鄭 慧 陳希平 尤禎丹 夏冬雪 胡 熙

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208)

蜂花粉可溶性膳食纖維酶法提取工藝優(yōu)化及其理化分析

鄭 慧 陳希平 尤禎丹 夏冬雪 胡 熙

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208)

采用纖維素酶法提取蜂花粉可溶性膳食纖維，分析其理化特性，并與酸提、堿提產(chǎn)品進行對比。結(jié)果表明，酶法提取蜂花粉可溶性膳食纖維最優(yōu)工藝條件為：酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h，酶用量2.5%，pH 4。在該條件下，可溶性膳食纖維得率為4.11%，產(chǎn)品呈乳白色、粉體，荷花蜂花粉特有氣味濃郁，膨脹力2.03 mL/g、持水力1.01 g/g、水溶性91.26%，含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖7種單糖組分，具有多糖特征吸收峰。與堿提、酸提工藝相比, 酶提產(chǎn)品具有較好水溶性和感官品質(zhì)，更易于應(yīng)用在飲料類食品的開發(fā)中。

蜂花粉；可溶性膳食纖維；酶法提??；單糖組分；紅外光譜

蜜蜂花粉，簡稱蜂花粉，是蜜蜂從顯花植物花藥內(nèi)采集的花粉粒，向其內(nèi)加入了花蜜與唾液，混合而成的一種不規(guī)則扁圓形團狀物[1]。蜂花粉營養(yǎng)豐富[2-3]，具有多種保健功能[4-6]，被譽為“微型營養(yǎng)庫”。但由于蜂花粉含砂含雜、口感獨特，且細胞壁質(zhì)地堅硬、生物利用率差，目前大部分蜂花粉被直接作為蜂糧用于飼養(yǎng)蜜蜂，深加工產(chǎn)品較少。中國作為世界第一養(yǎng)蜂大國，其資源優(yōu)勢遠未體現(xiàn)[7]。近年來蜂花粉研究主要集中在細胞壁的破壁工藝[8-9]，以及其生物類黃酮、多糖的提取和研究上[4,10-11]，對于纖維類成分僅在營養(yǎng)組分測定中有所提及，并未有系統(tǒng)深入地研究。

可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)是指不被人體消化道酶消化，能溶于溫?zé)崴?，和水結(jié)合形成凝膠物質(zhì)，且其水溶液能被4倍體積的乙醇再沉淀的那部分物質(zhì)。其主要通過在大腸中發(fā)揮代謝作用達到降低膽固醇、防治高血壓及心血管疾病等多種功效[12-13]。同時良好的水溶性，使其能更廣泛地應(yīng)用在各類食品中，尤其是飲料類產(chǎn)品的開發(fā)中[14]。SDF常規(guī)提取方法有堿提、酸提和酶提[15]。本試驗擬采用纖維素酶法提取蜂花粉SDF，并與前期研究得到的酸提[16]、堿提[17]產(chǎn)品進行對比，比較不同提取方法對蜂花粉SDF產(chǎn)品特性的影響，旨在為蜂花粉SDF進一步的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

1.1.1 材料與試劑

荷花蜂花粉：市售；

纖維素酶、三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡啶酮(PMP)：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

單糖標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸)：色譜純，上海葉源生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，默克化工技術(shù)(上海)有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

恒溫振蕩器：ZHWY-200D型，上海智誠分析儀器制造有限公司；

電子分析天平：AV1120型，日本島津儀器有限公司；

實驗室pH計：STARTER3100/F型，奧豪斯儀器有限公司；

傅立葉變換紅外光譜儀：Nicolet iS5型，賽默飛世爾科技公司；

高效液相色譜儀(配紫外檢測器)：Agilent 1260型，美國安捷倫公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蜂花粉SDF酶提工藝 蜂花粉經(jīng)日光曬干、除雜、粉碎過30目篩，備用。將預(yù)處理后的蜂花粉按1∶15(g/mL)料液比溶于一定pH水溶液中，加入一定量的纖維素酶，攪拌均勻，置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中于一定溫度下以250 r/min振搖酶解一定時間。酶解后85 ℃水浴10 min滅酶活，3 500 r/min 離心10 min[14]取上清液，加入4倍體積預(yù)熱至60 ℃ 95%乙醇，靜置1 h，絮狀沉淀析出，3 500 r/min離心10 min取沉淀，真空干燥至恒重得到酶提蜂花粉SDF。

