李 寧 蘇 芳 寧海丹 彭 興 堯良清 黃玉葵 范余娟

(1 廣西南寧市婦幼保健院婦科，南寧市 530001，E-mail：lining0771@163.com；2 廣西南寧市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，南寧市 530003；3 廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院病理科，南寧市 530001；4 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧市 530021；5 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海市 200011；6 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，南寧市 530021)

論著·基礎(chǔ)研究

沙利度胺聯(lián)合達(dá)那唑?qū)ψ訉m內(nèi)膜異位癥裸鼠異位組織血管生成及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響▲

李 寧1蘇 芳2寧海丹3彭 興4堯良清5黃玉葵1范余娟6

(1 廣西南寧市婦幼保健院婦科，南寧市 530001，E-mail：lining0771@163.com；2 廣西南寧市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，南寧市 530003；3 廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院病理科，南寧市 530001；4 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧市 530021；5 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海市 200011；6 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，南寧市 530021)

目的 探討沙利度胺聯(lián)合達(dá)那唑?qū)ψ訉m內(nèi)膜異位癥裸鼠異位組織血管生成及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響。方法 選擇40只成功建立子宮內(nèi)膜異位癥模型的裸鼠， 隨機(jī)分為模型對(duì)照、沙利度胺組、達(dá)那唑組及聯(lián)合用藥組，每組10只，分別給予生理鹽水、沙利度胺30 mg/(kg·d)、達(dá)那唑1.0 mg/(kg·d)、沙利度胺30 mg/(kg·d)聯(lián)合達(dá)那唑1.0 mg/(kg·d)腹腔注射，給藥4周后處死，通過(guò)Ⅷ因子標(biāo)記異位子宮內(nèi)膜血管，檢測(cè)異位內(nèi)膜組織中微血管密度(MVD)，鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶法測(cè)定異位內(nèi)膜VEGF蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 對(duì)照組、達(dá)那唑組、沙利度胺組和聯(lián)合用藥組的MVD依次降低(P<0.05)，分別為(21.3±1.5)個(gè)、(16±3.4)個(gè)、(12.2±1.1)個(gè)和(6.8±1.1)個(gè)。對(duì)照組、達(dá)那唑組、沙利度胺組和聯(lián)合用藥組VEGF蛋白的表達(dá)水平也依次降低(P<0.05)。結(jié)論 沙利度胺和達(dá)那唑可抑制裸鼠異位內(nèi)膜的 MVD以及VEGF的表達(dá)，從而抑制異位內(nèi)膜組織的血管生成，兩者合用時(shí)作用更明顯。

子宮內(nèi)膜異位癥；沙利度胺；達(dá)那唑；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；微血管密度；裸鼠

