萬智敏向延根 馬小華 石國民 范任華 彭雪峰

(1 南華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，衡陽市 421001，E-mail：304069315@qq.com；2 長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙市 410004)

論著·臨床研究

rpoB基因不同突變位點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌利福平體外最小抑菌濃度的變化▲

萬智敏1，2向延根2馬小華2石國民2范任華2彭雪峰2

(1 南華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，衡陽市 421001，E-mail：304069315@qq.com；2 長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙市 410004)

目的 探討rpoB基因不同突變位點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌利福平體外最小抑菌濃度(MIC)的變化。方法 收集人型的結(jié)核分枝桿菌菌株103株，利用基因芯片法篩選rpoB耐藥突變基因菌株。采用絕對(duì)濃度法對(duì)所有菌株進(jìn)行不同濃度的利福平藥敏試驗(yàn)，觀察不同菌株對(duì)利福平的MIC。結(jié)果 基因芯片共分離出55株rpoB突變株，48株非突變株。突變株MIC值為 (459.6±205.8)μg/ml，高于非突變株的(5.0±4.5)μg/ml(P<0.05)。55株rpoB突變株中突變位點(diǎn)分別為531(C→T)、526(C→G/T)和516(A→G/T)，531(C→T)位點(diǎn)突變株的MIC值為(576.0±29.3)μg/ml，均高于516(A→G/T)的(432.9±38.2)μg/ml和526(C→G/T)的(355.5±59.5)μg/ml(P<0.05)，但526(C→G/T)、516(A→G/T)位點(diǎn)突變株的MIC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 基因芯片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變株與其耐藥表型相關(guān)性較高。不同突變位點(diǎn)的結(jié)核桿分枝菌菌株對(duì)利福平的耐藥程度有差異，可為臨床合理用藥提供參考。

結(jié)核分枝桿菌；rpoB基因；芯片基因；利福平；最小抑菌濃度

我國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，也是耐藥結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家[1]。利福平作為一線抗結(jié)核藥物，由于各種原因?qū)е陆Y(jié)核分枝桿菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥?；蛐酒ㄊ菣z測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的新方法，對(duì)利福平耐藥基因的檢測(cè)與表型檢測(cè)符合率在95.0%以上[2]。但是目前臨床上對(duì)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的研究多局限于定性檢測(cè)，尚未對(duì)耐藥基因相應(yīng)位點(diǎn)的突變引起的耐藥水平進(jìn)行深入研究。本研究通過分析基因芯片分離出的rpoB突變株利福平耐藥的情況，探討rpoB基因不同突變位點(diǎn)對(duì)其利福平最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的影響，為臨床用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院2014年1月1日至2015年9月30日臨床送檢的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[3]處理痰標(biāo)本獲得菌懸液，經(jīng)在BACTEC MGIT-960結(jié)核桿菌培養(yǎng)儀(美國BD公司)，用Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基(碧迪醫(yī)療器械上海有限公司，批號(hào)：5260715)培養(yǎng)，涂片鑒定為結(jié)核分枝桿菌陽性的菌株共103株，經(jīng)PNB和TCH培養(yǎng)基鑒定均為人型結(jié)核分枝桿菌，且PNB敏感、TCH耐藥。H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國結(jié)核病控制中心參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要儀器、設(shè)備和試劑 利福平純藥粉由美國Sigma公司提供(批號(hào)：Lot080M1506V)；結(jié)核分枝桿菌耐利福平芯片檢測(cè)配套設(shè)備包括Extractor 36核酸快速提取儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、SlideWasherTM8芯片洗干儀和LuScan 10K-B微陣列芯片掃描儀均為北京奧博生物有限公司生產(chǎn)；HB-100干式恒溫金屬浴(上海之信儀器有限公司)；PCR擴(kuò)增儀7300(美國ABI有限公司)；H1650-W高速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀有限公司)；FX-1200-B2生物安全柜(上海瑞仰凈化裝備有限公司)；DW-86L-388A低溫冰箱(中國海爾有限公司)；自制改良羅氏培養(yǎng)基按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[3]進(jìn)行配置。谷氨酸鈉(加加集團(tuán)有限公司，批號(hào)：GB/T8967)；磷酸二氫鉀(光華有限公司，批號(hào)：20110928)；硫酸鎂(批號(hào)：20110322)和枸櫞酸鎂(批號(hào)：20110627)為光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)；孔雀綠(批號(hào)：20110110)和吐溫80(批號(hào)：20130927)均為科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 基因芯片法篩選耐藥基因突變菌株

