吳雪微 姜啟興 許艷順 于沛沛 夏文水

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

酸誘導魚糜凝膠的酸化條件研究及凝膠特性分析

吳雪微 姜啟興 許艷順 于沛沛 夏文水

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

以葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)為酸化劑，研究溫度和時間等凝膠化條件對酸誘導魚糜凝膠理化性質(zhì)的影響。結果表明：隨著凝膠化溫度從30 ℃升高到50 ℃，酸化速率升高，凝膠pH達到穩(wěn)定所需要的時間縮短，GDL誘導魚糜凝膠的凝膠強度逐漸下降，失水率逐漸上升?；瘜W作用力結果表明GDL誘導魚糜凝膠網(wǎng)絡結構主要是通過疏水相互作用維持，且與凝膠強度趨勢相一致?？値€基含量隨著溫度的升高逐漸升高，說明二硫鍵含量逐漸降低。SDS-PAGE結果顯示GDL誘導魚糜凝膠MHC條帶強度受溫度影響較小。當凝膠化條件為30 ℃、3.5 h時，可通過電鏡掃描觀察到一個致密均勻的網(wǎng)絡結構。說明合適的凝膠化溫度和時間可以顯著提高魚糜凝膠的質(zhì)構特性，促使魚糜形成一個致密均勻的網(wǎng)絡結構。

魚糜；葡萄糖酸內(nèi)酯；凝膠化條件；凝膠特性

魚糜制品具有高蛋白、低脂肪的特點，并且食用方便，從20世紀60年代以來，已成為一種極具發(fā)展前景的水產(chǎn)加工食品，其年產(chǎn)量由2004年的32.98萬t增長到2014年的151.79萬t，增長360.24%，是近年增長最快的水產(chǎn)食品之一[1-2]。傳統(tǒng)的魚糜凝膠制品通常是經(jīng)過熱誘導形成的，即先在較低的溫度下(40 ℃左右)進行凝膠化，然后再加熱到較高的溫度(90 ℃左右)，使其形成凝膠制品。但是，這種工藝得到的魚糜制品只能在低溫下冷藏銷售，而如果凝膠化后采用更高的溫度，如121 ℃殺菌，則對魚糜凝膠的質(zhì)構破壞比較厲害，特別是對于淡水魚糜而言，凝膠強度本身就比海魚魚糜的差。因此，如何提高魚糜制品的凝膠強度就成為近年來的研究熱點。在魚糜中添加改性淀粉[3]、多糖[4-5]等成分改善殺菌后魚糜制品的凝膠強度是常用的方法。但近年來許多研究學者[6-8]發(fā)現(xiàn)，魚肉蛋白在酸性條件下經(jīng)過酸誘導也可以形成較好的蛋白凝膠。并且魚糜凝膠制品經(jīng)過酸化后質(zhì)構變好，pH降低，產(chǎn)品具有較好的貯藏穩(wěn)定性[9]。當魚糜凝膠制品pH降到4.6以下時，就可以采用較為溫和的巴氏殺菌方式殺滅食品中的微生物，達到常溫保藏的目的。

葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)是食品中常用的凝固劑，在水中可水解釋放葡萄糖酸，降低體系pH值，從而減弱蛋白分子之間的靜電斥力，加強蛋白分子之間的相互作用，使蛋白質(zhì)凝聚形成凝膠。近年來，GDL作為酸化劑或凝固劑已被廣泛應用于大豆制品[10]、乳制品[11-12]及水產(chǎn)制品[13-15]中。國內(nèi)外已有很多研究[7,9]報道通過添加GDL可顯著提高魚糜制品的凝膠強度。但大部分的研究都集中于GDL添加量對魚糜凝膠強度的影響，凝膠化條件(溫度和時間)對酸誘導魚糜理化性質(zhì)的影響研究報道還很少，而且都集中于低溫下的酸誘導[7-8]，凝膠化時間過長，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，本研究采用相對較高的凝膠化溫度，可以顯著縮短凝膠化時間以適合工業(yè)化生產(chǎn)。

本研究擬選用養(yǎng)殖量大且價值低的鰱魚為原料，采用葡萄糖酸內(nèi)酯誘導魚糜形成凝膠，重點考察凝膠化條件(溫度和時間)對GDL誘導魚糜凝膠特性和凝膠機理的影響，旨在為提高淡水魚糜品質(zhì)和開發(fā)新型魚糜制品提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍鰱魚糜：湖北省洪湖市井力水產(chǎn)食品有限公司；

