肖雪莉 張 珍 張盛貴 徐榮榮 狄 蕊 呂錦第 劉 雅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

α-半乳糖苷酶輔助飽和硫酸銨法制備IgG及其活性研究

肖雪莉 張 珍 張盛貴 徐榮榮 狄 蕊 呂錦第 劉 雅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

以新鮮牦牛血為原材料，采用α-半乳糖苷酶輔助飽和硫酸銨鹽析處理獲得免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，選取酶解時(shí)間、酶解pH、酶解溫度、酶添加量4個(gè)因素，在4個(gè)單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法，得到α-半乳糖苷酶輔助飽和硫酸銨法制備IgG的最佳酶解條件。并采用ELISA方法檢測(cè)經(jīng)過(guò)酶處理后樣品IgG活性含量。結(jié)果表明，酶解時(shí)間2 h、酶解pH 4.4、酶解溫度39 ℃、酶添加量5 mL(467.5 U)，在該工藝條件下，IgG的含量最高，可達(dá)27.13 mg/mL，比不加酶處理IgG含量(22.35 mg/mL)提高了21.39%(P<0.05)。經(jīng)過(guò)酶處理后樣品IgG活性含量為15.92 mg/mL，比不加酶處理IgG活性含量(16.07 mg/mL)下降了0.93%。

牦牛血；α-半乳糖苷酶；飽和硫酸銨；免疫球蛋白G(IgG)；活性

牦牛血液中有豐富的蛋白質(zhì)，全血中蛋白含量為(15.5±0.8)%(其中：血漿中為6.9%±0.7%，血細(xì)胞中32.7%±0.9%)，是非常理想的蛋白質(zhì)資源[1-2]。哺乳動(dòng)物和人類(lèi)的血液、組織液等液體中普遍存在IgG，IgG具有重要的免疫和生理調(diào)節(jié)作用[3]。目前甘肅等西部地區(qū)牦牛屠宰后牦牛血液直接排放，不但污染環(huán)境，也浪費(fèi)了資源。

傳統(tǒng)提取IgG的方法主要有鹽析法[4]、有機(jī)溶劑沉淀法[5]、雙水相法[6]3種，但3種方法只能提取IgG粗品。IgG作為一種糖蛋白，其表面糖基決定了特異性抗原決定簇引起的免疫排斥效應(yīng)[7]。采用α-糖基轉(zhuǎn)移酶去除IgG表面的聚糖，斷裂非還原末端的α-D-半乳糖苷鍵，水解成為D-半乳糖、D-甘露糖等單糖[8]，暴露了與抗原結(jié)合部位，使之更易與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，或與之結(jié)合得更緊密[9]?？捎行Ы档兔庖吲懦庑?yīng)從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)[10]，同時(shí)IgG在去糖基化酶處理后是否保持活性以及含量準(zhǔn)確性的變化等問(wèn)題也值得深入研究。在常規(guī)鹽析法基礎(chǔ)上去除糖基后探討對(duì)IgG含量和活性的影響，在國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)擬以牦牛血液為原料，在飽和硫酸銨鹽析處理基礎(chǔ)上結(jié)合α-半乳糖苷酶酶解去除IgG表面聚糖，研究去糖基化對(duì)IgG含量及活性的影響，以期為今后IgG免疫排斥方面提供一定的理論支持

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛血：甘肅甘南瑪曲屠宰廠；

α-半乳糖苷酶：酶活93.5 U/mL，美國(guó)Sigma公司；

牛IgG對(duì)照品、羊抗牛IgG抗體：抗體效價(jià)比1∶16～1∶32，北京金生科技有限公司；

牛血清白蛋白：純度98%，上海中秦化學(xué)試劑有限公司；

酶聯(lián)免疫試劑盒：美國(guó)Wksu-BIO公司；

高速冷凍離心機(jī)：H-1850R型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV722S型，北京普析通用儀器有限責(zé)公司；

酶標(biāo)分析儀：RT 6000型，美國(guó)Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 牦牛血清預(yù)處理 參照岳喜慶等[11]的方法，略有改動(dòng)：新鮮牦牛血中加入1/10原血液體積濃度為3.8%的檸檬酸鈉作為抗凝劑，混勻后，將已抗凝的血液于4 ℃、5 000 r/min 條件下，離心處理20 min，沉降血細(xì)胞，上清液即為血清，-20 ℃下冷藏備用。

1.2.3α-半乳糖苷酶溶液的配置 將a-半乳糖苷酶溶于50 mL 3.5 mol/L(NH4)2SO4、CH3COONa緩沖液中，調(diào)整pH到5.5，酶溶液的酶活為93.5 U。

