潘小敏 吳媛媛 羅志娟 李芳艷 韋欣宏 鐘 琳 謝智光

(1 廣西中醫(yī)藥大學，南寧市 530011，E-mail：autum19890303@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院婦科，3 檢驗科，南寧市 530022；4 廣西中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院仁愛分院婦科，南寧市 530023)

論著·基礎研究

道地通管湯對輸卵管炎大鼠轉化生長因子-βⅡ型受體和Smad2的mRNA表達的影響▲

潘小敏1吳媛媛2羅志娟2李芳艷1韋欣宏1鐘 琳4謝智光3

(1 廣西中醫(yī)藥大學，南寧市 530011，E-mail：autum19890303@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院婦科，3 檢驗科，南寧市 530022；4 廣西中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院仁愛分院婦科，南寧市 530023)

目的 觀察道地通管湯對輸卵管炎大鼠輸卵管組織中轉化生長因子-βⅡ型受體(TGF-βRⅡ)mRNA和Smad2 mRNA的影響。方法 68只雌性SD大鼠，隨機抽取12只作為正常組，剩余大鼠采用混合菌制成輸卵管炎模型，建模成功的48只大鼠分為模型組和道地通管湯低、中、高劑量組，各12只。正常組與模型組給予生理鹽水灌腸，道地通管湯低、中、高劑量組分別給予不同濃度的道地通管湯灌腸[0.35 g/(100 g·d)、0.7 g/(100 g·d)、1.4 g/(100 g·d)]，并于給藥第15天、30天隨機抽取每組6只大鼠檢測其輸卵管組織中TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的相對表達量情況。結果 (1)與正常組比，模型組給藥第15、30天時TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達量均增高(P<0.05)；道地通管湯各劑量組給藥第30天時，差異均無統計學意義(P>0.05)。(2)與模型組比，給藥第15、30天時道地通管湯中、高劑量組TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達量均降低(P<0.05)，給藥第15天時道地通管湯低劑量組TGF-βRⅡ的表達量也降低(P<0.05)。(3)道地通管湯各劑量組中TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達量呈低劑量組>中劑量組>高劑量組，給藥第30天時道地通管湯低劑量組與道地通管湯高劑量組的TGF-βRⅡ表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)，其余組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。(4)道地通管湯各劑量組中，給藥第30天時 TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA 的表達量均低于給藥第15天，其中道地通管湯各劑量組中Smad2 mRNA 的表達量組內比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 道地通管湯能抑制輸卵管炎性大鼠輸卵管組織中TGF-βRⅡ和Smad2的mRNA表達；道地通管湯給藥30 d作用效果較好，且道地通管湯中劑量與高劑量作用效果相近。

輸卵管炎；道地通管湯；轉化生長因子-βⅡ型受體；Smad2；信使RNA；大鼠

輸卵管炎性疾病可導致異位妊娠、不孕，嚴重影響患者的身心健康[1]。道地通管湯是羅志娟教授治療盆腔炎性疾病及輸卵管炎性堵塞不孕的經驗方，臨床療效顯著[2]。實驗研究結果顯示道地通管湯能改善輸卵管炎模型動物血液“黏、稠、滯”的狀態(tài)[3]，降低血漿C反應蛋白、白介素6的含量[4]，具有抗炎、抗粘連作用，但其具體機制不明確。相關研究顯示，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smads 信號轉導通路對炎癥的發(fā)生和發(fā)展有重要的影響[5-6]，而道地通管湯是否可通過作用于TGF-β1/Smads信號轉導通路相關分子而起抗炎、抗粘連的作用？本實驗采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測道地通管湯灌腸后輸卵管炎癥大鼠輸卵管組織中轉化生長因子-βⅡ型受體(transforming growth factor-β receptor Ⅱ，TGF-βRⅡ)和Smad2的mRNA含量變化情況，探討道地通管湯的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級雌性SD大鼠68只，體重(220±20)g，8～10周齡，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(桂)2014-0002，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2 材料

1.2.1 藥物：道地通管湯水煎濃縮至生藥含量為1.75 g/ml、3.5 g/ml、7.0 g/ml的溶液。

1.2.2 混合菌：將金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌按1 ∶1 ∶2比例用無菌生理鹽水配成3×108/ml的混合液。

1.2.3 主要試劑：Trizol-A+Reagent總RNA提取試劑盒(北京天根公司，批號：DP421)，FastQuant cDNA第一鏈合成試劑(北京天根公司，批號：KR106)，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(大連寶生物公司，批號：AK6503)，引物由上海生物工程技術有限公司合成。

1.2.4 主要儀器：紫外可見分光光度計(美國Thermo公司，型號：NanoDrop2000)，大容量冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司，型號：Eppendorf 5810R)，ABI實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司，型號：StepOnePlus)等。