子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴(lài)性的良性的疾病，以子宮內(nèi)膜組織在子宮外的存在和生長(zhǎng)為特點(diǎn)，是最常見(jiàn)的一種良性婦科疾病[1]。這種疾病與不孕癥以及嚴(yán)重的、喪失功能的疼痛癥狀有關(guān)，如慢性骨盆疼痛、痛經(jīng)、性交困難[2-3]。 據(jù)估計(jì)，子宮內(nèi)膜異位癥可對(duì)10%的育齡女性產(chǎn)生影響，而由于其臨床表現(xiàn)存在變異而往往不易診斷，真正的患病率有可能更高[4]。子宮內(nèi)膜異位癥常常對(duì)患者的工作、社會(huì)關(guān)系及婚姻生活產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[5]。研究表明沙利度胺具有廣泛免疫調(diào)節(jié)[6]、抗血管生成作用[7]以及抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析沙利度胺、達(dá)那唑及兩者聯(lián)合用藥對(duì)裸鼠子宮內(nèi)膜異位組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)以及組織中微血管密度(microvessel density，MVD)的影響， 探討沙利度胺聯(lián)合達(dá)那唑?qū)ψ訉m內(nèi)膜異位癥的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 56只清潔級(jí)性成熟未交配的雌性BALB/c裸鼠， 8～10周齡，體重(20±3)g(購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SXCK滬2012-0002)。裸鼠喂養(yǎng)于溫、濕度控制的環(huán)境中，研究期間裸鼠可自由進(jìn)食和飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 沙利度胺片(江蘇常州制藥廠，規(guī)格：25 mg， 批號(hào)：H32026130)，達(dá)那唑膠囊(廣州柏賽羅藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.2 g， 批號(hào)：H20023742)，青霉素鈉注射劑(哈藥集團(tuán)制藥總廠，規(guī)格：80萬(wàn)單位，批號(hào)： H20023737)，硫酸慶大霉素注射液(國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，規(guī)格：2 ml：8 IU，批號(hào)： H41020609)，己烯雌酚注射液(廣州白云山明興制藥有限公司，規(guī)格：1 ml：0.5 mg，批號(hào)： H44020233)。2%戊巴比妥鈉由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。 抗鼠Ⅷ因子抗體(批號(hào)：130506039A)、抗鼠VEGF 抗體(批號(hào)：130203059A)、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)試劑盒(批號(hào)：130420425H)、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑(批號(hào)： 13003171)均購(gòu)于上海撫生實(shí)業(yè)公司。BI2000 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建模方法：術(shù)前1 d給予裸鼠己烯雌酚(0.1 mg/kg)皮下注射，使手術(shù)時(shí)裸鼠均處于發(fā)情期。在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行手術(shù)操作，術(shù)前用2%戊巴比妥鈉腹腔注射對(duì)裸鼠進(jìn)行麻醉，劑量為20 mg/kg。腹部備皮，消毒，在裸鼠臍與尿道口連線(xiàn)正中做一縱形切口，逐層分離皮膚、肌肉及腹膜。游離子宮體，切取一側(cè)子宮角，長(zhǎng)約1.0 cm，立即放入室溫條件下的無(wú)菌生理鹽水中，修剪子宮漿膜，將游離組織剪成3塊(均包括子宮肌層)，大小均為5 m×5 m×5 m，1塊送病理檢驗(yàn)，明確為子宮內(nèi)膜組織，另外2塊將其內(nèi)膜面緊貼腹壁，用000快薇喬線(xiàn)縫于左側(cè)腹壁。術(shù)后腹腔留置青霉素鈉生理鹽水溶液預(yù)防感染，1號(hào)絲線(xiàn)分層縫合腹部切口。待其自然蘇醒后每只裸鼠每天皮下注射慶大霉素0.1 ml，共3 d。實(shí)驗(yàn)裸鼠分籠單放，正常清潔飼養(yǎng)。分別于術(shù)后1周、2周，采用隨機(jī)數(shù)字表法各選取2只裸鼠并處死，肉眼觀察子宮內(nèi)膜異位移植物生長(zhǎng)情況，若形成暗紅色或紫藍(lán)色結(jié)節(jié)，可判斷為移植組織已在裸鼠盆腔內(nèi)生長(zhǎng)。觀察表明，子宮內(nèi)膜異位移植物能在處死的裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)，遂于術(shù)后3周采用隨機(jī)數(shù)字表法在剩余裸鼠中選取2只，開(kāi)腹取其腹壁組織做成病理切片，行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜異位組織生長(zhǎng)情況，證實(shí)有子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)生長(zhǎng)，判斷建模成功。

1.3.2 分組及給藥方法：采用抽簽法隨機(jī)選取40只建模成功的裸鼠并分為模型對(duì)照組、 沙利度胺組、達(dá)那唑組及聯(lián)合用藥組4組，每組10只。沙利度胺和達(dá)那唑使用時(shí)溶解于生理鹽水中。達(dá)那唑組給予腹腔注射達(dá)那唑1.0 mg/(kg·d)，沙利度胺組給予腹腔注射沙利度胺 30 mg/(kg·d)， 聯(lián)合用藥組給予腹腔注射沙利度胺 30 mg/(kg/·d)和達(dá)那唑1.0 mg/(kg/·d)，模型對(duì)照組每日腹腔注射生理鹽水2 ml，均1次/d，連續(xù)4周。裸鼠給藥劑量根據(jù)每天每0.02 kg裸鼠給藥劑量為每天每60 kg成人給藥劑量的12倍換算得出。于停藥24 h后麻醉動(dòng)物，剖腹分離周?chē)尺B組織，游離取出異位內(nèi)膜組織，4%甲醛溶液固定所有標(biāo)本12 h。常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片(4 μm)，制病理片。

