李俊峰 張學(xué)斌 紀(jì)志剛

·綜述·

microRNA在尿路上皮癌中的應(yīng)用研究進(jìn)展

李俊峰 張學(xué)斌 紀(jì)志剛

尿路上皮癌(urothelial cell carcinoma，UCC)具有多中心、多發(fā)、復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，可以發(fā)生在被覆尿路上皮的腎集合管、腎盂腎盞、輸尿管、膀胱及尿道。根據(jù)腫瘤部位的不同，UCC可分為上尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma，UTUC)和下尿路上皮癌,前者主要包括腎盂癌和輸尿管癌，后者包括膀胱尿路上皮癌(urothelial carcinoma of bladder，UCB)和尿道癌。UCC的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，近年來的研究表明microRNA(miRNA)與尿路上皮腫瘤有關(guān)。

miRNAs是一類不編碼蛋白質(zhì)的小RNA。1993年，Ambros和Ruvkun的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA(lin-4)[1-2]，其后miRNAs逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究表明miRNAs與心血管疾病[3]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[4-6]、自身免疫相關(guān)疾病[7-8]等諸多系統(tǒng)的疾病有關(guān)。近年的研究發(fā)現(xiàn)多種miRNAs在UCC的診斷、復(fù)發(fā)評(píng)估甚至治療方面有較大應(yīng)用價(jià)值。本文綜述如下。

一、miRNAs概述

miRNAs是一組19～24核苷酸長(zhǎng)度的非蛋白質(zhì)編碼的RNA，主要通過控制靶向mRNA來調(diào)控基因表達(dá)。其生物合成過程如下[9]：首先，在細(xì)胞核內(nèi)，DNA在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下合成pri-miRNA；pri-miRNA在Dorsha酶作用下生成具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的pre-miRNA；隨后pre-miRNA通過核孔運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，在Dicer酶作用下生成成熟的核苷酸長(zhǎng)度為19～24的miRNA雙鏈結(jié)構(gòu)，其中一條鏈與RNA 誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合并參與靶向mRNA的調(diào)控，另外一條鏈被降解或者排除細(xì)胞外。細(xì)胞主要通過以下幾種方式排出miRNAs[10]：①外泌體形式；②RNA結(jié)合蛋白形式；③細(xì)胞胞吐形式。在細(xì)胞外，miRNAs具有很好的抗RNA酶降解能力，只有少部分裸露的miRNAs被RNA酶分解，大部分與RISC結(jié)合、存在于微泡以及被修飾(甲基化、腺苷化、尿苷化)的miRNAs 均很少被降解。此外，即使是在極端溫度和pH環(huán)境、10個(gè)冰凍再解凍過程[11]或者含量較低時(shí)，miRNAs也具有很好的可檢測(cè)性，因此可能成為UCC的生物標(biāo)志物。

二、miRNAs與UCC的關(guān)系

1.miRNAs與UTUC：由于UTUC發(fā)病率相對(duì)較低，相關(guān)的miRNAs研究較少。Kriebel等[12]研究表明miRNAs可用于區(qū)分正常組織和UTUC腫瘤組織，miRNA-21, miRNA-96,miRNA-135,miRNA-141,miRNA-182, miRNA-205, miRNA-429 和miRNA-520b在UTUC腫瘤組織中高表達(dá)，其中miRNA-205在分化程度低的UTUC中表達(dá)更高。他們首次發(fā)現(xiàn)miRNAs與UTUC的診斷相關(guān)性，miRNA-141作為UTUC診斷標(biāo)志物的接收者受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析,其曲線下面積(area under curve，AUC)值為0.726。Tao等[13]發(fā)現(xiàn)10種可用于UTUC診斷的miRNAs(miRNA-664a-3p, miRNA-431-5p, miRNA-423-5p, miRNA-191-5p, miRN·A-33b-3p, miRNA-26a-5p, miRNA-22-3p, miRNA-16-5p,let-7b-5p和let-7c)，ROC曲線分析，其AUC值大于0.8。臨床病理診斷上，由于腎盂癌與腎細(xì)胞癌可以相互侵犯相鄰組織的特點(diǎn)，有時(shí)病理上難以鑒別腫瘤的來源。Zaravinos等[14]利用組織標(biāo)本首次證實(shí)miRNAs表達(dá)可用于區(qū)分UTUC和正常腎組織，發(fā)現(xiàn)16 種在UTUC低表達(dá)以及5種高表達(dá)的miRNAs，其中miRNA-3648, miRNA-638, miRNA-3656和miRNA-3687被認(rèn)為是最好的區(qū)分UTUC與腎細(xì)胞癌的標(biāo)志物。Izquierdo等[15]對(duì)150例UTUC進(jìn)行了多中心回顧性研究，首次對(duì)比非進(jìn)展UTUC與進(jìn)展UTUC組織中miRNAs的表達(dá)差異，結(jié)果表明兩組miRNAs表達(dá)存在差異，同時(shí)表達(dá)miRNA-31和miRNA-149的亞組具有較高腫瘤進(jìn)展，且表達(dá)miRNA-149的亞組具有更短的生存時(shí)間。上述研究表明miRNAs與UTUC的診斷及預(yù)后相關(guān)，有用于UTUC的輔助診斷、鑒別診斷以及預(yù)后判斷的潛在可能，但尚需大樣本量的前瞻性研究證實(shí)。

