孫朝文 張廣鈺 趙 辰 成懷福 鐘 漓 戴 凌

(1 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，桂林市 541001；2 桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，桂林市 541004，E-mail：sunchaowen20081010@163.com)

論著·基礎(chǔ)研究

凋亡大腸癌CT26細(xì)胞對小鼠T淋巴細(xì)胞增殖及活性的影響▲

孫朝文1，2張廣鈺1趙 辰1，2成懷福1，2鐘 漓1戴 凌1

(1 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，桂林市 541001；2 桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，桂林市 541004，E-mail：sunchaowen20081010@163.com)

目的 探討凋亡大腸癌CT26細(xì)胞對小鼠T淋巴細(xì)胞增殖及活性的影響。方法 (1)取對數(shù)生長期大腸癌CT26細(xì)胞制備凋亡腫瘤細(xì)胞及壞死腫瘤細(xì)胞，取Balb/c小鼠脾臟分離T淋巴細(xì)胞，并制備細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。(2)將凋亡腫瘤細(xì)胞、壞死腫瘤細(xì)胞、正常腫瘤細(xì)胞分別與小鼠CTL共同培養(yǎng)(分別為凋亡腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對照組)，測定CTL的活性及增殖情況。(3)將小鼠T淋巴細(xì)胞分為對照組、刀豆蛋白A(ConA)組、凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組、壞死腫瘤細(xì)胞+ConA組、活腫瘤細(xì)胞+ConA組，經(jīng)相應(yīng)處理后測定各組T淋巴細(xì)胞的活性及增殖情況。(4)選取30只Balb/c小鼠分為凋亡腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對照組各10只，分別將凋亡、壞死、對數(shù)生長期CT26細(xì)胞通過皮下及靜脈輸注小鼠，檢測各組小鼠血清調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的表達(dá)情況。(5)另取30只小鼠，按方法(4)分組及處理后，測定各組小鼠血清可溶性Fas(sFas)、白細(xì)胞介素(IL)-12、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的表達(dá)水平。結(jié)果 凋亡腫瘤細(xì)胞組中CTL的活性、A450值均低于其他兩組(P<0.05)。凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組的T淋巴細(xì)胞CD69、CD25、CD71的表達(dá)率以及G2、G3及G4期的T淋巴細(xì)胞數(shù)量均低于ConA組、活腫瘤細(xì)胞+ConA及壞死腫瘤細(xì)胞+ConA(P<0.05)。凋亡腫瘤細(xì)胞組Treg的表達(dá)水平、sFas相對表達(dá)量低于腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組(P<0.05)。凋亡腫瘤細(xì)胞組IL-10、TGF-β表達(dá)水平高于其他兩組(P<0.05)，而 IL-12表達(dá)水平均低于其他兩組(P<0.05)，IL-4表達(dá)水平則高于腫瘤細(xì)胞對照組(P<0.05)。結(jié)論 凋亡小鼠大腸癌CT26細(xì)胞能夠抑制小鼠T淋巴細(xì)胞增殖及活性，影響大腸癌小鼠正常免疫功能。

大腸癌；CT26細(xì)胞；T淋巴細(xì)胞；活性；增殖；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；可溶性Fas；小鼠