食鹽：無錫市華潤萬家超市；

葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)：含量≥99%，食品級，江西新黃海醫(yī)藥食品化工有限公司；

腸衣：山東慶云宜捷環(huán)保包裝制品有限公司；

其它試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器設備

物性分析儀：TA.XT Plus型，英國Stable Micro Systems公司；

料理機：JYL-D020型，九陽股份有限公司；

pH計：FE28型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；

紫外-可見分光光度計；UV-1000型，上海天美科學儀器有限公司；

離心機：TGL-15B型，上海安亭科學儀器廠；

恒溫水浴鍋：DK-8AXX型，上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法設計

1.3.1 凝膠化條件的確定 將冷凍魚糜在4 ℃冰箱解凍12 h，首先空斬5 min，然后加入添加量為魚糜質(zhì)量2.0%的食鹽斬拌5 min，再加入添加量為配方總質(zhì)量2.0%的GDL，混合均勻后擠入直徑為25 mm的聚偏二氯乙烯腸衣中，然后置于30，35，40，45，50 ℃的恒溫水浴鍋中，測定魚糜pH隨時間的變化，取凝膠pH穩(wěn)定的時間作為凝膠化時間。

1.3.2 魚糜凝膠的制備 將冷凍魚糜按照1.3.1進行預處理，然后分成6組，分別按照以下條件進行處理：① 加2.0%的GDL，30 ℃凝膠化3.5 h，100 ℃加熱15 min；② 加2.0%的GDL，35 ℃凝膠化3.0 h，100 ℃加熱15 min；③ 加2.0%的GDL，40 ℃凝膠化2.0 h，100 ℃加熱15 min；④ 加2.0%的GDL，45 ℃凝膠化1.5 h，100 ℃加熱15 min；⑤ 加2.0%的GDL，50 ℃凝膠化1.0 h，100 ℃加熱15 min；⑥ 對照組：不加GDL，40 ℃凝膠化30 min，100 ℃加熱15 min。加熱結束后用冷水冷卻30 min，備用。

1.4 測定方法

1.4.1 pH的測定 按GB 5009.237—2016執(zhí)行。

1.4.2 凝膠強度的測定 采用TA.XT Plus物性分析儀進行測定，將剝?nèi)ツc衣的魚糜凝膠樣品切成20 mm厚規(guī)格，每組樣品測定至少平行6次。測試條件：選取P/5s球形探頭，測試速度1 mm/s，壓縮比50%。

1.4.3 失水率的測定 稱取5 g左右魚糜凝膠樣品(m1)，用2層濾紙包裹，置于50 mL離心管中，3 000 r/min離心15 min，離心后取出稱其質(zhì)量(m2)。每組樣品測定至少平行3次。失水率按式(1)計算：

(1)

式中：

X——失水率，%；

m1——表示離心前魚糜的質(zhì)量，g；

m2——表示離心后魚糜的質(zhì)量，g。

1.4.4 化學作用力的測定 參照文獻[16]。

1.4.5 總巰基含量的測定 參照文獻[17]36。

1.4.6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)文獻[17]20,36，修改如下：采用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行電泳，開始時電泳電壓為90 V，待樣品進入分離膠后改為110 V，電泳完成后，染色3 h，脫色1 h。

1.4.7 掃描電鏡 將魚糜凝膠樣品切成3 mm×3 mm×1 mm的小塊，在4 ℃下浸泡于2.5%的戊二醛溶液中24 h使其固定，再用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)漂洗3次，每次15 min，然后用去離子水沖洗1 h，接著依次用50%，70%，90%的乙醇梯度脫水處理，每次處理15 min，再用100%的乙醇脫水3次，每次10 min，最后，真空常溫干燥24 h，經(jīng)真空離子濺射鍍金，用掃描電鏡觀察微觀結構。

2 結果與討論

2.1 凝膠化溫度對凝膠體系pH的影響

GDL在含水體系中水解產(chǎn)生葡萄糖酸，降低體系pH，溫度越高其水解速度越快，pH變化也越快，不同溫度下GDL誘導魚糜凝膠體系的pH變化情況見圖1。

由圖1可知，不同溫度下，魚糜凝膠的pH值均逐漸下降，并趨于穩(wěn)定，而且溫度越高，pH值下降得越快。30 ℃時需要3.5 h才能趨于穩(wěn)定，而50 ℃時只需1.0 h就可以達到穩(wěn)定，其余溫度則在兩者之間，35 ℃需要3.0 h達到穩(wěn)定，40 ℃需要2.0 h達到穩(wěn)定，45 ℃需要1.5 h達到穩(wěn)定。因此，選擇凝膠化條件分別為30 ℃、3.5 h，35 ℃、3.0 h，40 ℃、2.0 h，45 ℃、1.5 h，50 ℃、1.0 h。