1.2.4 鹽析 參照金晶[12]27的方法。

1.2.6 IgG含量測(cè)定 參照郭斌等[14]的方法。

1.2.7 IgG活性的測(cè)定 參照任杰等[9]的方法，修改如下：樣本孔中加入待測(cè)樣本50 μL(稀釋500倍的樣本改為稀釋600倍)。

1.2.8 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 酶解pH 對(duì)IgG含量的影響：取5 mL牦牛血清經(jīng)過(guò)預(yù)處理與飽和硫酸銨鹽析后的樣液，在酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間3 h，酶的添加量7 mL，酶解pH為4.0，4.5，5.0，5.5，6.0的條件下，進(jìn)行酶解處理，確定最佳酶解pH。

(2) 酶解溫度對(duì)IgG含量的影響：取5 mL牦牛血清經(jīng)過(guò)預(yù)處理與飽和硫酸銨鹽析后的樣液在pH 4.5，酶解時(shí)間3 h，酶的添加量7 mL，酶解溫度為35，40，45，50，55 ℃的條件下，進(jìn)行酶解處理，確定最佳酶解溫度。

(3) 酶解時(shí)間對(duì)IgG含量的影響：取5 mL牦牛血清經(jīng)過(guò)預(yù)處理與飽和硫酸銨鹽析后的樣液在pH 4.5，酶解溫度45 ℃，酶的添加量7 mL，酶解時(shí)間為1，2，3，4，5 h的條件下，進(jìn)行酶解處理，確定最佳酶解時(shí)間。

(4) 酶解添加量對(duì)IgG含量的影響：取5 mL牦牛血清經(jīng)過(guò)預(yù)處理與飽和硫酸銨鹽析后的樣液在pH 4.5，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間3 h，酶的添加量為1，3，5，7，9 mL的條件下，進(jìn)行酶解處理，確定最佳酶解添加量。

1.2.9 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)中將酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、酶添加量關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定各因素的影響范圍，并確定各試驗(yàn)因素的中心水平值，采用四因素五水平二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、酶添加量為自變量，IgG濃度響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4 因素29 組試驗(yàn)的回歸正交旋轉(zhuǎn)組合的分析試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 IgG含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，可見(jiàn)分光光度法測(cè)得IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.171 0x+0.100 0，R2=0.999 0；IgG的含量在0.5～3.0 mg/mL 時(shí)，吸收度和含量呈良好的線性關(guān)系。

2.2 IgG活性標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖2可知，可見(jiàn)分光光度法測(cè)得IgG活性標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.073 53x+0.044 9，R2=0.999 4；IgG活性含量在4～20 μg/mL時(shí)，吸收度和含量呈良好的線性關(guān)系。

圖1 IgG含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 ELISA試劑盒測(cè)定牦牛血中IgG的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 2 ELISA kit was developed for the determination of IgG in yak blood standard curve

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 酶解pH 對(duì)IgG含量的影響 由圖3可知，IgG含量隨著pH的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在pH為4.5時(shí)，IgG含量達(dá)到最大，IgG含量為27.19 mg/mL，并與其他水平有顯著性差異(P<0.05)，在pH 5.0，5.5，6.0時(shí)IgG含量分別比pH為4.5降低了20.47%，16.30%，15.90%，IgG在pH 4.0，IgG結(jié)構(gòu)變化，會(huì)發(fā)生部分變性[15]。由于pH在過(guò)高條件下，α-半乳糖苷酶的(His、Asp、Cys)極性氨基酸基團(tuán)被修飾，酶活損失，影響α-半乳糖苷酶的酶解IgG速率以及甘露糖半乳糖釋放速率，綜上所述，選用pH 4.5是較優(yōu)選擇。

不同字母表示a值在0.01條件下差異顯著(P≤0.05)；相同字母表示a值在0.01條件下差異不顯著(P>0.05)

圖3 酶解pH 對(duì)IgG含量的影響

Figure 3 Effect of enzymatic hydrolysis pH on the IgG content

2.3.2 酶解溫度對(duì)IgG含量的影響 由圖4可知，IgG含量隨著溫度的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，溫度40 ℃時(shí)，IgG濃度達(dá)到最大，IgG含量為26.62 mg/mL并與其他水平有差異。在溫度35 ℃時(shí)，IgG含量最低，這是因?yàn)樵谒嵝原h(huán)境中，IgG對(duì)于溫度更加敏感，開(kāi)始失活的溫度有所降低[16]。在溫度40 ℃時(shí)，IgG含量提高了17.37%，這是因?yàn)闇囟仍龈?，分子運(yùn)動(dòng)加快，溶解、擴(kuò)散程度也加快，有利于有效成分的提出。但溫度過(guò)高，有些有效成分被破壞，酶的活性降低，甚至失活。當(dāng)溫度為45，50，55 ℃時(shí)，IgG含量相比40 ℃時(shí)分別下降了5.05%，12.61%，16.75%，由于隨著溫度的進(jìn)一步升高，α-半乳糖苷酶的變性程度進(jìn)一步加大，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，酶解溫度以40 ℃為宜。