1.2.2 單因素試驗

(1) 酶解時間對SDF得率的影響：固定反應(yīng)條件為酶解溫度40 ℃、pH 4、酶用量1.5%，考察不同的酶解時間(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)對蜂花粉SDF得率的影響。

(2) 酶用量對SDF得率的影響：固定反應(yīng)條件為酶解溫度40 ℃、pH 4、酶解時間1.5 h，考察不同的酶用量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)對蜂花粉SDF得率的影響。

(3) 酶解溫度對SDF得率的影響：固定反應(yīng)條件為酶用量2.0%、pH 4、酶解時間1.5 h，考察不同的酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)對蜂花粉SDF得率的影響。

(4) pH對SDF得率的影響：固定反應(yīng)條件為酶用量2.0%、酶解溫度50 ℃、酶解時間1.5 h，考察不同的pH(2，3，4，5，6)對蜂花粉SDF得率的影響。

蜂花粉SDF得率按式(1)計算：

(1)

式中：

x——蜂花粉SDF得率，%；

M0——初始蜂花粉質(zhì)量，g；

M1——提取后干燥至恒重的蜂花粉SDF質(zhì)量，g。

1.2.3 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9(34)正交試驗，以蜂花粉SDF得率為考察指標(biāo)。

1.2.4 蜂花粉SDF感官品質(zhì) 從成品色澤、氣味、性狀初步比較酶提、酸提、堿提工藝制備的蜂花粉SDF感官品質(zhì)。

1.2.5 蜂花粉SDF膨脹力、持水力和水溶性的測定

(1) 膨脹力的測定：根據(jù)文獻[18]。

(2) 持水力的測定：根據(jù)文獻[19]，修改如下：準(zhǔn)確稱取0.500 g蜂花粉SDF于100 mL三角燒瓶中，加入40 mL蒸餾水，置于恒溫震蕩器中30 ℃、250 r/min震蕩2 h，4 000 r/min 離心15 min，除去上清液稱重，并按式(2)計算：

(2)

式中：

c——蜂花粉持水力，g/g；

m0——初始蜂花粉質(zhì)量，g；

m1——除去上清液后蜂花粉質(zhì)量，g。

(3) 水溶性的測定：根據(jù)文獻[17]。

1.2.6 蜂花粉SDF單糖組分測定 采用柱前衍生化HPLC法測定。

(1) 蜂花粉SDF酸水解及衍生化產(chǎn)物的制備：根據(jù)文獻[20]。

(2) 色譜條件：Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相 乙腈—0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.9)(體積比17∶83)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長250 nm；進樣量10 μL。

1.2.7 紅外光譜測定 用傅立葉變換紅外光譜儀進行測定，波數(shù)范圍400～4 000 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解時間對蜂花粉SDF得率的影響 由圖1可知，在試驗范圍內(nèi)，隨著酶解時間的增加，蜂花粉SDF得率先升高再降低后略有增加，在1.5 h時蜂花粉SDF得率最高。這可能是酶解初期隨著酶解時間增加，原料與酶接觸更加充分，酶解后形成一定聚合度、高分子質(zhì)量的蜂花粉SDF，能被95%的乙醇有效沉淀，使得蜂花粉SDF得率增加；此后，隨著酶解時間增加，這類具有一定聚合度的高分子質(zhì)量的蜂花粉SDF被過度水解，生成低聚合度的不易被95%乙醇沉淀的組分，不能被離心收集[21]，從而使蜂花粉SDF得率下降。因此選擇酶解時間為1.5 h為宜。