1.3.1 DNA提取：從Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基中吸取約1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊娜诵徒Y(jié)核分枝桿菌菌懸液20 μl于核酸提取管中，加入80 μl的核酸提取液試劑，用Extractor 36核酸快速提取儀震蕩10 min，100℃金屬浴5 min，12 000 r/min離心1 min，得到的核酸提取液放置于-20℃保存待檢。

1.3.2 PCR擴(kuò)增：取出PCR擴(kuò)增試劑(北京奧博生物有限公司，批號(hào)：0112151601)自然解凍，瞬時(shí)離心至管底。每個(gè)菌株的核酸提取液標(biāo)本進(jìn)行3管反應(yīng)，將擴(kuò)增液1、2、3分別按每管18 μl分裝，對(duì)于一個(gè)樣本，向3管中分別加入同一樣本DNA各2 μl，放入ABI7300PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。擴(kuò)增條件設(shè)定為：37℃ 600 s；94℃ 600 s；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，72℃ 60 s，共10個(gè)循環(huán)；72℃ 420 s。

1.3.3 耐藥基因檢測(cè)：將擴(kuò)增好的產(chǎn)物置于7300 PCR擴(kuò)增儀中95℃變性5 min，冰浴5 min，取出雜交緩沖液按9 μl雜交緩沖液、3 μl+3 μl PCR產(chǎn)物的比例配制雜交混合液，吸取13.5 μl混合液加入雜交芯片加樣孔中，置入已設(shè)置雜交條件為50℃、2 h的BioMixerTMⅡ芯片雜交儀中進(jìn)行雜交。雜交完成后，再進(jìn)行芯片洗滌、干燥、芯片掃描及結(jié)果判讀。以試劑盒自帶的陰陽性對(duì)照作為質(zhì)控，利福平相關(guān)rpoB基因探針分布見表1。

表1 利福平rpoB基因相應(yīng)位點(diǎn)基因突變的類型

注：QC：表面化學(xué)質(zhì)控探針；EC：雜交陽性外對(duì)照探針；BC：空白對(duì)照；NC：陰性對(duì)照探針；IC：內(nèi)對(duì)照探針；WT：野生型。

1.4 羅氏培養(yǎng)基的制備及菌株的菌種復(fù)蘇

1.4.1 改良羅氏培養(yǎng)基制備：按改良羅氏培養(yǎng)基配方稱取谷氨酸鈉28.8 g，磷酸二氫鉀9.6 g，硫酸鎂0.9 g、枸櫞酸鎂2.4 g，加2 400 ml水溶解后，加甘油48 ml、孔雀綠溶液80 ml，加入全卵液4 000 ml，充分混勻后倒入容量為10 ml的塑料杯子約7 ml，高壓蒸汽滅菌備用。另配置10個(gè)不同利福平濃度的羅氏培養(yǎng)基，分別為5.0 μg/ml、10.0 μg/ml、20.0 μg/ml、40.0 μg/ml、80.0 μg/ml、160.0 μg/ml、320.0 μg/ml、640.0 μg/ml、1 280.0 μg/ml、2 560.0 μg/ml；羅氏培養(yǎng)基的利福平藥物臨界濃度為40.0 μg/ml。1.4.2 菌株的菌種復(fù)蘇：對(duì)所有篩選的菌株標(biāo)本進(jìn)行菌種復(fù)蘇，從Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基中取1ml的菌懸液加到改良羅氏培養(yǎng)基上，36℃溫箱，培養(yǎng)1個(gè)月左右，待斜面長(zhǎng)出菜花樣的菌落。

1.5 菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)

