陳 程 羅國平 閆夢茹 文 明 黨 莎

(西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021)

超聲波—大孔樹脂聯(lián)用提取富集追風(fēng)七總黃酮及其清除自由基活性研究

陳 程 羅國平 閆夢茹 文 明 黨 莎

(西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021)

采用超聲波法提取、大孔樹脂富集純化追風(fēng)七總黃酮，并測試其清除自由基活性能力。以液料比、乙醇濃度、超聲功率、超聲溫度、超聲時間為自變量，總黃酮提取量為因變量，采用單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化提取工藝；以總黃酮的吸附量和解析率為評價指標(biāo)，考察純化追風(fēng)七總黃酮大孔樹脂的吸附性和洗脫參數(shù)；采用清除DPPH自由基活性評價追風(fēng)七中總黃酮的抗氧化能力。結(jié)果表明：超聲提取追風(fēng)七總黃酮的最佳工藝為：超聲功率300 W、乙醇濃度45%、液料比16∶1(mL/g)、超聲時間102 min，超聲溫度73 ℃，在該條件下總黃酮提取量為17.02 mg/g；AB-8樹脂富集純化追風(fēng)七總黃酮最佳工藝條件為：樹脂柱徑高比1∶6，上樣質(zhì)量濃度為0.5 g/mL，上樣量為20 mL(2 BV)，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，洗脫液用量60 mL(6 BV)。純化后總黃酮保留率達(dá)83.3%，精制倍數(shù)達(dá)4.5倍，總黃酮含量達(dá)61%。清除自由基試驗結(jié)果表明：總黃酮純化物的IC50明顯小于總黃酮提取物，略大于VC，其DPPH自由基清除IC50值為57.4 μg/mL，其IC50大小順序為VC<總黃酮純化物<總黃酮提取物。

追風(fēng)七；總黃酮；超聲波輔助提??；大孔樹脂；清除自由基

追風(fēng)七(Geumaleppicum)屬薔薇科水楊梅屬植物，為“太白七藥”之一，主要分布于太白山區(qū)海拔2 700～2 900 m，資源豐富，民間以全草或根入藥，具有清熱解毒、利尿、消腫止痛功效[1]。研究[2]表明，合成抗氧化劑BHA/BHT具有致癌作用，而天然抗氧化劑具有抗氧化效率高、清除氧自由基效率高、作用時間長、毒副作用小等特點(diǎn)。黃酮類化合物作為一類植物次生代謝產(chǎn)物越來越受關(guān)注，不僅具有抗腫瘤、降血糖等生理功能，還具有較強(qiáng)的抗氧化性[2-4]。文獻(xiàn)[5～6]報道的從追風(fēng)七中分離到的化合物有鞣質(zhì)、三萜、黃酮等。目前關(guān)于追風(fēng)七總黃酮提取純化工藝研究尚未見報道，本研究擬采用超聲波提取法優(yōu)化追風(fēng)七總黃酮提取工藝，并對提取物進(jìn)行富集純化及其清除自由基試驗，旨在為下一步研究提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

追風(fēng)七：陜西太白產(chǎn)，購于當(dāng)?shù)厮幉氖袌觯?jīng)西安醫(yī)學(xué)院馮永輝教授鑒定為薔薇科水楊梅屬植物追風(fēng)七的全草；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，批號：20140919，上海士峰生物科技有限公司；

DPPH試劑、VC：純度≥98%，美國Sigma-Aldrich公司；

亞硝酸納、氫氧化鈉等：分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外-可見分光光度計：Cary-60型，美國Agilent公司；