大腸癌又稱為結(jié)直腸癌，是最為常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第3位[1]，近年來我國大腸癌的發(fā)病率持續(xù)上升，現(xiàn)已分別位居男性惡性腫瘤發(fā)病第5位和女性惡性腫瘤發(fā)病第3位。近年來，雖然在大腸癌治療方面取得巨大進(jìn)步，然而大腸癌仍是全球癌癥死因的主要原因之一[2]。目前認(rèn)為大腸癌發(fā)生的主要原因是遺傳因素和環(huán)境因素[3]，大腸癌患者機(jī)體的免疫功能改變主要包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)數(shù)量增高、腫瘤應(yīng)答的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T cell，CTL)活性降低及對腫瘤細(xì)胞的免疫耐受，機(jī)體免疫監(jiān)視功能的降低與喪失被認(rèn)為是大腸癌發(fā)生的主要表現(xiàn)。近年來，負(fù)載腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)疫苗被應(yīng)用于治療腫瘤，從理論上這一方法可以誘導(dǎo)特異性CTL、增強(qiáng)荷瘤機(jī)體的免疫功能，但迄今為止，機(jī)體對腫瘤的免疫耐受仍然是目前腫瘤免疫治療需要克服的主要障礙[4-7]。盡管腫瘤細(xì)胞表達(dá)了豐富的“自己”和“異己”抗原，可是表達(dá)的這些抗原并沒有引起排斥腫瘤的免疫反應(yīng)[8-9]。目前凋亡腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致機(jī)體對腫瘤免疫耐受的機(jī)制也未明確，因此，本研究分析凋亡大腸癌CT26細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠對T淋巴細(xì)胞增殖及活性的影響，以期為腫瘤免疫治療、建立新的思維方法發(fā)展新的腫瘤治療途徑提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物 放線菌素D(美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：1102C035)；6%可溶性淀粉肉湯：在100 ml肉湯培養(yǎng)基[北京海淀中海動物保健科技公司，090216(PT-1)]中加入可溶性淀粉6 g，經(jīng)煮沸滅菌30 min，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物 清潔級6～8周齡Balb/c小鼠70只，雄性，體重(240±30)g，動物許可證號：SCXK(湘)2014-0015，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供。所有小鼠均按無特定病原體級飼養(yǎng)，且所有實驗均通過動物倫理委員會認(rèn)證。

1.3 細(xì)胞株及主要試劑 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。膜聯(lián)蛋白 V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司，生產(chǎn)批號：20140331)；胰酶(美國Gibco公司，生產(chǎn)批號：1220087)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：141215)；刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A；美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：11028-71-0)；熒光染料羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA-SE；美國Molecular Probes公司，生產(chǎn)批號：11348)等；酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：130422)等。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司，型號：311)，雙人超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號：BCM-1000)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus，型號：CKX-31)，離心機(jī)(德國Eppendorf，型號：Centrifuge 5415R)，移液槍(芬蘭百得公司，型號：Genex，規(guī)格：20～200 μl)，BL-420生物機(jī)能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，型號：BL-420S)等。

1.5 方法

1.5.1 CT26細(xì)胞的培養(yǎng)及凋亡、壞死腫瘤細(xì)胞的制備：將CT26細(xì)胞用含10%胎牛血清(美國Gibco公司，生產(chǎn)批號：14000-044)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司，生產(chǎn)批號：120917)培養(yǎng)于5% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。通過取對數(shù)生長期CT26細(xì)胞接種于6孔板中，調(diào)整密度為1×106細(xì)胞/孔。待細(xì)胞貼壁后加入含放線菌素D(200 ng/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h誘導(dǎo)凋亡，用胰酶消化，收集懸液并依次加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的碘化丙啶(propidium iodide，PI；美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：20120811)，混勻后室溫避光孵育15 min后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，富集，按不同濃度稀釋備用。另取對數(shù)生長期CT26細(xì)胞用加熱法(腫瘤細(xì)胞株56℃水浴1 h)制備壞死腫瘤細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞的壞死形態(tài)改變并確定，臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞死亡率，按不同濃度稀釋(取0.5 ml臺盼藍(lán)溶液、0.3 ml Hanks或者PBS和0.2 ml細(xì)胞懸液，充分混勻，或者0.4%的臺盼藍(lán)與制好的細(xì)胞懸液等體積混合)，然后將混合液放置5～15 min備用。