2.2 凝膠化條件對魚糜凝膠物理性質(zhì)的影響

凝膠形成的速度會影響凝膠的特性，葡萄糖酸內(nèi)酯誘導的酸凝膠，其凝膠速度直接取決于葡萄糖酸內(nèi)酯水解產(chǎn)酸的快慢，而溫度越高，葡萄糖酸內(nèi)酯水解產(chǎn)酸越快，對不同凝膠化溫度下形成凝膠的特性進行分析，結果見圖2。

圖1 凝膠化溫度對GDL誘導魚糜凝膠體系pH的影響

圖2 凝膠化條件對GDL-誘導魚糜凝膠強度和失水率的影響

Figure 2 Effect of setting condition on gel strength and expressible water content of GDL-induced surimi gel

由圖2可知，隨著凝膠化溫度從30 ℃升高到50 ℃，酸化速率升高，酸化時間縮短，GDL誘導魚糜凝膠的凝膠強度呈下降趨勢。這可能是凝膠化溫度較低時，pH降低較慢，因此蛋白質(zhì)變性和聚集的速率也較慢，從而蛋白質(zhì)之間有足夠的時間進行有序的相互作用，可形成高強度的凝膠[7]；而40～50 ℃凝膠強度較低可能是GDL酸化與熱凝膠共同作用，從而導致凝膠速度過快，強度下降；另外，在50 ℃左右，魚糜內(nèi)源組織蛋白酶活性較高，破壞了魚糜凝膠結構，也可能導致凝膠強度降低。這與閔維[18]29-30研究的不同酸化速率條件下形成的大豆蛋白凝膠結果相一致。相比于對照熱誘導凝膠，GDL誘導魚糜的凝膠強度較高。這可能是GDL降低了魚糜凝膠pH，使魚糜蛋白分子之間靜電斥力減弱，從而蛋白分子之間相互作用增大，因此，形成的魚糜凝膠強度較高。

另一方面，隨著凝膠化溫度的升高，GDL誘導魚糜凝膠失水率呈現(xiàn)上升的趨勢。這可能與30 ℃時形成更致密均一的凝膠網(wǎng)絡結構有關，較好的凝膠網(wǎng)絡結構能夠把水束縛在里面，所以失水率相對較低。相比于對照熱誘導凝膠，GDL誘導魚糜凝膠的失水率要高一些。這可能是因為GDL降低了pH，蛋白分子之間相互作用增大，蛋白質(zhì)同水的作用減小，因此失水率要高一些[19]。Weng Wu-yin等[20]對比研究熱誘導魚糜和酸誘導魚糜時，也發(fā)現(xiàn)酸誘導魚糜凝膠的失水率相對較高。

2.3 凝膠化條件對魚糜凝膠化學作用力的影響

維持魚糜凝膠網(wǎng)絡結構的作用力主要包含離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵。對不同凝膠化條件下凝膠體系的作用力進行分析，以進一步探討GDL誘導魚糜凝膠特性變化的機理，結果見圖3。

A. 冷凍魚糜原料 B. 加GDL的經(jīng)30 ℃/3.5 h凝膠化后的魚糜 C. 加GDL的經(jīng)30 ℃/3.5 h凝膠化，100 ℃/15 min加熱后的魚糜凝膠

圖3 凝膠化條件對GDL-誘導魚糜凝膠離子鍵、氫鍵和疏水相互作用的影響

Figure 3 Effect of processing stage and setting condition on the ionic bond, hydrogen bond and hydrophobic interactions of GDL-induced surimi gel