超聲波清洗儀：KQ型，昆山超聲儀器有限公司；

電子天平：SQP型，德國Sartorius公司；

電子天平：CP2102型，奧豪斯儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Re型，上海亞榮生化儀器設(shè)備廠；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：GZ9147型，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取5.00 mg蘆丁對照品于25 mL容量瓶中，加60%乙醇超聲溶解并用其定容至刻度，即得對照品溶液。精密移取上述對照品溶液2.0 mL置于25 mL具塞試管中，加入5%亞硝酸納溶液0.5 mL，搖勻，靜置5 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，靜置5 min，再加入4%氫氧化鈉溶液 10 mL，最后用60%乙醇定容至刻度線，搖勻，放置15 min[7]。于400～600 nm范圍內(nèi)掃描，506 nm處為最大吸收峰，故選擇506 nm為測定波長。用移液管準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL分別置于25 mL具塞試管中，按照上述方法顯色，以試劑空白為參照，在506 nm波長處測定吸光度，進(jìn)而建立總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品溶液按照上述顯色方法制樣，測定其吸光度并計算總黃酮含量，總黃酮提取量以每克藥材中總黃酮量表示(mg/g)。

1.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取試驗 參照文獻(xiàn)[8～9]并結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選取液料比、超聲時間、乙醇濃度和超聲溫度4個因素為自變量，采用Box-Behnken設(shè)計原理進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗安排，以總黃酮提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行二次多項回歸方程的擬合及提取工藝條件的優(yōu)化。

1.2.3 追風(fēng)七總黃酮的純化試驗

(1) 大孔樹脂的預(yù)處理：將各種型號樹脂分別用95%乙醇浸泡24 h，待其充分溶脹后，用水洗至無白色渾濁現(xiàn)象，再以蒸餾水洗至無醇味，然后用4% HCl溶液浸泡4 h，然后用蒸餾水洗至中性，再用4% NaOH溶液浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性，儲存于蒸餾水中備用。

(2) 大孔樹脂型號的篩選：稱取預(yù)處理好的4種型號樹脂：AB-8、D-101、HPD-722、HPD-100各2.0 g(濕)，置100 mL錐形瓶中，分別加入50 mL樣品液，充分振蕩，每1 h振搖1次，共24 h，計算各種型號樹脂的吸附率。將濾出的各樹脂另置于100 mL具塞錐形瓶中，加入70%乙醇50 mL，充分振蕩，每1 h振搖1次，共12 h，取上清液得解吸液，計算解吸率。綜合吸附率和解吸率選擇樹脂類型。

(3) 上樣液質(zhì)量濃度考察：取上樣液4份，每份15 mL，分別加水制成1.0，0.5，0.25，0.15 g/mL，上柱，加入50 mL蒸餾水水洗，收集過柱液和水洗液，定容，按“1.2.1”項中方法測定總黃酮含量，計算吸附率進(jìn)而選擇最佳上樣質(zhì)量濃度。

(4) 樹脂徑高比：取上樣液3份，每份15 mL，分別通過3根樹脂量相等且徑高比分別為1∶6，1∶8，1∶10大孔樹脂柱，以1 BV/h動態(tài)吸附，水洗至無鹽酸鎂粉反應(yīng)，收集洗脫液，定容，按“1.2.1”項中方法測定總黃酮含量，計算吸附率進(jìn)而計算最佳樹脂徑高比。

(5) 滲漏曲線考察：稱取經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹脂10 g(抽干)，以濕法進(jìn)行裝柱，取經(jīng)處理過的藥液60 mL，上柱，分段收集過柱液，每5 mL作為一流分，計算總黃酮含量，以累計流分總體積為橫坐標(biāo)，以各組分中總黃酮含量為縱坐標(biāo)，繪制滲漏曲線。

(6) 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察：稱取經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹脂10 g(抽干)，以濕法進(jìn)行裝柱，取經(jīng)處理過的藥液15 mL，按照上述優(yōu)選工藝條件上柱，先用50 mL蒸餾水進(jìn)行水洗，再用30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇5 BV分別進(jìn)行洗脫，收集各洗脫液，計算總黃酮含量。

