢子母細胞(圖2：c)經(jīng)過減數(shù)分裂后形成四分體，四個細胞排列成縱行(圖2：d)?？拷榭椎?個細胞逐漸退化，靠近合點端的大孢子發(fā)育成功能大孢子。

圖2 珙桐大孢子發(fā)生和雌配子體的形成Fig.2 The Megasporogenesis and Development of Female Gametophyte of Davidia involucratea.雌蕊結(jié)構(gòu)；b.孢原細胞；c.大孢子母細胞；d.四分體時期；e.功能大孢子；f.二核胚囊；g.四核胚囊；h.八核胚囊；i.形成中央細胞；AC.孢原細胞；Me.大孢子母細胞

2.2.2 雌配子體發(fā)育

雌配子體的發(fā)育開始于成熟的功能大孢子(圖2：e)。功能大孢子繼續(xù)發(fā)育，形成單核胚囊。單核胚囊經(jīng)歷一次有絲分裂發(fā)育成2核胚囊(圖2：f)，胚囊周圍的珠被內(nèi)表皮細胞也繼續(xù)徑向延伸，變得扁平。隨后2個核分別移向珠孔和合點的位置，并進行第2次有絲分裂，進入4核時期(圖2：g)。4個核各自進行第3次有絲分裂，形成8核胚囊結(jié)構(gòu)(圖2：h)。此時，胚囊的兩端各有4個核，之后，兩端各有1核移向中央，形成具有2極核(圖2：i)的中央細胞。合點端的3個細胞為反足細胞。珠孔端的3個細胞共同構(gòu)成卵器，即1個卵細胞和2個助細胞?？拷醒爰毎氖锹鸭毎?，助細胞則位于兩側(cè)并靠近珠孔端。

2.2.3 子房的結(jié)構(gòu)

珙桐的子房一般是6～10室，是多心皮復雌蕊，心皮在中央出聯(lián)合形成中軸，胚珠著生于中軸上，為中軸胎座(圖2：a)。每室1胚珠，單珠被，厚珠心，直立胚珠。雌蕊分化早期，在心皮腹縫線處子房內(nèi)表皮下有細胞分裂增生，產(chǎn)生一些分裂旺盛的細胞，即胚珠原基，這些細胞經(jīng)分裂逐漸增大，形成一團狀突起，其上部即為珠心組織。珠心組織下部形成珠柄，與胎座相連。珠心基部表皮細胞分裂較快，逐漸把珠心包圍形成珠被。珠被在珠心頂端形成1個開口，稱為珠孔。

3 結(jié)論

珙桐小孢子母細胞減數(shù)分裂為同時型，小孢子在四分體中排列屬四面體型。成熟花粉為二胞花粉粒，具有3個萌發(fā)溝?；ㄋ幈诘陌l(fā)育類型是雙子葉型，絨氈層為分泌型絨氈層。

同一藥室內(nèi)小孢子母細胞的減數(shù)分裂基本同步，但是在同一花藥內(nèi)的不同藥室之間、同一花序上的不同花藥之間存在一定的差異。所以，在同一朵花開花后，4個藥室散播花粉時期出現(xiàn)先后差異，使花粉散播的總時期延長，從而使傳粉和受精的時間也有所延長。這種現(xiàn)象在自然界中是比較普遍存在的，是植物積極適應環(huán)境的一種表現(xiàn)[13]。在小孢子發(fā)生及雄配體發(fā)育過程的觀察中未發(fā)現(xiàn)敗育現(xiàn)象。珙桐子房是多心皮復雌蕊，通常6～10室，每室1胚珠。珙桐胚珠為直立胚珠，單珠被，厚珠心，胚囊為單孢子發(fā)生類型，為典型的蓼型胚囊發(fā)育方式。

張征云等[14]認為珙桐瀕危是種子敗育所導致。周志瓊[15]觀察珙桐的雌配子體發(fā)育過程發(fā)現(xiàn)，雌配子體在發(fā)育過程中存在一定比例的未發(fā)育和敗育的胚珠，敗育的胚珠約占整個胚珠的10%，認為可能是大孢子或雌配子體發(fā)育不正常導致。通過連續(xù)切片觀察，沒有發(fā)現(xiàn)大小孢子發(fā)生及雌雄配子體形成的異常，其結(jié)果與李雪萍等[16]對大小孢子及雌雄配子體的發(fā)育觀察結(jié)果一致。在野外采集珙桐不同發(fā)育時期的花序時，發(fā)現(xiàn)有子房萎縮退化，還有一些雌花不能正常發(fā)育成幼果的現(xiàn)象及幼果過早脫落的現(xiàn)象，因此認為珙桐的瀕危和其自身的生殖過程中的某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常現(xiàn)象有關，這直接導致了珙桐不同程度的生殖失敗，進而引起了自身瀕危的現(xiàn)象。

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The Megasporogenesis and Microsporogensis and Development of Female and Male Gametophyte of Endangered plantsDavidiainvolucrate

CHENXing-Yin,ZHANGYu-jing,ZHANGKai-Kai,YANGPeng,SHIJian-ming*

(CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Anatomical structure of the floral organ ofDavidiainvolucrateat different developmental stage was studied by paraffin section method. The results showed that the anther wall could be defined as basis development type, which belonged to dicotyledonous type. The meiosis of microsporocyte was the simultaneous type at cytokinesis, while tetrahedral type at the tetrad stage. The mature pollen belonged to 2-cell type with three germination ditch. The ovule of D. involucrate was atropous ovule, with crassinucellus and unitegmic. Embryo sac was single spore type, which was a typical polygonum type embryo-sac development pattern. No abnormal development was found in the megasporogenesis, microsporogensis and female and male gametophyte by serial sections observation.

Davidiainvolucrate, Megaspore, Microspore, Female Gametophyte, Male Gametophyte

2016-09-05；

2016-09-26

貴州省自然科學基金(黔科合J字[2014]2124)。

Q944.5

A

1008-0457(2016)06-0035-05 國際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.06.006

*通訊作者：石建明(1962-)，男，副教授，主要研究方向：植物學；E-mail:guanp508@163.com。