1.3.3 MVD的測(cè)定：標(biāo)本以4%多聚甲醛固定，取材，切片。標(biāo)本加入緩沖液，經(jīng)羊血清去電荷和H2O2去過(guò)氧化物酶，加入一抗，抗鼠Ⅷ因子抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。在低倍鏡視野下選取微血管密集度區(qū)，根據(jù) Weidner[9]采用的方法計(jì)微血管數(shù)。1.3.4 VEGF表達(dá)的測(cè)定：采用SP法檢測(cè)VEGF在異位內(nèi)膜組織的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)按照SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。免疫組化結(jié)果用BI-2000圖像系統(tǒng)分析，切片置于10×40倍鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野， 計(jì)算陽(yáng)性單位(positive unit，PU)作為量化指標(biāo)。 PU=│Gα-GA│/[(1-AAα)/Gmax]×100，其中Gα 為陽(yáng)性產(chǎn)物的灰度，GA為測(cè)試區(qū)域A范圍內(nèi)的平均灰度值，AAα為陽(yáng)性產(chǎn)物在A測(cè)試區(qū)域中的面積密度，Gmax為圖像分析儀設(shè)定的最大灰度值。用PU反映免疫組化染色強(qiáng)度，PU值越大則表示陽(yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)，PU值越小則陽(yáng)性反應(yīng)越弱。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組MVD比較 裸鼠模型異位內(nèi)膜組織Ⅷ因子染色陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，陽(yáng)性染色細(xì)胞主要為血管內(nèi)皮細(xì)胞；鏡下微血管有的可見(jiàn)管腔，有的僅為內(nèi)皮細(xì)胞簇或單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，見(jiàn)圖1。每高倍視野下，對(duì)照組、達(dá)那唑組、沙利度胺組和聯(lián)合用藥組的MVD分別為(21.3±1.5)個(gè)、(16.0±3.4)個(gè)、(12.2±1.1)個(gè)和(6.8±1.1) 個(gè)，4組MVD比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=200.603，P<0.001)，其中對(duì)照組、達(dá)那唑組、沙利度胺組、聯(lián)合用藥組的MVD依次降低(P<0.05)。

A 對(duì)照組 B 達(dá)那唑組 C 沙利度胺組 D 聯(lián)合用藥組

圖1 采用Ⅷ因子標(biāo)記的各組裸鼠子宮異位內(nèi)膜組織MVD(DAB染色，×400)

2.2 各組VEGF表達(dá)比較 VEGF主要定存在于周?chē)g質(zhì)細(xì)胞中，見(jiàn)圖2。BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析，對(duì)照組、達(dá)那唑組、沙利度胺組和聯(lián)合用藥組的PU分別為(35±3)、(28±2)、(21±1)和(9±2)。4組PU比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=185.091，P<0.001)，其中對(duì)照組、達(dá)那唑組、沙利度胺組、聯(lián)合用藥組的PU依次降低(P<0.05)。

A 對(duì)照組 B 達(dá)那唑組 C 沙利度胺組 D 聯(lián)合用藥組

圖2 各組裸鼠子宮異位內(nèi)膜組織VEGF 的表達(dá)情況(DAB染色，×400)

3 討 論

沙利度胺又名酞胺哌啶酮，1953年在瑞士Ciba藥廠首次合成，1957起在歐洲廣泛用于治療妊娠嘔吐，1961年發(fā)現(xiàn)其與新生兒致畸有關(guān)而被禁用，這就是著名的“反應(yīng)停事件”。 20世紀(jì)90年代，因沙利度胺具有抑制腫瘤壞死因子及抗血管生成的作用，而再次被重視，分別于1998年及2006 年被美國(guó)食品及藥物管理局批準(zhǔn)用于治療麻風(fēng)病和多發(fā)性骨髓瘤，再次進(jìn)入人們的視線(xiàn)[10]。

在本研究中，我們通過(guò)裸鼠自體子宮內(nèi)膜移植的方法，成功建立裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型。我們發(fā)現(xiàn)裸鼠子宮內(nèi)膜能夠在腹壁上生長(zhǎng)，形成異位內(nèi)膜，在內(nèi)膜移植后2周，異位內(nèi)膜在裸鼠腹壁存活，并形成暗紅色結(jié)節(jié)及濾泡結(jié)構(gòu)。在內(nèi)膜移植后3周，病理檢查證實(shí)裸鼠腹壁處移植物為異位內(nèi)膜，提示移植成功。