(7) 洗脫液用量考察：稱取經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹脂10 g(抽干)并進(jìn)行濕法裝柱，精密移取經(jīng)處理過的藥液15 mL上柱，先用 5 BV(50 mL)純化水水洗，再用40%乙醇6 BV(60 mL)進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，每5 mL作為一流分。以累計流分總體積為橫坐標(biāo)，以各組分總黃酮含量為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。

1.2.4 清除自由基活性試驗 DPPH在有機(jī)溶劑中呈現(xiàn)紫色，在517 nm波長處有較大吸收。當(dāng)加入抗氧化劑時DPPH的單電子被配對使其在此波長下吸收減弱，根據(jù)顏色變淺的程度與配對電子數(shù)成化學(xué)計算關(guān)系進(jìn)行定量分析，清除率越高表示抗氧化能力越強(qiáng)[10-11]。稱取DPPH試劑適量，加入無水乙醇溶解后配制成1.5 mg/mL DPPH溶液。將1 mL不同濃度的樣品溶液(總黃酮提取物、總黃酮純化物、VC)加入2 mL DPPH溶液中，再加無水乙醇定容至10 mL，暗光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光度。DPPH清除率按式(1)計算：

(1)

式中：

S—DPPH清除率，%；

A1——加入DPPH后樣品液測得吸光度；

A2——未加入DPPH樣品液測得吸光度；

A3——空白對照吸光度。

并且計算IC50(半數(shù)抑制濃度)，即DPPH自由基清除率為50%時的總黃酮濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

以蘆丁的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得回歸方程A=0.470 1C+0.021 7，r=0.999 5，A與C在0.39～1.20 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化追風(fēng)七總黃酮提取工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定影響追風(fēng)七總黃酮提取量的4個因素：料液比、超聲時間、乙醇濃度、超聲溫度。因素水平見表1，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 試驗因素水平表

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

Table 2 Experimental design and results of response surface methdology

試驗號ABCDY總黃酮提取量/(mg·g-1)1101014.842-10-1011.243000016.524-100-115.84501-1011.576-1-10012.8770-1-1012.6780-10115.269-100115.8810100115.611110-1011.9712-101016.2313-110011.3514001114.621500-1113.9116011010.22171-10011.2418110010.741900-1-110.2620000016.64210-11015.5722000016.55230-10-113.5324100-111.4625000014.9326010112.3627000016.6828001-114.7629010-112.76

根據(jù)表2試驗結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行多元回歸方程擬合和方差分析，方差分析結(jié)果見表3，回歸方程為：

Y=16.26-0.53A-1.13B+1.24C+0.75D-0.04AB-0.53AC+1.03AD-1.13BC-0.52BD-0.95CD-1.33A2-2.45B2-1.63C2-0.61D2。

(2)

二次方程模型具有極顯著性(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，相關(guān)系數(shù)R2=0.905 1，說明回歸方程模型得出預(yù)測值與實測值具有高度相關(guān)性，擬合性較好，試驗誤差較小，可用于該試驗結(jié)果的預(yù)測。

超聲時間和乙醇濃度對提取量影響極顯著(P<0.01)，超聲溫度對提取量影響顯著(P<0.05)，各因素影響順序為：乙醇濃度>超聲時間>超聲溫度>料液比。將表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面曲面分析，得到兩個因素交互作用對響應(yīng)值的影響，二者呈較好的二次拋物線關(guān)系。

利用Design-Expert 8.0.5軟件分析得出，總黃酮提取量最大理論預(yù)測值為16.89 mg/g,工藝條件為：超聲功率300 W，液比料16.2∶1(mL/g)，提取時間102.5 min，乙醇濃度44.5%，提取溫度72.8 ℃?？紤]試驗可操作性，將工藝優(yōu)化為：超聲功率300 W，液料比16∶1(mL/g)，超聲時間102 min，乙醇濃度45%，超聲溫度73 ℃。在此條件下進(jìn)行驗證性實驗，總黃酮提取量均值為17.02 mg/g，RSD為0.29%，相對誤差為0.77%，試驗結(jié)果表明預(yù)測值與實際值的偏差較小，所建立的模型預(yù)測較好。

表3 回歸模型方差分析?

