王魯梅 曾碧冰 李俊杰 盧婉嬌 張 斌

(廣東省東莞市人民醫(yī)院皮膚科，東莞市 523000，E-mail：wangluomei952@163.com)

論著·臨床研究

輔助T細(xì)胞17及其相關(guān)調(diào)控因子在特應(yīng)性皮炎患者中的表達(dá)情況及其臨床意義▲

王魯梅 曾碧冰 李俊杰 盧婉嬌 張 斌

(廣東省東莞市人民醫(yī)院皮膚科，東莞市 523000，E-mail：wangluomei952@163.com)

目的 探討輔助T細(xì)胞17(Th17)及其相關(guān)調(diào)控因子白細(xì)胞介素-23(IL-23)和微小RNA155(miR-155)在特應(yīng)性皮炎(AD)患者外周血中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法 選擇54例AD患者和30例健康對(duì)照者，檢測(cè)受試者外周血白細(xì)胞中Th17比例、IL-23、miR-155的表達(dá)水平，分析3者診斷AD的敏感性和特異性以及3者與AD嚴(yán)重程度特應(yīng)性皮炎評(píng)分(SCORAD)的相關(guān)性。結(jié)果 AD患者Th17比例、IL-23和miR-155表達(dá)水平均顯著高于健康對(duì)照者(P<0.05)；Th17比例、IL-23和miR-155診斷AD的敏感性分別77.64%、65.30%和82.19%，特異性分別為62.81%、74.28%和77.06%；Th17比例、IL-23和miR-155表達(dá)水平均與SCORAD評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 IL-23和miR-155可能參與了AD中Th17細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控，Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子尚不能作為AD的診斷指標(biāo)，但可以輔助判斷其疾病嚴(yán)重程度。

特應(yīng)性皮炎；輔助T細(xì)胞17細(xì)胞；白細(xì)胞介素-23；微小RNA-155

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種具有遺傳傾向的慢性、復(fù)發(fā)性瘙癢性皮膚病，以皮膚干燥、瘙癢和炎癥為特點(diǎn)，同時(shí)伴有血清中IgE水平增高和嗜酸粒細(xì)胞增多，其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜且至今未明[1]。輔助T細(xì)胞(T helper cell，Th)17作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要免疫細(xì)胞，在多學(xué)科多種疾病的發(fā)病機(jī)制中受到廣泛關(guān)注[2]。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-23和微小RNA(microRNA，miR)-155分別是Th17細(xì)胞的2個(gè)重要調(diào)控因素，其中IL-23作為調(diào)控細(xì)胞因子，通過(guò)促進(jìn)Th17的生物活性，誘導(dǎo)其表達(dá)特異性效應(yīng)因子IL-17而發(fā)揮病理作用，其在紅斑狼瘡、天皰瘡和銀屑病等多種皮膚病發(fā)病機(jī)制中的作用研究中均得到證實(shí)[3]。而miR-155作為調(diào)控Th17的微小蛋白質(zhì)，目前已被證實(shí)是Th17分化所必需的miR之一[4]，目前有關(guān)在AD患者中是否也存在miR-155高表達(dá)并對(duì)Th17細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)AD患者外周血中Th17及其2個(gè)重要調(diào)控因素IL-23和miR-155的表達(dá)情況，并分析其與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，以探討3者在AD診斷和病情評(píng)估中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月至2015年5月在我院門(mén)診就診的AD患者54例，納入標(biāo)準(zhǔn)：AD的診斷符合文獻(xiàn)[5]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；患者檢測(cè)前1周停止系統(tǒng)和外用糖皮質(zhì)激素以及免疫抑制劑治療，停用抗組胺藥1周以上，無(wú)光療1個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在其他皮膚病或內(nèi)臟疾病史者。其中男28例、女26例，年齡10～42(25.68±9.78)歲，病程9～32(17.68±6.54)年。選擇健康志愿者30例作為健康對(duì)照組，其中男14例、女16例，年齡12～38(22.68±9.78)歲，均無(wú)家族和個(gè)人過(guò)敏史，無(wú)皮膚病或內(nèi)臟病史。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本采集 采集各組受試對(duì)象晨起空腹時(shí)的外周靜脈血5 ml，440×g離心10 min，分離血漿，采用Ficoll密度梯度離心法分離、獲取外周血漿和外周血單一核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，標(biāo)本于-70℃保存待檢。