1.5.2 T細(xì)胞亞群、CTL的制備及CTL分組：適應(yīng)性喂養(yǎng)5～6 d后，取6～8周齡雄性Balb/c小鼠10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5～6 d后再正常喂養(yǎng)3 d后，脫頸椎處死，取脾臟，去被膜，于200目不銹鋼網(wǎng)過濾，800 r/min離心4 min，收集待分離細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，采用免疫磁珠分選法分離T細(xì)胞亞群，通過流式細(xì)胞儀鑒定其表型，分選出的陽性細(xì)胞用熒光標(biāo)記的相應(yīng)抗體通過熒光激活細(xì)胞分離法鑒定純度。將T淋巴細(xì)胞與凋亡腫瘤細(xì)胞按25 ∶1比例混勻，靜置于培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，4 d后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。第2周起，每周加比例為10 ∶1的凋亡細(xì)胞1次，共3次。其中在第2次的第3天加入白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2(終濃度20 U/ ml)，并每隔3～4 d更換1次培養(yǎng)基。在第2次結(jié)束后，1 500 r/min離心15 min，收集細(xì)胞，即特異性CTL，計數(shù)、調(diào)整至合適濃度。將小鼠CTL分別經(jīng)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞處理后分為凋亡腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對照組3個亞組。(1)凋亡腫瘤細(xì)胞組：先將CTL與凋亡腫瘤細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板內(nèi)共孵育2 h，后以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)加入凋亡腫瘤細(xì)胞繼續(xù)孵育至4 h。(2)壞死腫瘤細(xì)胞組：先將CTL與壞死腫瘤細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板內(nèi)共孵育2 h，后以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)加入壞死腫瘤細(xì)胞繼續(xù)孵育至4 h。(3)腫瘤細(xì)胞對照組：CTL與正常腫瘤細(xì)胞以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)在96孔培養(yǎng)板內(nèi)孵育至4 h。

1.5.3 免疫細(xì)胞活性檢測：采用51 Cr 釋放實驗測定3組CTL免疫細(xì)胞活性，其中以相應(yīng)腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞并預(yù)先以Na251CrO4標(biāo)記，CTL細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞。各組同時設(shè)自然釋放對照孔及最大釋放對照孔。分別取每組各孔上清，用γ計數(shù)儀測量放射活性值(單位：cpm)。根據(jù)下式計算51Cr自然釋放率和CTL活性：

1.5.4 免疫細(xì)胞增殖檢測：采用細(xì)胞計數(shù)(cell counting kit-8，CCK-8)法檢測鼠的CTL淋巴細(xì)胞增殖情況。分別將凋亡腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對照組中的CTL與對數(shù)生長期的CT26細(xì)胞按25 ∶1比例混勻鋪96孔板，細(xì)胞重懸成單細(xì)胞懸液，每孔1×103個細(xì)胞，100 μl培基，每組3個復(fù)孔，96孔板邊上一圈的孔不鋪細(xì)胞，只加PBS用于調(diào)零。將培養(yǎng)板靜置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)72 h，終止培養(yǎng)前2 h加入每孔加入10 μl的CCK-8試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：20120503)，繼續(xù)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(A值)，計算細(xì)胞增殖活性。