2.1.2 酶用量對蜂花粉SDF得率的影響 由圖2可知，在試驗范圍內(nèi)，隨著酶用量的增加，蜂花粉SDF得率逐步增加后趨于平穩(wěn)?？赡苁浅跗陔S纖維素酶用量增加，蜂花粉酶解愈加充分，得率增加；而酶用量增加至2.0%后，相對于蜂花粉質(zhì)量，酶用量逐漸趨于飽和，得率也趨于平穩(wěn)。因此從生產(chǎn)成本考慮，選擇酶用量為原料的2.0%為宜。

圖1 酶解時間對蜂花粉SDF得率的影響

圖2 酶用量對蜂花粉SDF得率的影響

2.1.3 酶解溫度對蜂花粉SDF得率的影響 由圖3可知，在試驗范圍內(nèi)，隨著酶解溫度升高蜂花粉SDF得率先升高后降低。這是因為酶解溫度過高或過低都會影響纖維素酶的活性，使得蜂花粉酶解不充分，不能被95%乙醇有效沉淀，使得蜂花粉SDF得率偏低。因此選擇酶解溫度50 ℃為宜。

2.1.4 pH對蜂花粉SDF得率的影響 由圖4可知，在試驗范圍內(nèi)，蜂花粉SDF得率先升高后降低。因為只有在酶的最適pH范圍內(nèi)，酶才具有較好的催化活性。而當(dāng)反應(yīng)條件遠離最適pH范圍，酶的活性降低，酶解不充分，從而使蜂花粉SDF得率降低。因此選擇pH 4為宜。

圖3 酶解溫度對蜂花粉SDF得率的影響

圖4 pH對蜂花粉SDF得率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

正交試驗因素水平取值見表1。

表1 正交試驗因素水平表

由表2可知，4個因素對蜂花粉SDF得率影響大小為B>A>C>D；最佳提取工藝條件為A2B3C3D2，即酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h，酶用量2.5%，pH值4。由于此組合在正交表中并未列入，按此條件進行驗證實驗，蜂花粉SDF得率為(4.11 ± 0.04)%，高于正交表中的試驗值。

表2 正交試驗結(jié)果

2.3 不同提取方式蜂花粉SDF感官品質(zhì)、膨脹力、持水力和水溶性

與蜂花粉SDF的酸提工藝[16](得率7.31%)、堿提工藝[17](得率12.51%)相比，酶提工藝得率較低。3種提取方式制備的蜂花粉SDF產(chǎn)品，其感官指標(biāo)、膨脹力、持水力、水溶性見表3。在感官品質(zhì)上，與酸提、堿提產(chǎn)品比較，酶提產(chǎn)品呈乳白色、顏色較淺，后期應(yīng)用對成品色澤影響較小；荷花蜂花粉特有香味濃郁；呈粉末狀，易粉碎及后續(xù)處理。故在感官品質(zhì)上酶提產(chǎn)品可開發(fā)性較好。

與酸提、堿提產(chǎn)品比較，酶提產(chǎn)品的膨脹力介于二者之間，持水力最低，一方面可能因為不同的提取方式制備的蜂花粉SDF其組分不同；另一方面較好的水溶性會使酶提產(chǎn)品或多或少地溶入水中，從而影響其膨脹力和持水力的測定。酶提蜂花粉SDF水溶性高達91.26%，是酸提產(chǎn)品的1.07倍、堿提產(chǎn)品的1.51倍。故與酸提、堿提產(chǎn)品相比，酶提產(chǎn)品感官品質(zhì)較好，水溶性較高，更易于應(yīng)用在飲料類功能產(chǎn)品的研發(fā)中。

表3 蜂花粉SDF感官品質(zhì)、膨脹力、持水力和水溶性?