1.3 Th17細(xì)胞檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th17比例(IL17+CD4+T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞%)：將PBMC放入含10%胎牛血清的RPMI 160培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：GNM 31800)中并調(diào)整濃度至2×106細(xì)胞/ml，先后加人50 μg/L佛波酯、1 mg/L鈣離子載體和10 mg/L布雷菲德菌素A(均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：FK-LM125)，37℃、5% CO2條件下共刺激培養(yǎng)5 h。首先細(xì)胞膜用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)-CD4單克隆抗體標(biāo)記，透膜、固定后PE-L17單克隆抗體細(xì)胞染色，染色步驟參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司)。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)標(biāo)本，應(yīng)用WinMDI2.9軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 IL-23表達(dá)水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外周血IL-23的表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司(批號(hào)：17992406)，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 miR-155表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)外周血PBMC中miR-155的表達(dá)水平：用Trizol RNA提取試劑(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：RP2401)按說(shuō)明書(shū)提取PBMC中的總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定其純度，吸光度值(A260/A280)在1.8～2.0之間為合格樣本。利用miR-155莖環(huán)引物5′-GTCGTATC CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCTAT-3′、內(nèi)參U6反轉(zhuǎn)錄引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′及oligo(dT)，按M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：20D09H)說(shuō)明書(shū)合成對(duì)應(yīng)的cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(日本Toyobo公司，QPK-212)，并分別以U6和β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，引物序列為：(1)目的基因miR-155上游引物5′-TGCCTCCAACTGACTCCTAC-3′，下游引物 5′-GCGAGCACAGAATAATACGAC-3′。(2)內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCACACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT -3′。β肌動(dòng)蛋白上游引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTC-3′，下游引物5′-TCACCTTC ACCGTTCCAGTTT-3′。在Rotor-Gene 3000實(shí)時(shí)PCR儀(澳大利亞Corbett Research公司)進(jìn)行miR-155的定量檢測(cè)。數(shù)據(jù)應(yīng)用分析軟件(Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0)和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法進(jìn)行分析。

1.6 病情程度的評(píng)價(jià) 采用歐洲AD研究組提出的特應(yīng)性皮炎評(píng)分[6](scoring atopic dermatitis index，SCORAD)進(jìn)行評(píng)估，包括客觀(guān)體征皮膚病變范圍(A)和皮損嚴(yán)重程度(B)，主觀(guān)癥狀瘙癢和影響睡眠程度(C)，計(jì)分值計(jì)算公式為A/5+7B/2+C。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)；正態(tài)分布的資料采用Pearson相關(guān)性分析，非正態(tài)分布的資料采用Spearman相關(guān)性分析。3個(gè)指標(biāo)的診斷效能分析采用受試者工作曲線(xiàn)進(jìn)行。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組PBMC中Th17比例比較 AD患者PBMC中Th17細(xì)胞比例為(1.78±0.20)%，高于對(duì)照組的(0.47±0.20)%(t=12.145，P<0.001)。

2.2 兩組IL-23和miR-155的表達(dá)水平比較 AD患者的IL-23及miR-155的表達(dá)水平均高于健康對(duì)照者(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 AD患者和健康對(duì)照者IL-23和miR-155的表達(dá)水平(x±s)

2.3 相關(guān)性分析 AD患者中，Th17比例(r=0.415，P=0.034)、IL-23表達(dá)水平(r=0.577，P=0.036)、miR-155表達(dá)水平(r=0.426，P=0.011)均與SCORAD評(píng)分正相關(guān)；IL-23表達(dá)水平、miR-155表達(dá)水平均與Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=3.577，P=0.036；r=6.426，P=0.049)。

12.4 Th17細(xì)胞比例、IL-23和miR-155的表達(dá)水平診斷AD的敏感性和特異性 Th17比例診斷AD的截?cái)嘀禐?.01%，曲線(xiàn)下面積為0.677，敏感性為77.64%，特異性為62.81%。IL-23水平診斷AD的截?cái)嘀禐?74.55 pg/ml，曲線(xiàn)下面積為0.704，敏感性為65.30%，特異性為74.28%。PBMC中miR-155水平診斷AD的截?cái)嘀禐?.63，曲線(xiàn)下面積為0.813，敏感性為82.19%，特異性為77.06%。

3 討 論

IL-23作為調(diào)控Th17的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞增殖、活化及終末分化，增加已分化細(xì)胞的數(shù)量，并在維持其生存及產(chǎn)生Thl7記憶形成中起關(guān)鍵作用，同時(shí)促進(jìn)Thl7產(chǎn)生一定水平的IL-17[7-8]；IL-17可作為前炎性介質(zhì)募集中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞，誘發(fā)多種炎癥損傷[7]。目前有研究已證實(shí)，AD患者外周血中Th17細(xì)胞、IL-17蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[9-10]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在卵白蛋白誘導(dǎo)的小鼠AD模型中，皮膚樹(shù)突細(xì)胞是表達(dá)IL-23的主要來(lái)源細(xì)胞[11]，IL-23是誘導(dǎo)皮膚初始T細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞的關(guān)鍵因子[11]。這提示在AD患者中可能也存在IL-23的高表達(dá)并對(duì)Th17細(xì)胞存在正調(diào)控。