1.5.5 流式細(xì)胞儀檢測：(1)將小鼠T淋巴細(xì)胞不同亞群用CFDA-SE進(jìn)行染色后，分為對照組、ConA組、凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組、壞死腫瘤細(xì)胞+ConA組、活腫瘤細(xì)胞+ConA組，其中凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組、壞死腫瘤細(xì)胞+ConA組、活腫瘤細(xì)胞+ConA組分別與凋亡、壞死、活腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，然后于ConA組、凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組、壞死腫瘤細(xì)胞+ConA組、活腫瘤細(xì)胞+ConA組培養(yǎng)基中加入Con A繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出，流式細(xì)胞術(shù)檢測不同周期T淋巴細(xì)胞的增殖情況。(2)將小鼠不同亞群T淋巴細(xì)胞分為對照組、ConA組、凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組、壞死腫瘤細(xì)胞+ConA組、活腫瘤細(xì)胞+ConA組，其中凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組、壞死腫瘤細(xì)胞+ConA組、活腫瘤細(xì)胞+ConA組分別與凋亡、壞死、活腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，然后于ConA組、凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組、壞死腫瘤細(xì)胞+ConA組、活腫瘤細(xì)胞+ConA組培養(yǎng)基中加入ConA繼續(xù)培養(yǎng)36 h，分別于12 h和36 h取出，洗滌，去上清，加入相應(yīng)標(biāo)記單克隆抗體(CD69抗體、CD25抗體、CD71抗體)，用流式細(xì)胞儀檢測各組T淋巴細(xì)胞活化標(biāo)記分子CD69、CD25、CD71的表達(dá)。(3)選取6～8周齡雄性Balb/c小鼠30只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為凋亡腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對照組各10只，通過皮下及靜脈分別注射凋亡、壞死、對數(shù)生長期的CT26細(xì)胞，其中皮下注射采用1×107/ml密度、0.05 ml的注射量，靜脈注射采用1～3 ml的注射量輸注入小鼠。采用三色標(biāo)記技術(shù)、流式細(xì)胞儀檢測各組小鼠血清Treg表達(dá)情況。取小鼠外周靜脈血4 ml以乙二胺四乙酸抗凝，充分混勻。取10 ml離心管，將4 ml全血緩慢加在4 ml淋巴細(xì)胞分離液上部，2 000 r/min室溫離心20 min。輕輕吸取中間白色淋巴細(xì)胞層至另一管，2 000 r/min室溫離心5 min，去上清。加2 ml PBS混勻，2 000 r/min室溫離心5 min，去上清。計數(shù)細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml。取200 μl上述單細(xì)胞懸液，在對照管和實驗管中分別加入100 μl，且在兩管中均加入直接熒光標(biāo)記的鼠抗人特異性單抗、直接熒光標(biāo)記的鼠抗人特異性單抗各5 μl，4℃避光孵育30 min。加流式細(xì)胞術(shù)染色緩沖液，混勻。2 000 r/min室溫離心5 min，去上清。對照管和實驗管中各加入2 ml破膜劑。4℃避光孵育45～60 min。2 000 r/min，離心5 min，去上清。對照管和實驗管中各加入2 ml通透緩沖液，2 000 r/min，室溫離心5 min，去上清。重復(fù)通透緩沖液洗細(xì)胞步驟1次。對照管和實驗管各加入100 μl通透緩沖液，充分混勻，再加正常大鼠血清2 μl，4℃避光孵育15 min。無需通透緩沖液清洗細(xì)胞，直接在對照管中加入免疫球蛋白G1-綠膿桿菌外毒素2.5 μl，實驗管中加入Foxp3-綠膿桿菌外毒素20 μl。4℃避光孵育至少30 min。對照管和實驗管中各加入2 ml通透緩沖液，2 000 r/min室溫離心5 min。去上清，重復(fù)通透緩沖液清洗步驟一次。加400 μl通透緩沖液上機(jī)檢測。

1.5.6 ELISA檢測免疫因子表達(dá)水平：選取6～8周齡雄性Balb/c小鼠30只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為凋亡腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對照組各10只，通過皮下及靜脈分別注射凋亡、壞死、對數(shù)生長期的CT26細(xì)胞，其中皮下注射采用1×107/ml密度、0.05 ml的注射量，靜脈注射采用1～3 ml的注射量輸注入小鼠。經(jīng)尾靜脈采血約500 μl，待血自然凝固后，5 963 r/min離心10 min，吸取血清分裝凍存于-70℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。采用ELISA嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行檢測血清可溶性Fas(soluble Fas，sFas)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10、IL-12、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)水平。測定標(biāo)本A450值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，A值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點，通過標(biāo)本的A值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗或q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對小鼠體外CTL活性的影響 3組51Cr自然釋放率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。凋亡腫瘤細(xì)胞組中CTL不同效靶比的CTL活性均低于其他兩組(P<0.05)，見表1。

表1 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對 小鼠體外CTL活性的影響(x±s，%)