2.miRNAs與UCB：①miRNAs與UCB的診斷：目前，UCB的診斷主要依據(jù)泌尿系影像學(xué)、尿細(xì)胞學(xué)或者膀胱鏡下病理活檢。其中，尿細(xì)胞學(xué)檢查特異度高達(dá)98%，但敏感度差，總體敏感度為34%，對(duì)不同分級(jí)腫瘤的敏感度分別為1級(jí)12%、2級(jí)26%、3級(jí)64%[16]。膀胱鏡仍是診斷和術(shù)后隨訪的主要手段，但有創(chuàng)性為其弊端。因此，尋求一種簡(jiǎn)單、無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、可行性高的生物標(biāo)志物成為近年來研究的熱點(diǎn)。Wszolek等[17]利用組織中miRNA-200c, miRNA-141和 miRNA-30b診斷浸潤(rùn)型UCB，敏感度為 100%，特異度為 96.2%。Long等[18]研究顯示尿液沉渣中miRNA-26a,miRNA-93, miRNA-191和miRNA-940的診斷敏感度及特異度分別為 88% 和78%，診斷TaG1、T1G3、≥T2UCB的敏感度分別為80%、95%、90%。為避免尿液沉渣中其他成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，Zhang等[19]以尿液離心后上清液中miRNA-99a 和miRNA-125b的表達(dá)作為診斷模型，其敏感度、特異度分別為86.7%、81.1%，陽性預(yù)測(cè)值(PPV)為91.8%；應(yīng)用miRNA-125b區(qū)別低級(jí)別和高級(jí)別UCB，其敏感度、特異度分別為81.4%、87.0%，PPV為93.4%。以上研究表明不同樣本中的多個(gè)miRNAs組合，均具有理想的UCB篩查診斷意義，miRNAs不僅可以用于診斷UCB，并且在不同分級(jí)的UCB中診斷的敏感度和特異度不同，可能用于UCB的早期篩查診斷。相比傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)及膀胱鏡檢查，miRNAs可能有更高的診斷準(zhǔn)確性。Snowdon等[20]通過檢測(cè)8例患者尿液中的miRNA-125b 和miRNA-126以診斷UCB，其敏感度為100%，特異度為80%，明顯高于細(xì)胞學(xué)檢查的敏感度和特異度(50%和80%)，表明與細(xì)胞學(xué)檢查相比，這2種miRNAs可以提高UCB的診斷準(zhǔn)確率。Sapre等[21]利用尿液中6種miRNAs(miRNA-16, miRNA-200c, miRNA-205, miRNA-21,miRNA-221和miRNA-34a)聯(lián)合診斷UCB，驗(yàn)證組ROC曲線分析，其AUC、敏感度和特異度分別為0.74、88%和48%；T1期腫瘤和大體積腫瘤ROC曲線分析，其AUC分別為0.92和0.81；驗(yàn)證組膀胱鏡的使用率下降約30%。表明這組miRNAs可以用于UCB復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)，若聯(lián)合膀胱鏡檢，可能降低漏診率、死亡率以及費(fèi)用。此外，由于手術(shù)前后miRNAs表達(dá)水平存在差異，檢測(cè)術(shù)后1種或多種miRNAs的表達(dá)水平，可用于評(píng)估術(shù)后腫瘤治療效果及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)。Yamada等[22]對(duì)比手術(shù)前后尿液中miRNAs 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)術(shù)后miRNA-96和miRNA-183的表達(dá)較術(shù)前均明顯下降(miRNA-96：695±304 vs 1 411±474，P=0.024 1；miRNA-183：1 522±754 vs 7 462±3 162，P=0.004 5)；但miRNA-183在炎癥狀態(tài)下同樣升高，術(shù)后機(jī)體炎癥反應(yīng)下降時(shí)其表達(dá)也會(huì)下調(diào)，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。所以miRNA-96適合于腫瘤檢測(cè)，miRNA-183更適合于腫瘤分級(jí)；若細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合miRNA-96檢測(cè)，細(xì)胞學(xué)檢查的敏感度可從43.6%升至78.2%。②miRNAs與UCB分期、分級(jí)：膀胱癌的分期、分級(jí)與膀胱癌的復(fù)發(fā)和侵襲行為密切相關(guān)，是判斷膀胱腫瘤預(yù)后最有價(jià)值的指標(biāo)之一。近期研究表明miRNAs在不同分期、分級(jí)的膀胱癌中表達(dá)存在差異，說明miRNAs有可能用于輔助臨床膀胱癌的分期、分級(jí)。Dip等[23]對(duì)miRNAs與UCB腫瘤分期之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，研究對(duì)象包括pTa、pT2～3UCB患者各30例，發(fā)現(xiàn)miRNA-100在pTaUCB中100%低表達(dá)，而miRNA-205在pT2～3的表達(dá)水平較pTa明顯增高(6.91 vs 0.07，P<0.001)。