? 同一列中標(biāo)不同字母表示差異極顯著(P<0.05)。

2.4 不同提取方式蜂花粉SDF單糖組分

混合標(biāo)準(zhǔn)單糖和酶提產(chǎn)品液相色譜圖見圖5，酶提、酸提、堿提3種方式制備的蜂花粉SDF單糖組分相對質(zhì)量見表4。由表4可知，3種提取方式制備的蜂花粉SDF產(chǎn)品均含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5種單糖組分，此外酶提產(chǎn)品還含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸2種糖醛酸組分。結(jié)果表明，蜂花粉SDF提取方式不同，得到SDF產(chǎn)品單糖組分及其相對含量有所差異，這可能是不同提取條件，蜂花粉細胞壁裂解的組分不同、同一組分裂解方式不同。

2.5 不同提取方式蜂花粉SDF紅外光譜圖

酶提、酸提、堿提蜂花粉SDF紅外光譜見圖6，不同提取方式制備的蜂花粉SDF紅外光譜圖均具有多糖特征吸收峰，且峰形相似，但吸收峰的相對強度各有差異。其中，在3 304 cm-1附近吸收峰，為O—H伸縮振動；2 927 cm-1附近吸收峰，為糖類的C—H伸縮振動；1 637 cm-1附近吸收峰，為C═O伸縮振動；1 410 cm-1附近吸收峰，為C—H變角振動；1 070 cm-1附近吸收峰，為C—O伸縮振動，也屬于糖分子的特征峰[22]。另一方面，不同提取條件下產(chǎn)品組分、純度略有差異，可能導(dǎo)致吸收峰強度不同[23]。

1. 甘露糖 2. 鼠李糖 3. 葡萄糖醛酸 4. 半乳糖醛酸 5. 葡萄糖 6. 半乳糖 7. 阿拉伯糖

圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖、酶提蜂花粉SDF的液相色譜圖

Figure 5 HPLC chromatogram of standard mixed monosaccharides and bee pollen SDF in enzymatic extraction

表4 蜂花粉SDF單糖組分相對含量

a. 堿提 b. 酶提 c. 酸提

3 結(jié)論

用纖維素酶提取蜂花粉SDF，酶提產(chǎn)品呈乳白色粉狀，具有荷花蜂花粉特有香味，具有一定的膨脹力、持水力，水溶性較好，含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖7種單糖，其紅外光譜圖具有多糖的特征吸收峰。

蜂花粉SDF酸提、堿提、酶提3種提取工藝中，堿提工藝得率最高；酶提產(chǎn)品感官品質(zhì)、水溶性較好，利于后期的加工處理，更易于應(yīng)用在功能食品，尤其是飲料類產(chǎn)品的開發(fā)中。

后期將對3種提取工藝制備的SDF進行分離純化及功能特性比較，為產(chǎn)品開發(fā)利用提供進一步的理論依據(jù)。

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Enzymatic extraction of bee pollen soluble dietary fiber and its physicochemical analysis

ZHENG HuiCHENXi-pingYOUZhen-danXIADong-xueHUXi

(CollegeofPharmacy,HunanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Changsha,Hunan410208,China)

Bee pollen soluble dietary fiber was extracted by enzymatic extraction, and the physicochemical properties was analyzed, while, the products were compared with the bee pollen soluble dietary fiber by acid extraction and alkali extraction. The optimal enzymatic extraction conditions were determined as follows: extraction temperature 50 ℃, extraction time 2 h, enzyme 2.5%, pH 4. Under the conditions, the yield of bee pollen soluble dietary fiber was 4.11%. The product is milk-white powder, and has good smell. The swelling capacity, water holding capacity and the water-solubility of the fiber were 2.03 mL/g, 1.01 g/g, 91.26%, respectively. The bee pollen soluble dietary fiber was composed of 7 kinds of monosaccharide, such as mannose, rhamnose, glucuronic acid, galacturonic acid, glucose, galactose and arabinose, and has the absorption peak of polysaccharides. Compared with alkali extraction and acid extraction, The bee pollen soluble dietary fiber has better water solubility and sensory quality, and is easier to apply enzymatic extraction to the beverage products development.

bee pollen; soluble dietary fiber; enzymatic extraction; monosaccharides; infrared spectrum

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.040

湖南省科技廳科技計劃項目(編號：2014SK3015)；湖南中醫(yī)藥大學(xué)青年教師科研基金(編號：99820001-131)

鄭慧，女，湖南中醫(yī)藥大學(xué)講師，碩士。

陳希平(1964-)，女，湖南中醫(yī)藥大學(xué)副教授，博士。 E-mail: 1716425066@qq.com

2016—09—05