不同字母表示a值在0.01條件下差異顯著(P≤0.05)；相同字母表示a值在0.01條件下差異不顯著(P>0.05)

圖4 酶解溫度對(duì)IgG含量的影響

Figure 4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the IgG content

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)IgG含量的影響 由圖5可知，IgG含量隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)，在酶解時(shí)間為2 h時(shí)，IgG濃度達(dá)到最大，IgG含量為26.32 mg/mL，在酶解時(shí)間為1 h時(shí)，IgG含量較低，這是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過(guò)短，反應(yīng)不充分，不能完全酶解IgG。當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí)，IgG含量提高了17.76%，當(dāng)酶解3 h時(shí)，IgG含量下降0.84%(P>0.05)，與2 h時(shí)沒(méi)有顯著性差異。這是因?yàn)榈孜锱c產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到溶解平衡，水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，作用底物被消耗水解度隨之下降。在酶解時(shí)間為4，5 h時(shí)，IgG含量分別下降了4.44%，6.52%，這是因?yàn)殡S著酶解產(chǎn)物的增加，加快了逆反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)速率隨之下降，所以IgG含量也會(huì)下降，酶解時(shí)間以2 h為宜。

不同字母表示a值在0.01條件下差異顯著(P≤0.05)；相同字母表示a值在0.01條件下差異不顯著(P>0.05)

圖5 酶解時(shí)間對(duì) IgG含量的影響

Figure 5 Effect of enzymatic hydrolysis time on the IgG content

2.3.4 酶添加量對(duì)IgG含量的影響 由圖6可知，IgG含量隨著酶添加量的加入呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)，在酶添加量為5 mL時(shí)，IgG含量達(dá)到最大，IgG含量為26.27 mg/mL。酶添加量為1 mL，IgG含量相比5 mL時(shí)分別下降了11.17%，有顯著性差異(P<0.05)，這是因?yàn)殡S著酶添加量的升高，與底物的接觸面積增大。當(dāng)酶的添加量達(dá)到飽和時(shí)，繼續(xù)添加酶時(shí)，底物濃度相對(duì)較低，酶與底物競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)酶的添加量為7 mL和9 mL時(shí)，IgG含量分別降低了0.42%，1.08%，同時(shí)酶解中間產(chǎn)物會(huì)改變鹽溶液的構(gòu)成，影響IgG的析出與酶的接觸面積、副產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致逆反應(yīng)的發(fā)生不利于IgG含量的進(jìn)一步提高，綜上所述，選用5 mL的酶添加量為宜。

不同字母表示a值在0.01條件下差異顯著(P≤0.05)；相同字母表示a值在0.01條件下差異不顯著(P>0.05)

圖6 酶添加量對(duì)IgG含量的影響

Figure 6 Effect of add the amount of enzymeon the IgG content

2.4 響應(yīng)面法確定α-半乳糖苷酶酶解IgG的最佳工藝

通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇IgG含量影響較大的4個(gè)因素時(shí)間、溫度、pH、酶添加量四個(gè)因素，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)編碼水平

根據(jù)Box-Behnken的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)原理，以酶解溫度、時(shí)間、pH以及酶添加量對(duì)IgG濃度影響見(jiàn)表2。以IgG含量值為響應(yīng)值，得出酶解溫度、時(shí)間、pH以及酶添加量的編碼值為自變量的四元二次回歸方程：

Y=29.51-0.23A-0.12B-0.33C-0.042D-0.039AB-0.11AC+0.034AD+7.50E-003BC-0.069BD-0.053CD-0.42A2-0.45B2-0.66C2-0.57D2。

(1)

2.4.1 響應(yīng)面分析 由表3可知，交互作用中，時(shí)間和pH的交互作用對(duì)IgG濃度有顯著影響，其他P值均大于0.05，說(shuō)明其顯著性不明顯。圖7顯示了當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí)，隨著酶解pH的增大，IgG濃度呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酶解pH 4.30～4.50時(shí)，IgG濃度最大。當(dāng)酶解pH一定時(shí)，酶解時(shí)間1.8～2.0 h時(shí)，IgG濃度最大。

圖7 酶解pH、酶解時(shí)間對(duì)IgG濃度的響應(yīng)面圖

試驗(yàn)號(hào)ABCDIgG濃度/(mg·mL-1)11.001.001.001.0025.992-1.001.001.001.0025.7331.00-1.001.001.0025.884-1.00-1.001.001.0025.4451.001.00-1.001.0025.396-1.001.00-1.001.0024.9071.00-1.00-1.001.0025.648-1.00-1.00-1.001.0024.3991.001.001.00-1.0026.23101.001.001.00-1.0025.87111.00-1.001.00-1.0025.7312-1.00-1.001.00-1.0025.50131.001.001.00-1.0025.5414-1.001.001.00-1.0024.79151.00-1.001.00-1.0025.0016-1.00-1.001.00-1.0024.44172.000.000.000.0026.1118-2.000.000.000.0025.53190.002.000.000.0025.79200.00-2.000.000.0025.60210.000.002.000.0025.28220.000.00-2.000.0024.47230.000.000.002.0025.42240.000.000.00-2.0025.05250.000.000.000.0027.37260.000.000.000.0027.60270.000.000.000.0027.46280.000.000.000.0027.57290.000.000.000.0027.54

