楊志強(qiáng)，溫媛媛，李春生

SIAH1在乳腺癌中上調(diào)Bim的表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡研究

楊志強(qiáng)，溫媛媛，李春生

目的 探討SIAH1在乳腺癌中的表達(dá)及對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和免疫印跡試驗(yàn)法檢測(cè)30例乳腺組織與乳腺癌細(xì)胞中 SIAH1的表達(dá)情況。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將 SIAH1表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-myc-SIAH1、對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3-myc、SIAH1干擾片段SIAH1siRNA1、對(duì)照片段controlsiRNA1、BimsiRNA1及對(duì)照片段controlsiRNA2轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231后，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR和免疫印跡試驗(yàn)法檢測(cè)SIAH1基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況及對(duì)Bim表達(dá)的影響，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)分析檢測(cè)SIAH1 對(duì) MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 SIAH1在乳腺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)。與乳腺癌細(xì)胞系 MDAMB-231轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1后，Bim表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡率增加；干擾SIAH1表達(dá)后，Bim表達(dá)下調(diào)。與乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1相比，共轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1 和BimsiRNA1后，凋亡率明顯減少。結(jié)論 過(guò)表達(dá)SIAH1可通過(guò)上調(diào)Bim表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

乳腺癌；SIAH1；Bim；細(xì)胞凋亡

[Modern Piactical Medicine, 2016,28(6) :713-715,730]

人類(lèi)有兩個(gè)高度保守同源的 SINA，SIAH1和SIAH2，兩者有77%的同一性，但SIAH1和SIAH2蛋白在N端有顯著差別。SIAH1表達(dá)在許多正常和腫瘤組織中，發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤的作用[1]。SIAH1基因在人類(lèi)肝細(xì)胞癌中首先被認(rèn)為是腫瘤抑制因子[2-3]。研究表明，一些 E3泛素化連接酶如CHFR、SIAH1，與CHIP可調(diào)節(jié)乳腺癌的發(fā)生[4]。另外還有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染 SIAH1表達(dá)質(zhì)粒后可通過(guò)改變細(xì)胞的有絲分裂來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。Bim屬于Bcl-2家族成員之一，是重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，在許多腫瘤的發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用。DNA損傷、血清饑餓及紫杉醇等刺激可影響B(tài)im的表達(dá)來(lái)引起細(xì)胞的凋亡[6]。Bim可誘導(dǎo)造血細(xì)胞，上皮細(xì)胞和神經(jīng)元等細(xì)胞的凋亡[7-8]。

近來(lái)有研究表明，SIAH1可激活JNK信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[9]。另外，一些研究發(fā)現(xiàn)JNK通路可通過(guò)調(diào)控Bim來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[10]。筆者推測(cè)SIAH1調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的凋亡可能是通過(guò)影響B(tài)im的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDAMB-435S與 MCF-7，以及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A。3種細(xì)胞均為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞系。細(xì)胞接種在含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及方法 DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，山羊抗人SIAH1及購(gòu)于SantaCruz公司，兔抗人Bim購(gòu)于cellsignal公司，抗 -actin購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Lipofect2000購(gòu)于Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。PCR引物合成與測(cè)序委托大連Takara公司進(jìn)行。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和免疫印跡試驗(yàn)（Westernblot）法檢測(cè)30例乳腺組織與乳腺癌細(xì)胞中SIAH1的表達(dá)情況。

1.3 siRNA干擾和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，選取人SIAH1 mRNA和Bim mRNA中的特異性核苷酸片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用Ambion公司在線(xiàn)siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)SIAH1和Bim的RNAi序列，經(jīng)Blast確定所選靶向的基因是特異的，序列由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。實(shí)驗(yàn)分3組：空白對(duì)照組、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組和特異性siRNA轉(zhuǎn)染組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，轉(zhuǎn)染具體步驟按Lipofect 2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。SIAH1siRNA序列：1：5’-AACTCCTGCCTCCTTATGTATTT-3’，2：5’-GAUAGGAACACGCAAGCAA-3’，3：5’-GUUGCAUGUAGUAACACUA-3’。非特異性siRNA1（control siRNA 1）序列：5’-AAGAGCCGTCAGACTGCTACA-3’。Bim siRNA序列：1：5’-ACCGAGAAGGUAGACAAUU-3’，2：5’-CUACCUCCCUACAGACAGA-3’，3：5’-CUACCUCCCUACAGACAG A-3’。非特異性siRNA2（controlsiRNA2）序列：5’-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3’。鑒于轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性，筆者選擇SIAH1siRNA1和BimsiRNA1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。SIAH1表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-myc-SIAH1和對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3-myc由Matsuzawa Shu-ichi（Burnham Institute，LaJolla，California，USA）教授惠贈(zèng)。具體轉(zhuǎn)染步驟按脂質(zhì)體LipofectamineTM試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞作為對(duì)照。