注：與壞死腫瘤細(xì)胞組比較， △P<0.05；與腫瘤細(xì)胞對照組比較，#P<0.05。

2.2 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對小鼠體外CTL增殖的影響 凋亡腫瘤細(xì)胞組CTL的A450值低于其他兩組(P<0.05)，見表2。

表2 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞 對小鼠體外CTL增殖的影響(x±s)

注：與壞死腫瘤細(xì)胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細(xì)胞對照組比較，#P<0.05。

2.3 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對ConA誘導(dǎo)的小鼠體外T淋巴細(xì)胞活化的影響 凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組T淋巴細(xì)胞CD69、CD25、CD71的表達(dá)率低于ConA組、活腫瘤細(xì)胞+ConA及壞死腫瘤細(xì)胞+ConA(P<0.05)，高于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對 ConA誘導(dǎo)T細(xì)胞體外活化表達(dá)率的影響(x±s，%)

注：與凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組比較，*P<0.05。

2.4 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對ConA誘導(dǎo)的小鼠體外T淋巴細(xì)胞增殖的影響 CFDA-SE染色后可見凋亡腫瘤細(xì)胞組G2、G3及G4期的T淋巴細(xì)胞數(shù)量均低于ConA組、活腫瘤細(xì)胞+ConA及壞死腫瘤細(xì)胞+ConA(P<0.05)，3組增殖指數(shù)(proliferation index，PI)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖影響(x±s，%)

注：與凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組比較，*P<0.05。

2.5 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對小鼠Treg表達(dá)的影響 凋亡腫瘤細(xì)胞組的Treg的表達(dá)低于腫瘤細(xì)胞組、壞死腫瘤細(xì)胞組(P<0.05)，見表5。

表5 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對小鼠Treg表達(dá)的影響(x±s，%)

注：與凋亡腫瘤細(xì)胞比較，*P<0.05。

2.6 不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對對小鼠血清sFas、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平的影響 凋亡腫瘤細(xì)胞組sFas相對表達(dá)量低于壞死腫瘤細(xì)胞組和正常腫瘤細(xì)胞細(xì)胞(P<0.05)，而壞死腫瘤組sFas相對表達(dá)量則高于腫瘤細(xì)胞對照組(P<0.05)。凋亡腫瘤細(xì)胞組抗炎因子IL-10、TGF-β表達(dá)水平高于腫瘤細(xì)胞對照組與壞死腫瘤細(xì)胞組(P<0.05)，IL-4表達(dá)水平則高于腫瘤細(xì)胞對照組而低于壞死腫瘤細(xì)胞組(P<0.05)。凋亡腫瘤細(xì)胞組促炎因子IL-12表達(dá)水平均低于正常腫瘤細(xì)胞與壞死腫瘤細(xì)胞(P<0.05)。見表6。

表6 ELISA法檢測不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對小鼠血清sFas、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平的影響(x±s)

注：△指與壞死腫瘤細(xì)胞組比較，P<0.05；#指與凋亡腫瘤細(xì)胞組比較，P<0.05。

3 討 論

Kerr于1972年首次提出，細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞正常生理現(xiàn)象下發(fā)生的程序性死亡，能將無功能細(xì)胞進(jìn)行非炎癥性清除，對于機(jī)體發(fā)揮免疫功能具有極其重要的作用[10]。機(jī)體通過凋亡的形式阻止免疫應(yīng)答的發(fā)生，而免疫細(xì)胞通過吞噬凋亡細(xì)胞從而加強(qiáng)或抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答[11]。在細(xì)胞凋亡的早期階段，凋亡細(xì)胞釋放“find-me”信號以被吞噬細(xì)胞識別[12]，從而吸引這些吞噬細(xì)胞接近凋亡細(xì)胞。接著凋亡細(xì)胞胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表達(dá)“find-me”信號[13]，如磷脂酰絲氨酸的反轉(zhuǎn)表達(dá)[14]等，引起周圍組織中具有吞噬作用的細(xì)胞迅速識別并對其進(jìn)行吞噬，凋亡細(xì)胞被接觸和(或)吞噬后，吞噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列特殊的變化，引起一些炎性因子的表達(dá)降低，如粒細(xì)胞集落刺激生物因子[15]、腫瘤壞死因子-α、IL-4等，而前列腺素E2、血小板活性化因子等抗炎因子表達(dá)和分泌水平提高，使吞噬細(xì)胞表達(dá)抗炎表型，發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)的作用。Liu等[16]認(rèn)為凋亡細(xì)胞被專職的吞噬細(xì)胞識別而激發(fā)抗炎反應(yīng)，下調(diào)炎癥因子水平。細(xì)胞凋亡參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫耐受。有研究表明，細(xì)胞凋亡能保持機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用[17]。陳建鋒等[18]認(rèn)為，細(xì)胞凋亡可能抑制機(jī)體局部的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受。本次實驗旨在通過用多種實驗方法來驗證凋亡大腸癌CT26細(xì)胞對小鼠體外T淋巴細(xì)胞及其活性的抑制作用。

