徐菲陳東胡繼良

人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖中NOTCH信號(hào)的調(diào)控作用*

徐菲①陳東①胡繼良①

目的：探討人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖中NOTCH信號(hào)的調(diào)控作用。方法：采用免疫磁珠法從人腦膠質(zhì)瘤組織及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中提取、分離人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用熒光定量PCR、免疫組化等方法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，觀察人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖中NOTCH信號(hào)通路的調(diào)控作用。結(jié)果：正常腦組織的NOTCH-1蛋白累積光密度值為（294.9±29.5），低度及高度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白累積光密度值分別為（5046.0±120.9）和（11 026.2±169.1）。低度及高度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白表達(dá)水平較正常腦組織患者明顯提高，且高度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白表達(dá)水平較低度惡性膠質(zhì)瘤患者明顯提高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，NOTCH-1、HES-1及CBF-1基因的表達(dá)水平較CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞明顯提高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：NOTCH-1基因在人腦膠質(zhì)瘤中呈高水平表達(dá)；在人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過(guò)程中，NOTCH-1、CBF-1和HES-1等關(guān)鍵基因呈高表達(dá)，NOTCH信號(hào)通路在人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過(guò)程中起著重要調(diào)控作用，值得深入研究。

人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞； 增殖； NOTCH信號(hào)； 調(diào)控作用

First-author’s address：The People’s Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518020，China

NOTCH基因從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物，在多個(gè)物種中均有表達(dá)，其家族成員的結(jié)構(gòu)具有高度保守性，在細(xì)胞增殖分化及發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［1-2］。目前研究表明，NOTCH-1信號(hào)通路在神經(jīng)前體細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化中具有重要作用［3-4］。目前對(duì)于NOTCH信號(hào)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖的調(diào)控研究較少，所以進(jìn)行該研究具有重要價(jià)值［5］。本研究采用免疫磁珠法從人腦膠質(zhì)瘤組織及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中提取、分離人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用熒光定量PCR、免疫組化等方法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，觀察人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖中NOTCH信號(hào)通路的調(diào)控作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 此次研究所采用的人腦膠質(zhì)瘤新鮮標(biāo)本取自2011年4月-2014年4月于本院進(jìn)行人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)的30例患者，其中14例為低度惡性膠質(zhì)瘤，16例為高度惡性膠質(zhì)瘤。另?yè)裢谶M(jìn)行顱內(nèi)減壓術(shù)20例患者的正常新鮮腦組織作為對(duì)照組。本研究采用的U251惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和CHG-5膠質(zhì)瘤細(xì)胞株由本院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：膠質(zhì)瘤新鮮標(biāo)本及U251、CHG-5細(xì)胞株的分選采用免疫磁珠法。將分離出的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，控制每瓶細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分別加入含血清培養(yǎng)基及無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37 ℃、二氧化碳濃度為5%，濕度為95%。每隔2天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液處理，培養(yǎng)約5 d左右進(jìn)行傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［6-8］。（2）NOTCH-1信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)：采用Trizol法提取膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的總RNA，采用熒光定量PCR法對(duì)NOTCH-1信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的基因包括NOTCH-1、CBF-1、HES-1，內(nèi)參基因選擇GAPDH，實(shí)驗(yàn)所采用的引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，SYBR green由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由熒光定量PCR儀自帶軟件進(jìn)行處理分析［9］。（3）NOTCH-1蛋白的表達(dá)檢測(cè)：將人腦膠質(zhì)瘤組織和正常人腦組織標(biāo)本送病理科做冰凍切片，然后對(duì)NOTCH-1蛋白進(jìn)行免疫組化染色。免疫組化染色采用SABC法，免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。染色完成后對(duì)切片進(jìn)行顯微鏡鏡檢，棕黃色為陽(yáng)性區(qū)域。采用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)定各切片陽(yáng)性區(qū)域的累積光密度值（IOD）。