本研究結(jié)果顯示，AD患者外周血中IL-23蛋白表達(dá)水平和Th17比例高于健康對(duì)照組(P<0.05)，且與病情的嚴(yán)重程度(SCORAD評(píng)分)呈正相關(guān)(P<0.05)，這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道相一致[9-10]；同時(shí)IL-23與Th17比例呈正相關(guān)(P<0.05)。這些結(jié)果表明，在AD患者高表達(dá)IL-23，高表達(dá)的IL-23對(duì)Th17存在正性調(diào)控，使Th17比例也相應(yīng)上調(diào)，而Th17產(chǎn)生的IL-17可能也相應(yīng)升高，IL-17作為前炎性介質(zhì)可促進(jìn)AD炎癥反應(yīng)發(fā)生，因此，隨著病情的嚴(yán)重程度增加，兩組的表達(dá)水平也隨著升高。而高表達(dá)的IL-23病理機(jī)制形成可能是AD中因多種因素所致瘙癢、搔抓引起的皮膚機(jī)械損傷，誘發(fā)皮膚樹(shù)突狀細(xì)胞攜帶抗原從皮膚游走至淋巴結(jié)產(chǎn)生較多的IL-23[12]。

miR-155是一種多功能的miR分子，已被證實(shí)能夠明顯影響先天性免疫和適應(yīng)性免疫過(guò)程，如炎癥介導(dǎo)、抗原提呈、T細(xì)胞分化、細(xì)胞因子產(chǎn)生等[13]。miR-155為T(mén)h17分化所必需的因素，缺失miR-155的T細(xì)胞不能正常分化為T(mén)h17細(xì)胞[14]。本研究結(jié)果顯示，AD患者外周血miR-155表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，且表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)；同時(shí)AD患者miR-155的高表達(dá)與Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān)(P<0.05)。這些結(jié)果表明，在AD中高表達(dá)的miR-155也對(duì)Th17正性調(diào)控，使Th17比例相應(yīng)上調(diào)，其表達(dá)水平隨病情的加重而升高，提示miR-155參與AD的疾病發(fā)生過(guò)程。IL-23、miR-155雖均為T(mén)h17的調(diào)控因素，但二者在促進(jìn)Th17分化和功能的調(diào)控機(jī)制上卻存在著不同，且各為獨(dú)立。IL-23作為細(xì)胞因子作用于Th17的受體發(fā)揮調(diào)控作用[8]。而細(xì)胞因子信號(hào)抑制物1是miR-155的直接靶基因，miR-155通過(guò)JAK/STAT信號(hào)途徑抑制細(xì)胞因子信號(hào)抑制物1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CD4+T細(xì)胞中Th17的分化與功能[15]。

本研究進(jìn)一步分析了Th17比例、IL-23和miR-155作為診斷AD的可行性，但結(jié)果表明3者診斷AD的特異性和敏感性并不高，因此Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子是否可以作為AD的診斷指標(biāo)尚需進(jìn)一步研究。但Th17比例、IL-23和miR-155與AD的SCORAD評(píng)分顯著相關(guān)，因此臨床可考慮將其作為判斷疾病嚴(yán)重程度的客觀(guān)指標(biāo)之一。

綜上所述，IL-23和miR-155可能參與了AD中Th17的表達(dá)調(diào)控，但Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子尚不能作為AD的診斷指標(biāo)，但可以輔助判斷其疾病嚴(yán)重程度，因此在臨床的應(yīng)用中仍具有較好的前景。

[1] 任發(fā)亮,顧 恒.中外特應(yīng)性皮炎診療指南比較[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2013,27(2):210-213.

[2] 李泓馨,林 麟.Th17細(xì)胞在皮膚病的研究進(jìn)展[J].國(guó)際皮膚性病學(xué)皮膚科雜志,2011,37(2):88-90.

[3] 黃新芳,占一凡,華 晶,等.白細(xì)胞介素-23和白細(xì)胞介素-12亞單位在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的表達(dá)研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2006,10(4):193-195.