1.4 Western blot4℃下取1～2g標(biāo)本，加約5倍濕重的裂解緩沖液，粉碎勻漿后，4℃靜置24 h，低溫高速離心(4℃，12 000 r/min，40 min)，提取上清即為總蛋白。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)印，5%正常小牛血清封閉，抗SIAH1(1︰400)和抗 -actin(1︰500)4℃下孵育，過(guò)夜；于二抗室溫下孵育2h。ECL顯色，X線(xiàn)膠片曝光成像，經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集圖像。每組結(jié)果均為相同條件下重復(fù)3次。

1.5 RT-PCR 采用 TrizolTM 試劑提取細(xì)胞的總RNA，利用RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR引物為：SIAH1：上游：5’-TCCAACAATGACTTGGC GAGT-3’，下游：5’-CTTTTTCTGTGTGTGGCAGAG-3’；Bim：上游：5’-CTGCAGATATGCGCCCAGAGAT-3’，下游：5'-CACCAGGCGGACAATGTAACG-3’；-actin：上游：5’-AAATCGTGCGTGACATTAA-3’，下游：5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為253bp （SIAH1），167bp（Bim）與513bp（-actin）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，成像分析。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×104/ml的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液同步化24h。72h后用0.25%胰蛋白酶消化、離心，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗2次，1000r/min離心8min，棄上清，加PBS600l輕輕吹勻細(xì)胞，加RNA酶（終濃度50g/ml）處理30min，37℃。然后加入PI處理15 min，4℃。用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。sub-G1期細(xì)胞代表凋亡[11]。

2 結(jié)果

2.1 SIAH1的表達(dá) 在30對(duì)樣本中，27例乳腺癌組織中SIAH1蛋白表達(dá)低于配對(duì)的癌旁組織；26例乳腺癌組織中SIAH1mRNA表達(dá)低于配對(duì)的癌旁組織（封二彩圖4A）。SIAH1蛋白和mRNA在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7與MDA-MB-435S中表達(dá)低于乳腺正常上皮細(xì)胞系MCF-10A（封二彩圖4B）。

2.2 乳腺癌細(xì)胞中SIAH1與Bim表達(dá)的關(guān)系 對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pcDNA3-myc-SIAH1后發(fā)現(xiàn)，SIAH1與Bim表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)，轉(zhuǎn)染SIAH1siR-NA后觀(guān)察到SIAH1與Bim表達(dá)明顯下調(diào)（封二彩圖5A）。與細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1相比，細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1與BimsiRNA1后Bim表達(dá)下降。與轉(zhuǎn)染BimsiRNA1相比，細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1與Bim siRNA 1后Bim表達(dá)上調(diào)（封二彩圖5B）。

2.3 乳腺癌細(xì)胞凋亡情況 與轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3 （1.11±0.21）%、control siRNA 1（1.14±0.27）%或未轉(zhuǎn)染細(xì)胞（untreated）（1.02±0.26）%相比，MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1（18.06±3.35）%后細(xì)胞凋亡率明顯增加。MDA-MB-231細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1 和BimsiRNA1（0.96±0.18）%后，凋亡率與轉(zhuǎn)染controlsiRNA2（1.04±0.19）%、BimsiRNA1（1.12±0.23）%或未轉(zhuǎn)染細(xì)胞（untreated）（1.02±0.26）%差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1（18.06±3.35）%相比顯著降低（封三彩圖1）。

3 討論

SIAH1基因位于染色體帶16q12-q13，這個(gè)區(qū)域在各種腫瘤中經(jīng)常缺失[11]，這表明SIAH1可能是一種腫瘤抑制因子。Hiroshi等觀(guān)察到在Huh7、HepG2細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)SIAH1可能通過(guò)降解癌蛋白BAG-1，-catenin與PEG10來(lái)發(fā)揮它的腫瘤抑制作用。在肝癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染外源性的SIAH1于HCC細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，表明SIAH1在抑制肝癌的形成中起重要作用[6]，在乳腺癌中SIAH1對(duì)其細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究尚未報(bào)道。