目前子宮內(nèi)膜異位癥的藥物治療主要采用激素抑制治療，然而效果不盡如人意，患者常受停藥后臨床癥狀反復(fù)的困擾。這一現(xiàn)象促使我們進(jìn)一步研究其他的治療途徑。抗血管生成、抑制VEGF蛋白分泌是有別于激素抑制治療的全新的治療思路，具有廣闊的應(yīng)用前景。在本研究中，聯(lián)合用藥組的MVD及VEGF蛋白的表達(dá)均顯著低于沙利度胺組、達(dá)那唑組和對(duì)照組(P<0.05)，提示兩者聯(lián)合用藥能更快地促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠間質(zhì)細(xì)胞的萎縮壞死，增強(qiáng)子宮內(nèi)膜異位癥血管生成的抑制，這一結(jié)果與我們的預(yù)期一致。這不僅與沙利度胺的抗血管生成作用有關(guān)，也可能與沙利度胺抑制子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞分泌VEGF蛋白有關(guān)。Scarpellini等[11]報(bào)告沙利度胺治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效能維持較長(zhǎng)時(shí)間。沙利度胺抗血管生成的作用取決于其對(duì)VEGF及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的影響。有研究證實(shí)，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)的環(huán)境下，沙利度胺可以抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞VEGF的分泌[12]。此外，沙利度胺不但可以降低骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生VEGF的水平，而且通過(guò)抑制VEGF，還可抑制細(xì)胞遷移、毛細(xì)血管生成及血管形成的能力[13]。達(dá)那唑的作用機(jī)制主要體現(xiàn)在抑制促性腺激素及卵巢分泌的甾體激素，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞的萎縮。

總之，為減輕子宮內(nèi)膜異位癥患者的臨床癥狀、降低復(fù)發(fā)率，在臨床中可以應(yīng)用沙利度胺聯(lián)合達(dá)那唑的治療方法，但其治療方案及治療劑量尚待進(jìn)一步在臨床應(yīng)用中探索。同時(shí)，由于沙利度胺具有可預(yù)測(cè)的致畸性，故在使用前需告知患者必須避孕。

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Effect of thalidomide combined with danazol on angiogenesis and vascular endothelial growth factor of ectopic tissues in nude mice with endometriosis

LINing1,SUFang2,NINGHai-dan3,PENGXing4,YAOLiang-qing5,HUANGYu-kui1,FANYu-Juan6

(1DepartmentofGynaecology,theMaternalandChildHealthHospitalofNanning,Nanning530001,China;2DepartmentofGynaecology,theThirdPeople′sHospitalofNanning,Nanning530003,China;3DepartmentofPathology,MinzuHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530001,China;4SchoolofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;5DepartmentofGynaecology,theObstetricsandGynecologyHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200011,China;6DepartmentofGynaecology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effect of thalidomide combined with danazol on angiogenesis and vascular endothelial growth factor(VEGF) of ectopic tissues in nude mice with endometriosis.Methods Forty nude rats with successful modeling of endometriosis were randomly divided into control group,thalidomide group,danazol group and combined administration group,with 10 mice in each group.The control group,thalidomide group,danazol group and combined administration group were administered normal saline,halidomide[30 mg/(kg·d)],danazol[1.0 mg/(kg·d)] and halidomide[30 mg/(kg·d)] combined with danazol[1.0 mg/(kg·d)]by intraperitoneal injection respectively.All rats were killed after four weeks of administration.The ectopic endometrial vessels were marked by Ⅷ factor,and then microvessel density(MVD) of ectopic endometrium tissues was detected.The expression of ectopic endometrial VEGF was determined by streptavidin-peroxidase assay.Results MVDs decreased in the order of control group(21.3±1.5),danazol group(16±3.4),thalidomide group(12.2±1.1) and combined administration group(6.8±1.1)(P<0.05).The expression levels of VEGF protein decreased in the order of control group,danazol group,thalidomide group and combined administration group(P<0.05).Conclusion Thalidomide and danazol can inhibit the MVD and the VEGF expression of ectopic endometrium in the nude mice,thus can inhibit the angiogenesis in ectopic endometrium.Thalidomide combined with danazol can obtain more obvious inhibitory effect. 【Key words】 Endometriosis,Thalidomide,Danazol,Vascular endothelial growth factor,Microvessel density,Nude mice

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃(桂科攻12300016)；廣西南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃(20133174)

李寧(1978～)，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：子宮內(nèi)膜異位癥的基礎(chǔ)及臨床。

寧海丹(1978～)，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：婦科病理，E-mail：lovelygardenbaby@163.com。

R 711.71

A

0253-4304(2016)09-1207-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.05

2016-04-19

2016-06-29)