Wei等[24]對(duì)比分析了7種miRNAs在正常人、高級(jí)別和低級(jí)別膀胱癌中的表達(dá)差異，僅發(fā)現(xiàn)miRNA-182在高級(jí)別UCB中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，ROC曲線分析，其AUC為0.782，可能作為高級(jí)別UCB的檢測(cè)指標(biāo)。Pignot 等[25]研究發(fā)現(xiàn)15種 miRNAs 在膀胱癌組織中異常表達(dá)，其中miRNA-146b 和miRNA-9在肌層浸潤(rùn)組表達(dá)顯著升高，并發(fā)現(xiàn) miRNA-9，miRNA-182 和 miRNA-200b 與浸潤(rùn)性膀胱癌的浸潤(rùn)性有關(guān)。Xie等[26]對(duì)28例浸潤(rùn)性膀胱癌樣本及11 例非浸潤(rùn)性膀胱癌樣本進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)組有7 種異常表達(dá)的miRNAs: miRNA-29c，miRNA-200a，miRNA-378，miRNA-429，miRNA-200c 和miRNA-141表達(dá)升高，miRNA-451表達(dá)下降，這些miRNAs可能與腫瘤的浸潤(rùn)性有關(guān)。劉國(guó)元等[27]納入24例新鮮膀胱組織(12例非浸潤(rùn)性和12例浸潤(rùn)性膀胱癌)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比，非浸潤(rùn)性和浸潤(rùn)性膀胱癌組織中 miRNA-720相對(duì)表達(dá)水平上升了11.8、 10.0倍；miRNA-191上升了7.3、4.5倍。非浸潤(rùn)性和浸潤(rùn)性膀胱癌組織相比，miRNA-720的表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.5)， 而 miRNA-191的表達(dá)水平浸潤(rùn)性膀胱癌組織較非浸潤(rùn)性膀胱癌組織下降(P<0.5)。雖然較多miRNAs 被發(fā)現(xiàn)可能與腫瘤的分級(jí)、分期有關(guān)，但仍需大樣本的前瞻性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以探索是否可能用于預(yù)測(cè)肌層浸潤(rùn)進(jìn)展及預(yù)后。③miRNAs 與UCB預(yù)后：目前臨床和病理分期、分級(jí)被廣泛應(yīng)用，但由于其主觀性較強(qiáng)，導(dǎo)致存在診斷上的差異現(xiàn)象，例如大約50%診斷為高級(jí)別UCB的患者3年間并無腫瘤進(jìn)展[28]，并且病理難以估計(jì)病情進(jìn)展，治療決策往往受到影響，因此，對(duì)膀胱癌患者疾病進(jìn)展的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)具有重要意義。Rosenberg等[29]研究表明組織中miRNA-29*c低表達(dá)在不同分組中均預(yù)后較差，非浸潤(rùn)型UCB中位生存時(shí)間為35個(gè)月，T1UCB生存中位數(shù)為61個(gè)月，T1高級(jí)別UCB中位生存時(shí)間為38個(gè)月，均比同組對(duì)照預(yù)后差。Zhang等[30]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-101與膀胱癌預(yù)后相關(guān)，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示腫瘤組織miRNA-101低表達(dá)者生存更差(P=0.004)，多因素回歸模型提示miRNA-101低表達(dá)可作為預(yù)后因素(P=0.028,HR0.451, 95%CI：0.237～0.735)。Andrew等[31]研究表明miRNA-34a在UCB中顯著下降2～3倍，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示miRNA-34a 低表達(dá)者首次出現(xiàn)復(fù)發(fā)的中位時(shí)間為1.15年，高表達(dá)者則為2.84年(P=0.04)，作者認(rèn)為miRNA-34a可作為UCB的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。Pignot等[32]發(fā)現(xiàn)6種在UCB降低的miRNAs以及3種升高的miRNAs，其中miRNA-100和 miRNA-361低表達(dá)者具有更長(zhǎng)的生存時(shí)間(P=0.032和0.044)；高表達(dá)miRNA-92A, miRNA-19A和miRNA-20A者預(yù)后更差，5年生存率分別為30.0%、37.5%和 33.3%，而低表達(dá)者的5年生存率分別為75.0%、60.0% 和 66.7%。因此，單種或聯(lián)合多種miRNAs檢測(cè)可能作為判斷UCB預(yù)后的指標(biāo)。