1.3 造模方法 68只雌性SD大鼠，采用隨機數字表法抽取12只作正常組，對其余56只大鼠進行造模。采用混合菌造模法[7]，選擇動情后期雌性大鼠，用10%水合氯醛溶液0.3 ml/100 g腹腔注射后，仰臥固定、剃毛、消毒、鋪布，行縱形切口，打開腹腔，找到Y形子宮，分別在子宮角近輸卵管處注射細菌混懸液0.05 ml，緩慢注射，每側注射混合菌液 0.05 ml，然后將輸卵管納回腹腔，用1號絲線先縫合腹壁再縫合皮膚，75%酒精消毒手術傷口，正常組不做任何處理。術后將大鼠側臥位放于鼠籠內，每只大鼠單獨放于一個籠，待其自然蘇醒，再觀察術后大鼠的情況，造模術后所有大鼠自由飲食，使用普通飼料喂養(yǎng)，不使用抗生素治療。使用隨機數字表法分別于術后第5、10、15天選取1只大鼠及術后第20天選取2只大鼠，剖腹觀察記錄其輸卵管盆腔變化情況，截取輸卵管組織使用蘇木精-伊紅染色，檢測其病理形態(tài)學變化，以確定輸卵管炎模型造模成功。

1.4 給藥方法 56只進行造模的大鼠中，3只急性感染死亡，5只用于確定造模成功，剩余48只采用隨機數字表法分為模型組、道地通管湯低劑量組、道地通管湯中劑量組、道地通管湯高劑量組，每組12只。造模術后第21天開始灌腸，正常組與模型組給予生理鹽水0.2 ml/(100 g·d)，道地通管湯低、中、高劑量組分別給予不同濃度的水煎濃縮液[0.35 g/(100 g·d)、0.7 g/(100 g·d)、1.4 g/(100 g·d)，分別等效于人臨床常規(guī)量的1/2和1、2倍]灌腸。

1.5 標本的采集與制備 給藥第15、30天，采用隨機數字表法分別抽取每組6只大鼠，打開腹腔截取輸卵管組織迅速放于凍存管投入液氮過夜后保存于-80℃冰箱，采用qRT-PCR進行檢測。

1.6 TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA表達情況 按Trizol法提取大鼠輸卵管組織的總RNA；按反轉錄試劑盒操作步驟合成cDNA；采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，反應條件：95℃ 30 s，1個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。PCR實驗數據分析采用相對定量方法，計算方法選擇2-ΔΔCt法。引物見表1。

表1 β-actin、TGF-βRⅡ、Smad2引物序列與產物長度

注：β-actin為β-肌動蛋白。

1.7 統計學分析 采用SPSS 22軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組均數的比較采用單因素方差分析；道地通管湯各組組內用藥15 d與30 d的比較采用配對資料t檢驗或符號秩檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組TGF-βRⅡmRNA相對表達量比較 與正常組比，給藥第15、30天模型組 TGF-βRⅡ mRNA表達量增高(P<0.05)，道地通管湯各組表達量有不同程度增高，其中與給藥第15天時道地通管湯低、中劑量組的差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比，道地通管湯各組表達量有不同程度降低，除給藥第15天時的道地通管湯低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)外，其余各組差異均有統計學意義(P<0.05)。道地通管湯各劑量組中，TGF-βRⅡ mRNA表達量呈低劑量組>中劑量組>高劑量組，但僅給藥第30天時，道地通管湯低劑量組與道地通管湯高劑量組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。道地通管湯各劑量組中，給藥第30天TGF-βRⅡ mRNA表達量均低于給藥第15天，但差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 給藥后各組大鼠輸卵管組織中 TGF-βRⅡ mRNA相對表達量比較(x±s)

注：與正常組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.05。

2.2 各組Smad2 mRNA相對表達量比較 (1)與正常組比較，模型組Smad2 mRNA表達量增多(P<0.05)，道地通管湯各劑量組表達量不同程度增高，但差異均無統計學意義(P>0.05)；與模型組比，道地通管湯各組Smad2 mRNA表達量有不同程度降低，其中與給藥第15、30天時道地通管湯中、高劑量組的差異均有統計學意義(P<0.05)；道地通管湯各劑量組Smad2 mRNA呈低劑量組>中劑量組>高劑量組，但組間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。(2)道地通管湯各劑量組中，給藥第30天Smad2 mRNA均低于給藥第15天，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 給藥后各組大鼠輸卵管 組織中Smad2 mRNA相對表達量比較(x±s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討 論

大量研究表明TGF-β1/Smads信號轉導通路是炎癥發(fā)揮作用的主要途徑[5-6]。在炎癥刺激下，TGF-β1通過血纖維蛋白溶酶、活性氧、血小板-1和酸的作用從結合蛋白中水解分裂出來[8-9]，激活的TGF-β1結合其受體，通過分泌的方式發(fā)揮生物學作用[6]。TGF-β1最先結合TGF-βRⅡ，從而激活TGF-βRⅠ激酶，使受體調節(jié)型Smad2、Smad3磷酸化，繼而聯合Smad4成為一個Smad復合體；Smad復合體進入細胞核內發(fā)揮促使成纖維細胞增生的相關生物學效應，使膠原蛋白趨化為單核細胞、成纖維細胞等，使細胞外基質沉淀，最終導致TGF-β1/Smads信號通路反復被激活，進而使細胞內鈣離子增多，導致白介素6、腫瘤壞死因子大量釋放，由此產生的炎癥因子又存在正反饋的效應，而加強炎癥反應；其中當炎癥發(fā)生時，TGF-β1/Smads信號轉導通路的TGF-βRⅡ和Smad2表達增多，而炎癥好轉時，TGF-βRⅡ和Smad2表達減少[10-12]。