? *表示差異顯著，P<0.05；** 表示差異極顯著，P<0.01；R2=0.905 1。

2.3 大孔吸附樹脂試驗

2.3.1 大孔樹脂的篩選 由圖1可知，大孔樹脂對總黃酮類化合物具有較強(qiáng)的吸附能力，吸附能力順序為AB-8>HPD-722>HPD-100>D101，說明大孔樹脂對追風(fēng)七總黃酮有較強(qiáng)的選擇性。AB-8型樹脂的吸附率和解吸率均優(yōu)于其他類型的樹脂。綜合以上試驗結(jié)果，采用AB-8型樹脂對追風(fēng)七總黃酮進(jìn)行純化。

圖1 不同類型樹脂對總黃酮的靜態(tài)吸附和解吸的影響

Figure 1 Effect on static adsorption and desorption rate of different types of resin for total flavonoids

2.3.2 上樣質(zhì)量濃度的影響 由圖2可知，吸附率隨著上樣濃度的變化呈拋物線的趨勢，原因可能是濃度較低時總黃酮分子與樹脂接觸機(jī)會大，濃度過大時分子擴(kuò)散受抑制，導(dǎo)致吸附量下降。當(dāng)上樣濃度達(dá)0.5 g/mL時吸附率達(dá)到最大值，故選擇上樣濃度為0.5 g/mL。

2.3.3 樹脂徑高比的影響 由圖3可知，徑高比對大孔樹脂吸附性能影響明顯，當(dāng)徑高比達(dá)1∶6時吸附率達(dá)最大值，故選擇徑高比為1∶6。

2.3.4 滲漏曲線考察 由圖4可知，當(dāng)上樣量達(dá)20 mL時基本沒有滲漏，超過20 mL時發(fā)生明顯的滲漏，因此在最佳吸附條件下，大孔樹脂的上樣量為20 mL(2 BV)。

圖2 上樣質(zhì)量濃度對總黃酮吸附率的影響

圖3 徑高比對總黃酮吸附率的影響

圖4 累計滲漏曲線

2.3.5 洗脫條件考察

(1) 乙醇濃度對總黃酮解吸率的影響：由圖5可知，乙醇濃度對總黃酮解吸率影響比較明顯，總體呈減小趨勢，當(dāng)乙醇濃度達(dá)40%時收集液中總黃酮的含量最高，故選擇40%乙醇為最佳洗脫溶媒。

(2) 洗脫液用量對總黃酮解吸率的影響：由圖6可知，隨著洗脫液量的增加收集液中總黃酮的含量呈先增加后減小的趨勢，當(dāng)洗脫液量達(dá)60 mL(6 BV)時收集液中無總黃酮，故選擇洗脫液用量為60 mL(6 BV)。

圖5 乙醇濃度對總黃酮解吸率的影響

圖6 洗脫液用量對總黃酮解吸率的影響

2.3.6 驗證實驗 為了考察上述工藝條件的穩(wěn)定性，平行進(jìn)行3次驗證性實驗，并計算精制倍數(shù)和保留率，經(jīng)測定保留率分別為83.42%，83.53%，82.95%；精致倍數(shù)達(dá)4.5倍，工藝穩(wěn)定性良好。將解吸液真空干燥至恒重，經(jīng)計算總黃酮純度達(dá)61%。

2.4 清除自由基活性測定

由圖7可知，追風(fēng)七總黃酮提取物、總黃酮純化物對DPPH自由基具有一定的清除作用，并隨著濃度的增加，清除率呈先增加后平緩的趨勢，并且在一定的濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系?？傸S酮純化物對DPPH自由基的清除能力明顯強(qiáng)于追風(fēng)七總黃酮提取物，但略弱于VC。由表4可知，總黃酮純化物的IC50明顯小于總黃酮提取物，略大于VC，其DPPH自由基清除IC50值為57.4 μg/mL，其IC50大小順序為VC<總黃酮純化物<總黃酮提取物。