1.3觀察指標(biāo) 觀察人腦膠質(zhì)瘤組織和正常人腦組織中的NOTCH-1蛋白表達(dá)情況和人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過(guò)程中NOTCH-1信號(hào)通路的相關(guān)基因表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三組腦組織切片蛋白表達(dá)情況比較 在對(duì)三組腦組織切片的NOTCH-1蛋白陽(yáng)性區(qū)域分析后得出：正常腦組織的NOTCH-1蛋白累積光密度值為（294.9±29.5），低度及高度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白累積光密度值分別為（5046.0±120.9）和（11 026.2±169.1）。低度及高度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白表達(dá)水平較正常腦組織患者明顯提高，且高度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白表達(dá)水平較低度惡性膠質(zhì)瘤患者明顯提高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過(guò)程中NOTCH-1信號(hào)通路的相關(guān)基因表達(dá)情況分析 收集2株膠質(zhì)瘤細(xì)胞，將從同株膠質(zhì)瘤中分離得到的CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為參考對(duì)照，其中1株來(lái)源于病理分型為星型細(xì)胞瘤Ⅱ級(jí)的患者，另1株來(lái)源于病理分型為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Ⅳ級(jí)的患者，另外加上U251細(xì)胞株和CHG-5細(xì)胞株，對(duì)4株細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，NOTCH-1、HES-1及CBF-1基因的表達(dá)水平較CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞明顯（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1　人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過(guò)程中NOTCH-1通路的相關(guān)基因表達(dá)情況（±s）

*與CD133-比較，P＜0.05

HES- 1類(lèi)別　NOTCH- 1 CBF-1 CD133-　CD133+　CD133-　CD133+　CD133-　CD133+星型細(xì)胞瘤Ⅱ級(jí)　1.0　5.6±1.2*　1.0　6.1±0.9*　1.0　7.3±1.6*多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Ⅳ級(jí)　1.0　5.9±1.3*　1.0　4.9±1.1*　1.0　4.6±0.8*U251細(xì)胞株　1.0　7.6±1.5*　1.0　3.9±0.6*　1.0　4.2±0.9*CHG-5細(xì)胞株　1.0　10.5±1.9*　1.0　4.6±1.0*　1.0　5.0±1.1*

3　討論

在臨床上，膠質(zhì)瘤是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤［10］。近年來(lái)，膠質(zhì)瘤患者的發(fā)病人數(shù)不斷增加，且發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)。人腦膠質(zhì)瘤對(duì)于患者而言具有巨大危害，不僅給患者帶來(lái)了巨大痛苦，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響，而且該病的治療效果較差，患者的生存期限較短，僅僅有不到5%的腦膠質(zhì)瘤患者的生存期可達(dá)5年［11-12］。由此可見(jiàn)看出，人腦膠質(zhì)瘤對(duì)患者的生命健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅［13］。目前，臨床上對(duì)于膠質(zhì)瘤患者常采用放療、化療、外科手術(shù)治療及免疫抑制治療等，然而治療效果常不理想。所以，探討人腦膠質(zhì)瘤增殖的信號(hào)通路研究可進(jìn)一步弄清該病的發(fā)病機(jī)制，可為人腦膠質(zhì)瘤臨床治療新靶點(diǎn)的選取提供有力參考，對(duì)提高該病的治療水平具有重要意義。