51Cr釋放實驗結(jié)果顯示， 凋亡腫瘤細(xì)胞組中CTL的51Cr自然釋放率、不同效靶比的CTL活性均低于壞死腫瘤細(xì)胞組及腫瘤細(xì)胞對照組(P<0.05)，提示凋亡大腸癌CT26細(xì)胞培養(yǎng)的免疫細(xì)胞活性受到抑制。而用CCK-8檢測結(jié)果顯示，凋亡腫瘤細(xì)胞組CTL的A450值也低于其他兩組(P<0.05)，提示凋亡大腸癌CT26細(xì)胞能夠抑制小鼠的CD8+T淋巴細(xì)胞增殖。ConA具有強(qiáng)力的促有絲分裂、促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的作用，能選擇性激活被抑制的T淋巴細(xì)胞。由于ConA是T淋巴細(xì)胞分裂原，本實驗采用ConA進(jìn)行誘導(dǎo)干預(yù)作用，在細(xì)胞培養(yǎng)時加入ConA能夠促進(jìn)細(xì)胞活化增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，進(jìn)而觀察不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對ConA誘導(dǎo)的小鼠體外T淋巴細(xì)胞活性及增殖的影響，判斷細(xì)胞免疫的功能狀態(tài)，結(jié)果顯示，凋亡腫瘤細(xì)胞+ConA組T淋巴細(xì)胞CD69、CD25、CD71的表達(dá)率以及G2、G3及G4期的T淋巴細(xì)胞數(shù)量仍均低于ConA組、活腫瘤細(xì)胞+ConA及壞死腫瘤細(xì)胞+ConA(P<0.05)。

ELISA檢測顯示凋亡腫瘤細(xì)胞組CT26細(xì)胞的sFas相對表達(dá)量明顯低于壞死腫瘤細(xì)胞組和腫瘤細(xì)胞對照組(P<0.05)，其亦對小鼠血清IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β表達(dá)水平產(chǎn)生影響，其中與正常腫瘤細(xì)胞組與壞死腫瘤細(xì)胞組比較，凋亡腫瘤細(xì)胞組抗炎因子IL-10、TGF-β表達(dá)水平升高，促炎因子IL-12表達(dá)水平降低(P<0.05)，IFN-γ水平也降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，此外抗炎因子IL-4表達(dá)水平也高于腫瘤細(xì)胞對照組(P<0.05)。提示凋亡中或者即將啟動凋亡的腫瘤細(xì)胞中sFas及相關(guān)免疫抗炎因子表達(dá)水平上升，促炎因子下降，這也從另一角度反映炎癥反應(yīng)得到了抑制。Sakaguchi等[19]研究發(fā)現(xiàn)Treg在局部造成的免疫抑制微環(huán)境是幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫殺傷的關(guān)鍵。因此CD8+T和IFN-γ也是反映Treg免疫抑制狀態(tài)的重要間接指標(biāo)。本研究中，IFN-γ水平變化不甚明顯的原因可能是實驗誤差、未多次重復(fù)實驗等。Fas配體能夠抑制細(xì)胞凋亡，但在已經(jīng)發(fā)生凋亡的腫瘤細(xì)胞中卻能發(fā)揮抑制T淋巴細(xì)胞的活性甚至低效誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上其可能同時誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)免疫耐受。