由圖3可知，在處理階段，從冷凍魚糜原料到加熱殺菌后的魚糜，離子鍵和氫鍵呈下降趨勢，尤其是離子鍵，降低97.2%，說明離子鍵和氫鍵不是維持GDL誘導魚糜凝膠結構的主要化學作用力，而疏水相互作用卻呈上升趨勢，說明疏水相互作用是維持GDL誘導魚糜凝膠結構的主要化學作用力。隨著凝膠化溫度的升高，離子鍵和氫鍵變化不大，而疏水相互作用呈現(xiàn)下降的趨勢，這與凝膠強度的趨勢是一致的。這可能是因為緩慢降低pH，有助于降低蛋白質(zhì)變性和聚集的速率，蛋白分子之間有足夠的時間相互作用，因此，形成較多的疏水相互作用。相比于對照熱誘導凝膠，GDL誘導魚糜凝膠中疏水相互作用所占比例更大，說明在GDL誘導魚糜凝膠過程中，疏水相互作用形成更多，可能是GDL降低pH，減弱了蛋白分子之間的靜電斥力，因此，疏水相互作用形成更多。

2.4 凝膠化條件對總巰基含量的影響

二硫鍵也是反映凝膠結合的重要化學作用力，對可間接反映二硫鍵變化的總巰基含量進行了分析，結果見圖4。

A. 冷凍魚糜原料 B. 加GDL的經(jīng)30 ℃/3.5 h凝膠化后的魚糜 C. 加GDL的經(jīng)30 ℃/3.5 h凝膠化，100 ℃/15 min加熱后的魚糜凝膠

圖4 凝膠化條件對GDL誘導魚糜凝膠總巰基含量的影響

Figure 4 Effect of processing stage and setting condition on the total sulfhydryl group content of GDL-induced surimi gel

由圖4可知，在處理階段，從冷凍魚糜原料到加熱殺菌后的魚糜，總巰基含量是逐漸下降的，由此可間接表明二硫鍵交聯(lián)程度的提高，說明二硫鍵是GDL誘導魚糜凝膠形成的主要化學作用力。隨著凝膠化溫度的升高，GDL誘導魚糜凝膠的總巰基含量逐漸上升，說明二硫鍵含量逐漸下降，這與凝膠強度的趨勢相一致。這可能是凝膠化溫度較低時，酸化速率較低，因此蛋白質(zhì)變性和聚集速率也較慢，蛋白分子之間有足夠的時間相互交聯(lián)，從而保證了巰基的交聯(lián)[18]30。相比于對照熱誘導凝膠，GDL誘導魚糜凝膠中總巰基含量相對較小，說明在GDL誘導魚糜凝膠過程中，二硫鍵形成更多，可能是GDL降低了魚糜凝膠pH，從而使蛋白分子之間靜電斥力減弱，增強了蛋白分子表面游離巰基的互相接觸，促進了二硫鍵的形成。

2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了幾種處理方式下凝膠蛋白組成的變化情況，結果見圖5。

由圖5可知，相比于冷凍魚糜原料，加熱或酸化后的魚糜凝膠肌球蛋白重鏈(MHC)條帶的強度明顯減弱，表明肌球蛋白發(fā)生了明顯的變化，在250 kDa以上區(qū)段出現(xiàn)明顯的條帶，表明可能有部分肌球蛋白發(fā)生了聚集，可能是加熱或酸化誘導了MHC的交聯(lián)，形成了高分子量的蛋白聚集體，它是構成魚糜彈性凝膠體的重要部分。此外，對于GDL凝膠化處理(30～50 ℃)的魚糜凝膠，MHC條帶的強度明顯弱于對照組熱誘導凝膠，而在50～75 kDa的低分子量區(qū)段，出現(xiàn)了比較清晰的條帶，在25 kDa附近也出現(xiàn)了比較明顯的條帶痕跡，表明有小分子物質(zhì)產(chǎn)生，這說明可能是部分肌球蛋白發(fā)生了降解，這可能是由于在30～50 ℃的GDL凝膠化加熱過程中內(nèi)源蛋白酶的作用導致的，當然GDL水解產(chǎn)生的酸對蛋白質(zhì)降解可能也有一定的貢獻；而50 ℃條件下MHC條帶的強度比30～45 ℃的要弱一些，可能是該溫度下內(nèi)源蛋白酶活性更高，而GDL產(chǎn)生的酸也更快地作用。因此，綜上可見對于GDL凝膠化處理的樣品，MHC條帶強度的減弱可能是蛋白聚集和降解共同作用的結果。