圖7 DPPH自由基清除能力

樣品IC50/(μg·mL-1)VC54.4總黃酮純化物57.4總黃酮提取物106.1

3 結(jié)論

本試驗采用超聲波聯(lián)用大孔樹脂技術(shù)針對追風(fēng)七中總黃酮提取純化工藝進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行清除自由基試驗。響應(yīng)面法優(yōu)化得到超聲提取工藝條件簡便可行，總黃酮含量達(dá)17.02 mg/g；AB-8型大孔樹脂富集總黃酮工藝條件可靠，總黃酮保留率較高，其含量61%；對DPPH自由基清除作用IC50大小順序為VC<總黃酮純化物<總黃酮提取物，其DPPH自由基清除IC50值為57.4 μg/mL。上述研究結(jié)果為追風(fēng)七藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和制劑研究提供理論依據(jù)。本文研究不足之處：① 追風(fēng)七總黃酮抗氧化活性評價指標(biāo)選擇較單一，下一步體外活性試驗將增加ABTS法和FRAP法，體內(nèi)抗氧化活性選取小鼠血清SOD活性和MDA含量作為評價指標(biāo)，進(jìn)而綜合評價體內(nèi)外抗氧化活性；② 對追風(fēng)七總黃酮應(yīng)分離和鑒定，圍繞構(gòu)效關(guān)系進(jìn)一步明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Study on technology of ultrasound-assisted extraction combined macroporous resin purification enrichment for total flavonoids from Geum aleppicum and its radical scavenging activity

CHEN ChengLUOGuo-pingYANMeng-ruWENMingDANGSha

(PharmaceuticalInstitute,Xi’anMedicalUniversit,Xi’an,Shaanxi710021,China)

Taking the total flavonoids fromGeumaleppicumby using ultrasound-assisted extraction and purification techniques, and test the scavenging ability to DPPH of total flavonoids. With extraction quantity of total flavonoids as dependent variable, the independent variables including ratio of liquid to solid, ethanol concentration, ultrasonic power, ultrasonic temperature and ultrasonic time were studied on extraction by single experiment and response surface methodology; the adsorption and desorption of total flavonoids were used to investigate adsorption and elution conditions of macroporous resin; the scavenging ability to DPPH was used to investigate antioxidant activity. The optimal extraction conditions were: ultrasonic power 300 W, ethanol concentration45%, the ratio of liquid to solid 16∶1(mL/g), extraction time 102 min, extraction temperature 73 ℃. Under the conditions, the extraction amount of flavonoids was 17.02 mg/g. AB-8 macroporous resin purification techniques conditions were: concentration of feed 0.5 g/mL, the ratio of diameter-height 1:6, the volume of polyphenols sample 20 mL (2 BV), elute ethanol concentration 40%, elute volume 60 mL (6 BV). After eluted with AB-8 resin, the retention rate of total flavonoids was 83.3%, the refined multiples was 4.5 times, the content of total flavonoids was 61%. The result of experiment on scavenging ability to DPPH showed thatIC50value of purification was obviously less than that of extracts of total flavonoids, and a little higher than that of VC, the scavenging order was VC

Geumaleppicum; Total flavonoids; ultrasound-assisted extraction; macroporous resin; free radical scavenging activity

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.034

西安醫(yī)學(xué)院科研基金項目(編號：2015QN07)；西安醫(yī)學(xué)院本科教學(xué)改革研究項目(編號：2016JG-21)；西安醫(yī)學(xué)院學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助(編號：1007)

陳程，男，西安醫(yī)學(xué)院講師，碩士。

羅國平(1979-)，男，西安醫(yī)學(xué)院副教授，碩士。 E-mail:36163297@qq.com

2016—09—08