本研究中，筆者采用Westernblot和RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SIAH1蛋白和mRNA在乳腺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，這與筆者已報(bào)道的免疫組化結(jié)果相一致，即 SIAH1蛋白在乳腺正常組織表達(dá)高于乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。這些結(jié)果均提示 SIAH1表達(dá)減少或缺失在乳腺癌的癌變過(guò)程中起重要作用，這一結(jié)果在肝癌細(xì)胞中也得到了證實(shí)[12]。

為了進(jìn)一步探討SIAH1對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和明確SIAH1與Bim的相互關(guān)系，筆者轉(zhuǎn)染了SIAH1表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SIAH1可上調(diào)Bim的表達(dá)。另外筆者干擾SIAH1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)與之相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這與Roperch等[13]報(bào)道的結(jié)果一致。

SIAH1表達(dá)增加是通過(guò)什么具體機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡？一些研究表明，p53可使SIAH1轉(zhuǎn)錄增加，同時(shí)SIAH1在p53調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[13]。另外，SIAH1可通過(guò)降解一些癌蛋白BAG1來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。有報(bào)道稱(chēng)，SIAH1可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂過(guò)程來(lái)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。然而，最近有研究發(fā)現(xiàn)，SIAH1可通過(guò)激活JNK信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。許多研究表明JNK信號(hào)通路可調(diào)節(jié)Bim的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-16]，所以，筆者推測(cè)，Bim 在SIAH1調(diào)節(jié)的乳腺癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮一定作用。

為了進(jìn)一步明確Bim在SIAH1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡中的作用，筆者共轉(zhuǎn)染了SIAH1表達(dá)質(zhì)粒和Bim小干擾片段，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SIAH1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡被Bim siRNA抑制了，這一發(fā)現(xiàn)更加驗(yàn)證了過(guò)表達(dá)SIAH1導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是通過(guò)調(diào)節(jié)Bim的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，SIAH1在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，SIAH1通過(guò)調(diào)節(jié)Bim的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示，SIAH1表達(dá)減少或缺失在乳腺癌的癌變過(guò)程中起重要作用，且可能依賴(lài)Bim來(lái)發(fā)揮作用。

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SIAH1 induces apoptosis of breast cancer cells by up-regulating the level of Bim

YANG Zhiqiang, WEN Yuanyuan, LI Chunsheng (Wenzhou Meoical University, Wenzhou City 325035, Zhgiang Forvince, China)

Objective To investigate the expression of SIAH1 in breast carcinoma and its effect on the induction of breast carcinoma apoptosis. Methods The expression of SIAH1 mRNA and protein were examined in breast cancer tissues and cell lines by RT-PCR and western blot. MDA-MB-231 cells were transfected with pcDNA3-myc-SIAH1, pcDNA3-myc, SIAH1 siRNA1, control siRNA1, Bim siRNA1 or control siRNA2 by using Lipofectamine 2000. The expression of SIAH1 and Bim were detected by RT-PCR and Western blot. SIAH1-inducing apoptosis of breast carcinoma was detected by Flow cytometry assay. Results SIAH1 mRNA and protein expression were significantly lower in breast cancer tissues and cell lines. Compared with the control and the cells transfected with the pcDNA3-myc, the level of SIAH1 and Bim were increased in the cells transfected with the pcDNA3-myc-SIAH1. And the apoptosis percentage was also increased. On the contrary, the level of SIAH1 and Bim were decreased in the cells transfected with the SIAH1 siRNA1. Conclusions Overexpression of SIAH1 can induce apoptosis of breast carcinoma by up-regulating the level of Bim.

Breast carcinoma; SIAH1; Bim; Apoptosis

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.06.006

R737.9

A

1671-0800(2016)06-0713-04

2015-12-10

（本文編輯：鐘美春）

國(guó)家自然科學(xué)基金（青年科學(xué)基金項(xiàng)目）（81201853）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y2110620、Y2111209）

316000浙江省舟山，舟山醫(yī)院（楊志強(qiáng)、李春生）；溫州醫(yī)科大學(xué)（溫媛媛）

溫媛媛，Email:wenyuanyuan1022@sina.cn