[4] Sonkoly E,Janson P,Majuri ML,et al.MiR-155 is overexpressed in patients with atopic dermatitis and modulates T-cell proliferative responses by targeting cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4[J].J Allergy Clin Immunol,2010,126(3):581-589.

[5] Williams HC,Burney PG,Hay RJ,et al.The U.K.Working Party′s Diagnostic Criteria Atopic Dermatitis.I.Derivation of a minimum set of discriminators for atopic dermatitis[J].Br J Dermatol,1994,131(3):383-396.

[6] Kunz B,Oranje AP,Labreze L,et al.Clinical validation and guidelines for the SCORAD index:consensus report of the European Task Force on Atopic Dermatitis[J].Dermatology,1997,195(1):10-19.

[7] 趙京霞,底婷婷,王 燕,等.IL-23/IL-17炎癥軸在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚損害中的作用[J].中國(guó)病理生理雜志,2013,29(6):1 086-1 094.

[8] 謝 華,何韶衡.IL-17,18,23,25在變態(tài)反應(yīng)性疾病中的作用[J].中國(guó)病理生理雜志,2004,20(10):1 942-1 946.

[9] 沈 斌,屠巧峰,冷建杭,等.特應(yīng)性皮炎患者外周血輔助性T細(xì)胞17與白介素17的檢測(cè)[J].中華皮膚科雜志,2012,45(2):106-109.

[10]馬 蕾,薛海波,管秀好,等.特應(yīng)性皮炎患者外周血和皮損miR-155的表達(dá)及其與Th17細(xì)胞相關(guān)性研究[J].中華皮膚科雜志,2014,47(1):15-18.

[11]He R,Oyoshi MK,Jin H,et al.Epicutaneous antigen exposure induces a Th17 response that drives airway inflammation after inhalation challenge[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(40):15 817-15 822.

[12]Jin H,He R,Oyoshi M,et al.Animal models of atopic dermatitis[J].J Invest Dermatol,2009,129(1):31-40.

[13]O′Connell RM,Kahn D,Gibson WS,et al.MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development[J].Immunity,2010,33(4):607-619.

[14]Zhou H,Huang X,Cui H,et al.miR-155 and its star-form partner miR-155*cooperatively regulate type I interferon production by human plasmacytoid dendritic cells[J].Blood,2010,116(26):5 885-5 894.

[15]Yao R,Ma YL,Liang W,et al.MicroRNA-155 modulates Treg and Th17 cells differentiation and Th17 cell function by targeting SOCS1[J].PLoS One,2012,7(10):e46 082.

Expression and clinical significance of T helper cell 17 and its related regulatory control factors in patients with atopic dermatitis

WANGLu-mei,ZENGBi-bing,LIJun-jie,LUWan-jiao,ZHANGBing

(DepartmentofDermatology,DongguanPeople′sHospital,Dongguan523000,China)

Objective To explore the expression and clinical significance of T helper cell 17(Th17) and its related regulatory control factors including interleukin-23(IL-23) and microRNA-155(miR-155) in peripheral blood of the patients with atopic dermatitis(AD).Methods A total of 54 patients with AD and 30 healthy individuals were enrolled.Then the proportion of Th17 in peripheral leukocytes,and the expression levels of IL-23 and miR-155 in peripheral blood were detected in all participants.The sensitivity and specificity of the three factors for the diagnosis of AD were analyzed.And the correlation of the three factors with AD severity[scoring atopic dermatitis index(SCORAD)] was assessed.Results The proportion of Th17,and the expression levels of IL-23 and miR-155 of AD patients were significantly higher than those of healthy individuals(P<0.05).The sensitivities of proportion of Th17,IL-23 and miR-155 for the diagnosis of AD were 77.64%,65.30% and 82.19%,respectively,while the specificities were 62.81%,74.28% and 77.06%,respectively.The proportion of Th17,IL-23 and miR-155 expression levels positively correlated with SCORAD score (P<0.05).Conclusion IL-23 and miR-155 may be involved in regulating the expression of Th17 cell in AD.Th17 cell and its related regulatory factors still can not act as the diagnostic indicator for AD,but they are helpful for evaluating the severity of disease.

Atopic dermatitis,T helper cell 17,Interleukin-23,microRNA-155

廣東省東莞市科技計(jì)劃醫(yī)療衛(wèi)生類(lèi)科研項(xiàng)目(201410515000050)

王魯梅(1972～)，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：白癜風(fēng)，特應(yīng)性皮炎。

李俊杰(1964～)，男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：皮膚美容，E-mail：RDPbird4451@163.com。

R 593.2

A

0253-4304(2016)03-0342-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.03.13

2015-12-19

2016-02-15)