三、UCC研究中miRNAs與相應(yīng)基因靶點(diǎn)

在研究miRNAs在UCC診斷、預(yù)后、復(fù)發(fā)評(píng)估方面價(jià)值的同時(shí)，miRNAs與特定基因靶點(diǎn)的結(jié)合及其機(jī)制也是重要的研究?jī)?nèi)容。

首先，通過對(duì)比腫瘤組織以及周圍正常組織中基因表達(dá)水平的差異可以幫助發(fā)現(xiàn)更多的miRNAs相應(yīng)靶點(diǎn)。Xu等[33]通過對(duì)比28例腫瘤樣本和相應(yīng)周圍正常組織中BCL-2以及MCL-1基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中BCL-2以及MCL-1處于高表達(dá)狀態(tài)，而miRNA-29c表達(dá)下降。BIU-87細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確證實(shí)，miRNA-29c可以通過下調(diào)BCL-2以及MCL-1的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，起到減少細(xì)胞數(shù)量的作用。Andrew等[31]發(fā)現(xiàn)了一種新的序列預(yù)測(cè)型miRNA-34a靶向基因—S100P。通過組織中S100P基因的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平與miRNA-34a相反，標(biāo)準(zhǔn)化的S100P在腫瘤組織中的表達(dá)是正常組織的4.6倍，而標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA-34a在原發(fā)以及復(fù)發(fā)腫瘤組織中的表達(dá)僅僅是正常組織的1/3。此外，孫文等[34]選取48對(duì)膀胱癌根治術(shù)后癌組織及癌旁組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中miRNA-34a呈低表達(dá)，并且與腫瘤分期有關(guān)(P<0.01)；MAT2在癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)。同時(shí)應(yīng)用MiRanda、Mirwalk、Targetscan軟件預(yù)測(cè)到miRNA-34a與MAT2的mRNA有結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MAT2可能是MiR-34a的潛在靶向基因。

細(xì)胞水平的探索性研究可以很好地發(fā)現(xiàn)miRNAs與基因表達(dá)水平對(duì)膀胱癌細(xì)胞株增殖及侵襲力的影響，進(jìn)而推測(cè)其與臨床疾病進(jìn)展的關(guān)系。Zhang等[35]實(shí)驗(yàn)表明miRNA-30a通過抑制T24以及5637膀胱癌細(xì)胞株Notch 1基因的3’-非翻譯報(bào)告區(qū)的活性，從而限制細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移力和侵襲力。Xie等[26]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過pre-miRNA-9轉(zhuǎn)染的T24膀胱癌細(xì)胞株，其表達(dá)CBX7水平降低，細(xì)胞的侵襲力增加，證實(shí)CBX7基因可能是miRNA-9的直接靶向基因。 Morais等[36]觀察到經(jīng)過miRNA-100轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞其SMARCA5和mTOR基因的表達(dá)明顯降低。其中SMARCA5主要參與DNA的修復(fù)，降低其表達(dá)會(huì)促進(jìn)染色體的不穩(wěn)定性，使腫瘤易發(fā)展為高級(jí)別UCC；mTOR基因主要參與PI3K/AKt/mTOR通路，降低mTOR的表達(dá)是很多腫瘤的發(fā)生因素。