1.5.1 菌液制備和菌種接種：按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[3]進(jìn)行微生物敏感性試驗(yàn)。在磨菌管中加入少量玻璃珠(8～10顆)、0.1 ml吐溫80試劑、1 ml無菌生理鹽水，用無菌接種環(huán)刮取改良羅氏培養(yǎng)基斜面上的分枝桿菌菌落數(shù)個(gè)，加入磨菌管內(nèi)，蓋緊管蓋，漩渦振蕩器震蕩將分枝桿菌磨散，靜置30 min；吸取菌液(避免吸取底部較大的顆粒)轉(zhuǎn)移至無菌試管內(nèi)，加入5ml無菌生理鹽水培養(yǎng)液調(diào)制菌液濃度至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?，再?.5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙喊? ∶20倍稀釋；用1 ml注射器吸取0.1 ml已稀釋標(biāo)本加入到不同濃度利福平羅氏培養(yǎng)基中，放入34℃溫箱進(jìn)行培養(yǎng)；1個(gè)月后觀察培養(yǎng)基上耐藥菌株的生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行結(jié)果分析。

1.5.2 結(jié)果判讀：嚴(yán)格按《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[3]判讀結(jié)果。敏感：培養(yǎng)基斜面上無菌落生長(zhǎng)；耐藥：菌落數(shù)占藥敏培養(yǎng)基斜面面積1/4以上；當(dāng)菌落數(shù)<20個(gè)時(shí)，報(bào)告實(shí)際的菌落數(shù)；無藥對(duì)照管菌落數(shù)<50，需重新進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.6 質(zhì)量保證 每批藥敏試驗(yàn)均由經(jīng)驗(yàn)豐富的人員操作，從培養(yǎng)基的配制到藥敏試驗(yàn)、結(jié)果的報(bào)告均嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)程，并用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株作為質(zhì)控。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，Levene檢驗(yàn)方差齊性，方差不齊采用Dunnett檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rpoB基因芯片篩選結(jié)果 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，本次檢測(cè)到的rpoB突變類型分別為531(C→T)、526(C→G/T)和516(A→G/T)，本次檢測(cè)的所有位點(diǎn)及ropB野生型基因芯片的檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 不同rpoB突變位點(diǎn)基因芯片圖

2.2 突變株與非突變株MIC比較 本次檢測(cè)的rpoB突變類型分別為531(C→T)、526(C→G/T)和516(A→G/T)。103株標(biāo)本中，基因芯片檢測(cè)出55株為突變株，48株為非突變株。突變株MIC值為 (459.6±205.8)μg/ml，高于非突變株的(5.0±4.5)μg/ml(t=16.377，P<0.001)。2.3 不同突變類型MIC分布 突變菌株不同突變類型的MIC值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。531(C→T)突變株MIC高于526(C→G/T)、516(A→G/T)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而526(C→G/T)突變株MIC和516(A→G/T)突變株MIC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 突變菌株不同突變類型的MIC值比較(x±s，μg/ml)

注：與531(C→T)比較，*P<0.05。

3 討 論

利福平是結(jié)核病的治療方案中必不可少的一線藥物之一，其主要作用機(jī)制是通過結(jié)合RNA聚合酶β亞基，使RNA聚合能力受到抑制，從而終止RNA的合成[4-5]。利福平耐藥性主要是由集中在密碼子507～533位堿基區(qū)域發(fā)生突變導(dǎo)致，這些區(qū)域稱耐藥決定區(qū)[6]。研究發(fā)現(xiàn)利福平治療失敗更容易引發(fā)耐多藥結(jié)核[7]。但是臨床上采用絕對(duì)濃度法界定利福平耐藥臨界值為40.0 μg/ml以判讀耐藥或敏感，并未根據(jù)耐藥菌株對(duì)利福平耐藥程度進(jìn)行深入研究。因此，有必要對(duì)基因芯片法檢測(cè)的rpoB基因突變株進(jìn)行耐藥表型MIC檢測(cè)，以了解rpoB基因不同突變類型與利福平耐藥表型之間的關(guān)系。