Raw. 冷凍魚糜原料 MHC. 肌球蛋白重鏈 Actin. 肌動蛋白

相比于GDL誘導凝膠，對照熱誘導凝膠MHC條帶的強度要明顯高一些，說明添加GDL可以在很大程度上提高MHC的交聯(lián)，其交聯(lián)程度要高于對照熱誘導。另外，在所有樣品中原料肉的肌動蛋白條帶要明顯粗于其他樣品，表明經(jīng)過加熱后肌動蛋白發(fā)生了一定的變化，而酸誘導凝膠(30～50 ℃)與對照熱誘導凝膠之間肌動蛋白的條帶未發(fā)現(xiàn)明顯差異，表明在酸誘導過程中肌動蛋白的穩(wěn)定性較好。Weng Wu-yin等[20]對比研究魚糜原料、熱誘導魚糜與酸誘導魚糜凝膠時，也得到了類似的結論。

2.6 掃描電鏡

用掃描電子顯微鏡(SEM)對不同凝膠化條件下魚糜凝膠的微觀結構進行了觀察，結果見圖6。

由圖6可知，在凝膠化條件為30 ℃、3.5 h時，GDL誘導魚糜凝膠的網(wǎng)絡結構較為致密均勻，而且孔隙度較小，從而凝膠強度較大，而在凝膠化條件為50 ℃、1.0 h時，形成的魚糜凝膠孔隙度較大，凝膠結構較弱，因此，凝膠強度較小。這可能是因為凝膠化溫度較高時，酸化速率也較高，導致凝膠酸化過快，從而形成較大的聚集體，因此凝膠的微觀結構也變得較為粗糙[18]30。A.L.F.Cavallieri等[21]在研究不同酸化速率對WPI凝膠網(wǎng)絡結構的影響時也得到了類似的結果。另一方面，相比于GDL誘導凝膠，對照熱誘導凝膠的微觀結構也較為粗糙，這可能是因為GDL降低了魚糜凝膠pH，減弱了魚糜蛋白分子之間的靜電斥力，加強了蛋白分子之間的相互作用，因此，形成的魚糜凝膠網(wǎng)絡結構較為致密均勻。

圖6 不同凝膠化條件下的GDL誘導魚糜凝膠以及對照熱誘導凝膠的掃描電鏡圖

Figure 6 Scanning electron micrograph of GDL-induced surimi gel at different setting conditions. Con, heat-induced surimi gel

3 結論

綜上可見，相對于傳統(tǒng)熱凝膠而言，添加GDL可以顯著提高魚糜制品的凝膠強度，且凝膠化溫度和時間對GDL誘導魚糜凝膠的質(zhì)構特性也有顯著的影響。隨著凝膠化溫度的升高，凝膠強度呈下降的趨勢，因此，要想獲得較好質(zhì)構品質(zhì)的魚糜凝膠，需采用低溫長時的凝膠化條件。但是，實際應用過程中溫度過低會導致凝膠化工序耗時太長，如4 ℃條件下一般都要凝膠化24 h[9,22]，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。從提高凝膠強度的角度出發(fā)，GDL凝膠化溫度建議選擇30～35 ℃左右，凝膠化時間3.0～3.5 h比較合適。本研究為開發(fā)新型酸誘導魚糜制品提供了良好的理論指導。但限于時間僅對化學作用力等理化指標進行了研究，后續(xù)可通過研究蛋白質(zhì)構象的變化等來進一步深入分析魚糜凝膠特性變化的機理。

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Study on acidizing conditions of acid-induced surimi gel and analysis of gel properties

WU Xue-weiJIANGQi-xingXUYan-shunYUPei-peiXIAWen-shui

(SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

This research investigated the influence of setting temperature and time on the gel properties of glucono-δ-lactone (GDL)-induced surimi gel. The results showed that the acidification rate increased with the temperature increasing from 30 ℃ to 50 ℃. Consequently, the time for the gel pH to stabilize decreased which induce to the decline of gel strength and the increase of the expressible water content of GDL-induced surimi gel. It is indicated that protein subunits solubilized in various solvents revealed that the formation of GDL-induced surimi gel mainly through hydrophobic interactions and it increased with temperature. The content of total SH increased with temperature indicating the reduction of disulphide bond content. The results of SDS-PAGE revealed that the temperature has little impact on the MHC band intensity. The microstructure is compact and fine through the SEM under the condition of 30 ℃, 3.5 h.

surimi; glucono-δ-lactone; setting conditions; gel properties

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.004

國家大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術體系項目(編號：CARS-46)；“江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心”項目

吳雪微，女，江南大學在讀碩士研究生。

姜啟興(1977—)，男，江南大學副教授，博士。 E-mail: qixing@163.com

2016-10-13