2.4.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)對(duì)IgG濃度取最大值，由軟件自動(dòng)分析可得到IgG提取工藝最佳理論值；酶解時(shí)間1.88 h、酶解溫度39.41 ℃、pH 4.39、酶添加量4.97 mL時(shí)，IgG濃度為27.58 mg/mL。考慮實(shí)際操作的方便，選取酶解時(shí)間2 h、酶解溫度40 ℃、pH 4.4、酶添加量5.0 mL，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，最終IgG濃度為27.13 mg/mL，與理論值較為接近，實(shí)際值比理論值降低了1.63%，說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型的建立對(duì)牦牛血IgG的獲取具有可行性。

2.5 未加酶處理與加酶處理提取IgG含量活性的對(duì)比結(jié)果

由表4可知，加酶處理后IgG含量顯著提高。IgG活性在加酶處理后未有顯著性的變化，原因就在于α-半乳糖苷酶是一種外切糖苷酶，酶解只能切除肽鏈兩端的聚糖，酶解程度不大，α-半乳糖苷酶酶解IgG表面少部分聚糖以后，對(duì)活性影響不大。

表3 響應(yīng)面模型的方差分析?

? **表示極顯著，P<0.01；*表示顯著，P<0.05；-表示不顯著，P>0.05。

表4 加酶與未加酶處理IgG含量與活性變化?

Table 4 Changes on IgG contents and activity between enzemy treatment and no enzemy treatment mg/mL

樣品IgG含量IgG活性加酶處理27.13b15.92a空白對(duì)照22.35a16.07a

? 同列不同字母表示在a=0.05顯著水平差異顯著(P≤0.05)；相同字母表示在a=0.05顯著水平差異不顯著(P>0.05)

3 結(jié)論

不同的酶解條件下，添加α-半乳糖苷酶對(duì) IgG表面聚糖進(jìn)行酶解，當(dāng)酶解pH為4.4，酶解溫度為39 ℃，酶解時(shí)間為2 h，酶解添加量為5 mL(酶活467.5 U)時(shí)，IgG含量為27.13 mg/mL，比不加酶含量提高了21.38%，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)經(jīng)過(guò)酶處理后樣品IgG活性含量為15.92 mg/mL，比不加酶處理IgG(活性含量16.07 mg/mL)活性下降了0.93%(P>0.05)。綜上所述，糖基轉(zhuǎn)移酶a-半乳糖苷酶在酶解糖蛋白IgG表面聚糖提高IgG含量以及對(duì)活性有所影響。至于IgG表面聚糖去糖基化以后穩(wěn)定性等問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。

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The preparation of IgG combining the method of Alpha galactose glucoside enzyme with saturated ammonium sulfate and its activity research

XIAO Xue-liZHANGZhenZHANGSheng-guiXURong-rongDIRuiLVJin-diLIUYa

(CollegeofFoodScienceandTechnology,GansuAgricultureUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China)

The optimized preparation conditions of the concentration of IgG in yak blood after salting out of saturated ammonium sulfate by single factor experiments, including the selection of the hydrolysis time, pH, temperature and the amount of enzyme, as well as the Central Composite experiment, was investigated in this study. The activity of IgG was detected by ELISA and analyzed by using the Response Surface analysis (RSA). The results showed that the optimal concentration of IgG was 27.13 mg/mL when hydrolyzed for at 39 ℃ for 2 h, and enzymolyzed at pH 4.4, using an enzyme dosage 5 mL (467.5 U), and the content of IgG was 22.35 mg/mL improve 21.28% (P<0.05) under this condition. Moreover, it was also found that the activated content of IgG was changed from 16.07 mg/mL to 15.92 mg/mL, decreased by 0.93%, after the treatment of enzyme.

yak blood;a-galactosidase; saturated ammonium sulfate; immunoglobulin G; activity

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.008

甘肅省財(cái)政廳高?；緲I(yè)務(wù)項(xiàng)目(編號(hào)：1011JKCA179)；甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào)：GNSW-2013-22)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)師基金項(xiàng)目；甘肅省自然基金(編號(hào)：1107RGZA23)

肖雪莉，女，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

張珍(1971—)，女，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。E-mail: 332037918@qq.com

2016-08-13