基因敲除及免疫組化技術(shù)在UCB中的應(yīng)用增加，可以更好地在分子水平直接證實(shí)miRNAs的特定靶向基因。Jia等[37]探究miRNA-126與ADAM9的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，miRNA-126表達(dá)水平升高可以降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，ADAM9在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中表達(dá)升高，敲除ADAM9基因后，細(xì)胞的侵襲力下降，實(shí)驗(yàn)性地上調(diào)ADAM9表達(dá)時(shí)，細(xì)胞可再次獲取侵襲力，說明ADAM9有可能作為預(yù)后的一個(gè)參考指標(biāo)。Fischer等[38]進(jìn)行了294例移行細(xì)胞腫瘤組織的PDCD4免疫組化染色分析，發(fā)現(xiàn)組織病理級(jí)別越高，胞質(zhì)及胞核PDCD4染色越差，而miRNA-21表達(dá)水平相應(yīng)升高，兩者呈反向關(guān)系。

四、總結(jié)和展望

隨著對(duì)miRNAs在膀胱癌診斷、病理分期分級(jí)、治療及預(yù)后監(jiān)督等方面的作用有了初步的認(rèn)識(shí)，越來越多的研究機(jī)構(gòu)及臨床泌尿外科醫(yī)師開始重視探討及發(fā)掘miRNAs在UCC中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本文通過總結(jié)近期發(fā)表的與UCC有關(guān)的miRNAs的研究結(jié)果得出以下結(jié)論：?jiǎn)我换蛘呗?lián)合多種miRNAs與UTUC診斷、預(yù)后相關(guān)，可作為UTUC輔助診斷、鑒別診斷、預(yù)后判定的一項(xiàng)指標(biāo)；miRNAs與尿道癌的關(guān)系，尚未有論文發(fā)表；UCB患者的不同來源樣本(血、尿、組織)中聯(lián)合多種miRNAs，均具有理想的篩查診斷意義，其靈敏度及特異度均達(dá)80%以上，且在不同分級(jí)的UCB中診斷的靈敏度和特異度不同，可據(jù)此原理探索一種新的用于篩查早期UCB的腫瘤標(biāo)志物；此外，miRNAs還可用于檢測(cè)術(shù)后腫瘤治療效果及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè),如果聯(lián)合膀胱鏡檢，可能降低漏診率、死亡率以及費(fèi)用。但是，目前研究中仍存在諸多待解決的問題：①樣本量小，前瞻性實(shí)驗(yàn)少；②實(shí)驗(yàn)樣本來源冗雜，并未探討同一患者不同組織來源的miRNAs表達(dá)是否一致，以對(duì)比發(fā)現(xiàn)表達(dá)率較高的組織來源，用于早期篩查；③miRNAs測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一；④在對(duì)比腫瘤組織與腫瘤旁正常組織的miRNAs表達(dá)差異時(shí)，未考慮“范圍效應(yīng)”問題。“范圍效應(yīng)”是指所謂的腫瘤旁正常組織實(shí)際上已經(jīng)存在腫瘤變異，只是因?yàn)槟壳暗脑\斷手段難以明確腫瘤變異極早期的改變，從而在分析miRNAs表達(dá)差異時(shí)得到不精確的結(jié)果。所以，若要更好地將miRNAs 應(yīng)用于UCC的早期篩查及診斷、基因靶向治療和預(yù)后評(píng)估，需行大量研究，包括：①大樣本、多中心、前瞻性研究；②進(jìn)行同一患者不同組織來源的miRNAs表達(dá)差異分析，探索新的腫瘤標(biāo)志物；③研究一種新型的簡(jiǎn)單易操作、經(jīng)濟(jì)適用的miRNAs檢測(cè)手段，使miRNAs檢測(cè)方法規(guī)范統(tǒng)一化；④對(duì)患者進(jìn)行全程的病程隨訪，復(fù)診時(shí)重新檢測(cè)miRNAs的表達(dá)情況，排除“范圍效應(yīng)”以及檢測(cè)方法的誤差。

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(本文編輯：徐漢玲)

100000 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科

紀(jì)志剛，E-mail:Jzg1129@medmail.com.cn

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.06.016

2016-09-29)