此外，本實驗也進(jìn)行了流式細(xì)胞儀檢測不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞對小鼠Treg表達(dá)情況，結(jié)果顯示凋亡腫瘤細(xì)胞組Tregs的表達(dá)均較壞死腫瘤細(xì)胞組、腫瘤細(xì)胞對照組明顯減弱(P<0.05)，這提示在活體小鼠體內(nèi)凋亡的CT26細(xì)胞可抑制小鼠免疫系統(tǒng)的Treg表達(dá)。目前，對于Treg誘導(dǎo)的免疫抑制狀態(tài)與CT26模型小鼠腫瘤的影響作用有許多新的觀點。Tanaka等[20]研究認(rèn)為，已凋亡細(xì)胞提供了豐富的抗原從而使機(jī)體建立起外周免疫耐受，而King等[21]認(rèn)為腫瘤細(xì)胞會抑制細(xì)胞凋亡特別是對腫瘤細(xì)胞自身的凋亡刺激，兩者的結(jié)論有本質(zhì)區(qū)別。DC通過吞噬負(fù)載抗原的凋亡細(xì)胞而誘導(dǎo)免疫耐受，未成熟的DC細(xì)胞能遞呈凋亡信號至抗原特異性T細(xì)胞，從而抑制T細(xì)胞的增殖，這表明在體內(nèi)凋亡的誘導(dǎo)能導(dǎo)致抗原特異性耐受，很有可能通過DC和Treg介導(dǎo)[22]。凋亡細(xì)胞導(dǎo)致免疫耐受，這在大鼠心臟移植、C57/B1/6小鼠脾分離及與小鼠脾源性淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)等實驗中得到證實[23-26]。而我們的研究結(jié)果也提示凋亡的凋亡大腸癌CT26細(xì)胞無論在體外還是在活體小鼠體內(nèi)都可抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活性。當(dāng)機(jī)體固有免疫系統(tǒng)功能受到抑制時，炎性因子的活性受到影響，可能成為誘導(dǎo)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受的重要環(huán)節(jié)。

那么凋亡CT26細(xì)胞是通過增加了抗腫瘤的效應(yīng)而對抗 Treg的免疫抑制亦或是抑制了Treg的功能而發(fā)揮了抗腫瘤效應(yīng)呢？ Shi等[27]認(rèn)為Treg通過分泌TGF-β和IL-10以抑制免疫反應(yīng)，而Dash等[28]認(rèn)為TGF-β影響Treg的轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，且IL-10與小鼠 Treg的數(shù)量和功能緊密相關(guān)。在本實驗中，凋亡腫瘤細(xì)胞組Tregs降低，其血清中TGF-β和 IL-10 表達(dá)水平增高，提示凋亡CT26細(xì)胞抑制外周血中Treg分泌IL-10的能力，表明凋亡CT26細(xì)胞有抑制Treg免疫調(diào)節(jié)的作用，而阮志燕等[29]認(rèn)為大黃素能抑制CT26結(jié)腸癌小鼠Treg的生物學(xué)功能，其通過影響Treg的免疫抑制功能而發(fā)揮抗腫瘤作用，這與我們的結(jié)論有相似之處。

綜上所述，凋亡小鼠大腸癌CT26細(xì)胞能夠抑制小鼠T淋巴細(xì)胞增殖及其活性表達(dá)，影響大腸癌小鼠正常免疫功能。盡管目前對與凋亡CT26細(xì)胞的作用靶點尚不清楚， 但是其對 Treg的抑制作用在本實驗中得到進(jìn)一步證實。因此，我們認(rèn)為凋亡的大腸癌CT26細(xì)胞也能像正常細(xì)胞一樣抑制機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活性，這意味著凋亡腫瘤細(xì)胞也可以像正常細(xì)胞凋亡時那樣誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫耐受。但是本實驗對于凋亡CT26細(xì)胞抑制小鼠T淋巴細(xì)胞增殖及其活性的具體機(jī)制沒有展開深入研究，實驗中部分實驗結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義可能是樣本數(shù)不足、儀器測量誤差等原因引起，應(yīng)當(dāng)在后續(xù)研究中進(jìn)一步分析與驗證。