本課題組的前期實驗已證實道地通管湯具有抗炎、抗粘連的作用[3-4]。本實驗結果顯示，模型組大鼠輸卵管組織TGF-βRⅡ與Smad2 mRNA 的表達量均高于正常組(P<0.05)；且與模型組比，給藥第15、30天時道地通管湯中、高劑量組TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達量均降低(P<0.05)，給藥第30天時道地通管湯低劑量組TGF-βRⅡ的表達量也降低(P<0.05)。這提示道地通管湯可能通過抑制 TGF-βRⅡ與Smad2的mRNA的表達，從而起到抗炎、抗粘連的作用。

本實驗結果還顯示，給藥30 d時，道地通管湯各劑量組TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達量與正常組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，且中、高劑量組TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表達量接近正常組；而道地通管湯中劑量組與高劑量組TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA 的表達量比較，差異也均無統計學意義(P>0.05)。這提示道地通管湯給藥30 d作用效果較好，且道地通管湯中劑量與高劑量作用效果相近。對于道地通管湯各劑量組兩兩比較以及組內比較部分無統計學差異，這可能與本研究樣本量少有關。

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Effect of Daodi Tongguan decoction on expressions of transforming growth factor-betareceptor Ⅱ and Smad2 mRNAs in rats with salpingitis

PANXiao-min1,WUYuan-yuan2,LUOZhi-juan2,LIFang-yan1,WEIXin-hong1,ZHONGLin4,XIEZhi-guang3

(1GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530011,China;2DepartmentofGynaecology,3DepartmentofClinicalLaboratory,RuikangHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530022,China;4DepartmentofGynaecology,Ren′aiDivision,theFirstAffiliatedHospitaltoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530023,China)

Objective To observe the effect of Daodi Tongguan decoction on the expressions of transforming growth factor-β receptor Ⅱ(TGF-βRⅡ) mRNA and Smad2 mRNA in fallopian tube tissues of rats with salpingitis.Methods Twelve of 68 female SD rats were selected randomly as the normal group,and salpingitis models were established using mixed bacteria in the rest rats.The 48 successful rat models were divided into model group,low-,medium- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups,with 12 rats in each group.The rats in the normal group and model group were given normal saline by enemata,while the rats in the low-,medium- and high-Daodi Tongguan decoction groups were given Daodi Tongguan decoction with the concentrations of 0.35 g/(100 g·d),0.7 g/(100 g·d) and 1.4 g/(100 g·d) by enemata respectively.On the 15th and 30th day after administration,six rats were randomly selected from each group to detect the relative expressions of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in their fallopian tube tissues.Results ① Compared to the normal group,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in the model group increased on the 15th and 30th day after administration (P<0.05);on the 30th day after administration,no significant differences in the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs were found among all Daodi Tongguan decoction groups(P>0.05).② Compared to the model group,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in the medium- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups decreased on the 15th and 30th day after administration(P<0.05),and the expression quantity of TGF-βR Ⅱ in the low-dose Daodi Tongguan decoction group also decreased on the 15th day after administration(P<0.05).③ Among all Daodi Tongguan decoction groups,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs deceased in the order of low-,medium- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups.There was significant difference in the expression quantity of TGF-βR Ⅱ between the low- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups(P<0.05),and no statistical difference was observed among other Daodi Tongguan decoction groups(P>0.05).④ Among the Daodi Tongguan decoction groups,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs on the 30th day after administration were lower than those on the 15th day,and the statistical difference was found in the expression quantity of Smad2 mRNA among the Daodi Tongguan decoction groups(P<0.05).Conclusion Daodi Tongguan decoction can inhibit the expressions of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in fallopian tube tissues of rats with salpingitis.The efficacy is better on the 30th day after administration,and the medium-dose Daodi Tongguan decoction obtains a similar efficacy as the high-dose Daodi Tongguan decoction.

Salpingitis,Daodi Tongguan decoction,Transforming growth factor-βreceptor Ⅱ,Smad2,Message RNA,Rat

國家自然科學基金(81360594)

潘小敏(1989～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：不孕不育與生殖內分泌。

羅志娟(1960～)，女，本科，教授，研究方向：不孕不育與生殖內分泌、婦科炎癥，E-mail：lzj60123@163.com。

R 285.5

A

0253-4304(2016)09-1189-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.01

2016-04-14

2016-06-20)