基因芯片法具有簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，逐漸被大多數(shù)結(jié)核病?？漆t(yī)院所采用，對(duì)rpoB突變的檢測(cè)結(jié)果與RFP表型耐藥的符合度達(dá)95.0%左右[8-9]。利福平耐藥相關(guān)基因rpoB基因包括6個(gè)位點(diǎn)13種突變類型，包括531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG等[10]。本次研究采用基因芯片技術(shù)篩查了55例ropB突變型，基因突變類型分別為531位TCG→TTG、526位CCC→CGC和CCC→CTC和516位GAC→GTC及GAC→GGC。55株突變菌株MIC值為(459.6±205.8)μg/ml，而非突變株MIC值均在40.0 μg/ml以下，突變株總的MIC值明顯高于非突變株(P<0.05)，這說明結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥的根本原因是rpoB基因相應(yīng)位點(diǎn)產(chǎn)生突變，耐藥主要是由耐藥基因引起。本次研究的531位點(diǎn)突變株MIC值顯著高于516位點(diǎn)和526位點(diǎn)突變株(P<0.05)，這提示具有不同突變位點(diǎn)的菌株對(duì)利福平的耐藥性存在差異，在臨床上可以為耐多藥的患者在無藥可用的情況下提供用藥參考。此外，本次研究中，516和526位點(diǎn)突變株MIC值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與文獻(xiàn)報(bào)告的526位點(diǎn)引起高水平耐藥而516位點(diǎn)引起低水平耐藥有差異[11]?？傊瑀poB基因不同的突變模式對(duì)利福平產(chǎn)生的耐藥程度有顯著的差異，可以為臨床用藥提供參考，特別是全耐藥病人患者，可以根據(jù)不同的突變模式選擇不同藥物的MIC值來用藥，但體內(nèi)用藥還需進(jìn)一步臨床試驗(yàn)驗(yàn)證[12]。

本研究尚存在不足之處：(1)本次試驗(yàn)選擇的突變株例數(shù)偏少，可能所測(cè)MIC值存在偏差，下一步將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究；(2)本次分離的突變位點(diǎn)是本院主要的突變位點(diǎn)，尚未涉及到其他突變類型，下一步在擴(kuò)大樣本量的同時(shí)盡可能找出其他突變類型進(jìn)行研究。此外，同一突變位點(diǎn)不同堿基之間的耐藥情況是否存在差異尚待研究。(3)本次試驗(yàn)選取的標(biāo)本時(shí)間跨度大，位于低溫長(zhǎng)時(shí)間保存的菌株可能會(huì)產(chǎn)生一定的變異抑或已經(jīng)死亡導(dǎo)致未復(fù)蘇成功。

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Changes in minimal inhibitory concentration of rifampicin in vitro for mycobacterium tuberculosis strains with different rpoB gene mutation

WANZhi-min1,2,XIANGYan-gen2,MAXiao-hua2,SHIGuo-ming2,FANRen-hua2,PENGXue-feng2

(1ClinicalMedicalCollege,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,ChangshaCentralHospital,Changsha410004,China)

Objective To explore the changes in minimal inhibitory concentration(MIC) of rifampicin in vitro for mycobacterium tuberculosis strains with different rpoB gene mutation.Methods A total of 103 strains of human mycobacterium tuberculosis were collected,and the strains with drug-resistant mutant gene rpoB were screened using gene chip technology.The drug sensitivity test with different concentrations of rifampicin was conducted in all strains by absolute concentration method.Then the MICs of rifampicin for different strains were observed.Results Fifty-five strains with rpoB gene mutation and 48 without rpoB gene mutation were isolated by gene chip technology.The MIC of mutant strains was (459.6±205.8)μg/ml,and was higher than that of non-mutant strains[(5.0±4.5)μg/ml,P<0.05].The mutation sites of mutant strains included 531(C→T),526(C→G/T) and 516(A→G/T).The MIC of the strains with mutation site of 531(C→T)was (576.0±29.3)μg/ml,and was higher than that of the strains with 516(A→G/T)[(432.9±38.2)μg/ml] or 526(C→G/T)[(355.5±59.5)μg/ml,P<0.05].But there was no significant difference in the MIC between the mutation strains with 516(A→G/T) and 526(C→G/T)(P>0.05).Conclusion The mutation of rpoB gene identified by gene chip is closely related to the phenotype of drug resistance.Difference in severity of drug resistance for rifampicin is found among the strains of mycobacterium tuberculosis with different mutation sites,which can provide the references for clinical rational drug use. 【Key words】 Mycobacterium tuberculosis,rpoB gene,Gene chip,Rifampicin,Minimum inhibitory concentration

國家十二五重大專項(xiàng)課題(2013ZX10005004-004)

萬智敏(1989～)，女，本科，檢驗(yàn)技師，研究方向：臨床微生物學(xué)。

向延根(1963～)，男，碩士，主任技師，研究方向：臨床微生物學(xué)，E-mail：xiangyangen@126.com。

R 378.911

A

0253-4304(2016)06-0773-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.06

2016-01-26

2016-04-20)