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Effect of apoptotic colorectal cancer CT26 cells on proliferation and activity of T lymphocytes in mice

SUNChao-wen1,2,ZHANGGuang-yu1,ZHAOChen1,2,CHENGHuai-fu1,2,ZHONGLi1,DAILing1

(1DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China;2GraduateSchool,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To investigate the effect of apoptotic colorectal cancer CT26 cells on the proliferation and activity of T lymphocytes in mice.Methods ① Colorectal cancer CT26 cells during logarithmic growth phase were used to prepare apoptotic tumor cells and necrotic tumor cells.T lymphocytes were isolated from the spleens of Balb/c mice,and then cytotoxic T lymphocytes(CTL) were prepared.② The apoptotic tumor cells,necrotic tumor cells and normal tumor cells were cultured with murine CTL separately(taken as apoptotic tumor cell group,necrotic tumor cell group and tumor cell control group,respectively).Then the activity and proliferation of CTL were detected.③ The T lymphocytes of mice were divided into control group,concanavalin A(ConA) group,apoptotic tumor cell+ConA group,necrotic tumor cell+ConA group and living tumor cell+ConA group.The activity and proliferation of T lymphocyte in each group were detected after corresponding treatment.④ Thirty Balb/c mice were selected and divided into apoptotic tumor cell group,necrotic tumor cell group and tumor cell control group,with 10 mice in each group.Apoptotic CT26 cells,necrotic CT26 cells and CT26 cells during logarithmic growth phase were subcutaneously and intravenously infused into mice in corresponding groups.Then the expression of regulatory T cells (Treg) in each group was detected.⑤ Another 30 mice were selected,then were grouped and treated by the way of method ④.The expression levels of soluble Fas(sFas),interleukin(IL)-12,interferon gamma(IFN-γ),IL-4,IL-10 and transforming growth factor beta(TGF-β) in each group were detected.Results The activity andA450 value of CTL in the apoptotic tumor cell group were lower than those in the other two groups(P<0.05).The expression rates of T lymphocytes(including CD69,CD25 and CD71) and number of T lymphocytes during stage G2 or G3 in the apoptotic tumor cell+ConA group were lower than those in the ConA group,living tumor cell+ConA group and necrotic tumor cell+ConA group(P<0.05).The expression level of Treg and relative expression of sFas in the apoptotic tumor cell group were lower than those in the tumor cell group and necrotic tumor cell group(P<0.05).The expression levels of IL-10 and TGF-β were higher and the expression level of IL-12 was lower in the apoptotic tumor cells group compared with the other two groups(P<0.05).The expression level of IL-4 in the apoptotic tumor cells group was higher than that in the tumor cell control group(P<0.05).Conclusion Apoptotic colorectal cancer CT26 cells can inhibit the proliferation and activity if T lymphocytes in mice,and can affect the normal immunological function of mice with colorectal cancer.

Colorectal cancer,CT26 cells,T lymphocytes,Activity,Proliferation,Regulatory T cell,Soluble Fas,Mouse

廣西自然科學(xué)基金(2012GXNSFAA276035)；廣西桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃(20120121-1-13)

孫朝文(1988～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：消化道惡性腫瘤的診治，微創(chuàng)外科。

張廣鈺(1966～)，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：消化道惡性腫瘤的診治，微創(chuàng)外科，E-mail：acrosssky@126.com。

R 735.3；R 392.4

A

0253-4304(2016)09-1201-07

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.04

2016-06-20

2016-07-25)