NOTCH基因首次發(fā)現(xiàn)于1919年，該基因若發(fā)生突變可導(dǎo)致果蠅出現(xiàn)殘翅。隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，NOTCH基因被發(fā)現(xiàn)存在于無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物的多個(gè)物種中，并且NOTCH基因家族的成員具有高度保守性。Artavanis-tsakonas等［7］研究表明，NOTCH-1基因不僅在正常細(xì)胞的增殖發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，而且與一些腦部腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有著密切聯(lián)系。除此以外，F(xiàn)AN等［8］研究發(fā)現(xiàn)HES-1為NOTCH信號(hào)通路的重要基因之一，且該基因在髄母細(xì)胞瘤患者中的表達(dá)水平與患者的治療及預(yù)后密切相關(guān)［14］。目前，NOTCH信號(hào)通路與膠質(zhì)瘤發(fā)病的研究是一個(gè)醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)，探討NOTCH信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，可進(jìn)一步明確調(diào)控機(jī)制，可為靶向治療和基因治療等新型治療手段提供理論依據(jù)［15-16］。本研究選取了低度、高度惡性膠質(zhì)瘤患者及正常人腦組織作為標(biāo)本，進(jìn)行NOTCH-1蛋白免疫組化分析，結(jié)果顯示：低度及高度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白表達(dá)水平較正常腦組織患者明顯提高，且高度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白表達(dá)水平較低度惡性膠質(zhì)瘤患者明顯提高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。另外，本研究收集了2株膠質(zhì)瘤細(xì)胞及U251細(xì)胞株及CHG-5細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，對(duì)NOTCH-1信號(hào)通路的關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：在CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，NOTCH-1、HES-1及CBF-1基因的表達(dá)水平較CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞明顯提高（P＜0.05）。從膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中分離出來(lái)的CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞僅僅占很小一部分，這一小部分CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有分化及連續(xù)傳代功能，為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。上述研究結(jié)果表明，NOTCH信號(hào)通路中的關(guān)鍵性蛋白NOTCH-1在正常腦組織切片及CD133-細(xì)胞株中僅有少量表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤切片及CD133+細(xì)胞株中表達(dá)顯著上調(diào)，并且高度惡性膠質(zhì)瘤的表達(dá)水平高于低度膠質(zhì)瘤［17］。HES-1和CBF-1基因與NOTCH-1信號(hào)通路密切相關(guān)，在CD133+細(xì)胞株中，HES-1和CBF-1基因的表達(dá)水平較CD133-細(xì)胞株的表達(dá)明細(xì)升高，這提示NOTCH-1信號(hào)通路參與了腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖，對(duì)其增殖起著重要的調(diào)控作用［18-20］。

綜上所述，本研究探討了人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖中NOTCH信號(hào)的調(diào)控作用，為人腦膠質(zhì)瘤的治療提供了一定參考。

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NOTCH Signal Regulating Role in Human Brain Glioma Stem Cells Proliferation

XU Fei，CHEN Dong，HU J i-liang.//Medical Innovation of China，2016，13（21）：018-021

Objective：To study the NOTCH signal regulating role in human b rain glioma stem cell proliferation.Method：Using magnetic beads immune method extracted from the organization for human brain glioma and glioma cell line，separated the brain glioma stem cells，cells for in vitro culture，used the fluorescent quantitative PCR and immunohistochemical method to detect the related indicators，observed the NOTCH signal pathway in the brain glioma stem cells proliferation regulation function.Result：Patients with normal brain tissue protein accumulation NOTCH-1 optical density value was（294.9±29.5），low and highly malignant gliomas NOTCH-1 protein accumulation optical density value was respectively（5046.0±120.9） and（11 026.2±169.1）. Low and highly malignant gliomas NOTCH-1 protein expression levels significantly higher than patients with normal brain tissue，and highly malignant gliomas NOTCH-1 protein expression levels was significantly increased than low grade gliomas（P＜0.05）.In CD133+glioma cells，NOTCH-1，CBF-1 and HES-1 gene expression level of CD133 glioma cells increased significantly（P＜0.05）.Conclusion：The NOTCH-1 gene is the high level expression in human brain gliomas.In the process of human glioma stem cells proliferation，NOTCH，CBF-1 and HES-1 key genes has high expression，such as NOTCH signaling pathways in the brain glioma stem cells proliferation plays an important regulatory role in the process，it is worth of further study.

Human brain glioma stem cells； Proliferation； NOTCH signal； Regulation effect

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.21.005

深圳市知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃-基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（20140318221052）
①?gòu)V東省深圳市人民醫(yī)院 廣東 深圳 518020

胡繼良

2016-05-04） （本文編輯：李穎）