梁聯(lián)哨 鄧靜敏 鄒小英 陳曉麗 韋 旋 龔 臣 梁斯巧 陳長榮

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸疾病研究所，南寧市 530021，E-mail：lianglianshao@163.com)

論著·臨床研究

中性粒細胞性慢性持續(xù)期哮喘患者治療前后外周血和誘導痰中嗜酸性粒細胞陽離子蛋白水平及其臨床意義▲

梁聯(lián)哨 鄧靜敏 鄒小英 陳曉麗 韋 旋 龔 臣 梁斯巧 陳長榮

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸疾病研究所，南寧市 530021，E-mail：lianglianshao@163.com)

目的 觀察中性粒細胞性哮喘(NA)慢性持續(xù)期患者外周血、痰嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)水平及吸入治療對其的影響。方法 未經(jīng)過規(guī)范化治療的慢性持續(xù)期哮喘患者26例，據(jù)誘導痰細胞分類計數(shù)結果分為NA組13例及嗜酸性粒細胞哮喘(EA)組13例，均給予吸入布地奈德福莫特羅粉治療，治療前及治療1個月時檢測血、痰ECP水平，且檢測NA組外周血及痰標本中炎癥細胞分類計數(shù)及肺功能。結果 治療前及治療后，兩組血、痰ECP水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，治療1月后兩組血、痰ECP水平與治療前比較，差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后NA組痰中性粒細胞(NEU)百分比、NEU計數(shù)較前降低(P<0.05)，第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%)、第1秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比、最大呼氣流速占預計值百分比(PEF%)及75%和50%容量時的呼氣流速-容量曲線較前上升(P<0.05)，但血炎癥細胞分類計數(shù)無明顯變化(P>0.05)。NA組血ECP水平與NEU百分比呈正相關(P<0.05)；痰標本的ECP水平與嗜酸性粒細胞百分比呈正相關(P<0.05)，痰ECP水平、痰NEU百分比均與FEV1%、PEF%等呈負相關(P<0.05)。結論 NA慢性持續(xù)期患者外周血及痰上清液中均有ECP表達，且表達水平與EA慢性持續(xù)期患者無差異，并與氣流受限密切相關；聯(lián)合吸入治療初期對NA患者氣道中性粒細胞炎癥有一定作用，但尚不能降低ECP水平。

支氣管哮喘；中性粒細胞哮喘；慢性持續(xù)期；嗜酸性粒細胞陽離子蛋白；外周血；誘導痰；吸入治療；布地奈德；福莫特羅

支氣管哮喘(哮喘)是由嗜酸性粒細胞(eosinophile，EOS)、中性粒細胞(neutrophil，NEU)等多種炎癥細胞以及細胞因子共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。既往有研究證實了EOS是哮喘慢性氣道炎癥關鍵的效應細胞之一[1]。但是近年，有學者發(fā)現(xiàn)NEU與慢性持續(xù)期哮喘、重癥哮喘、致命性哮喘及激素療效差的哮喘等密切相關，甚至在輕中度哮喘患者中也可出現(xiàn)NEU升高[2]，這提示NEU在哮喘發(fā)病中可能也起關鍵作用，且重要性并不亞于EOS。根據(jù)氣道內炎癥細胞的不同，有學者提出將哮喘分為嗜酸粒細胞性哮喘(eosinophilic asthma，EA)和非EA，或EA、中性粒細胞性哮喘(neutrophilic asthma，NA)、混合細胞性哮喘和寡細胞性哮喘，但目前單純針對NA的病例研究鮮有報告[3]，NEU與哮喘發(fā)病的關系及作用機制均未完全闡明。

嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)是由活化的EOS釋放的一種堿性蛋白，是EOS功能和激活的標志，在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用。諸多有關哮喘與ECP關系的研究表明，過敏性哮喘組患者ECP水平高于正常組，且ECP水平在不同分期、不同嚴重程度哮喘患者中存在差異[4-6]。ECP不只存在于EOS的脫顆粒中，NEU也可表達及分泌ECP[7-9]，由此推測ECP可能參與了NA的發(fā)病。本研究比較了NA患者與EA患者的ECP水平，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月至2014年9月就診于我院哮喘專科門診或呼吸內科住院部的26例慢性持續(xù)期哮喘患者，納入標準：診斷及分期標準均符合《支氣管哮喘防治指南》中的標準[10]，且1周內無呼吸道及其他部位感染；在研究前至少1月無全身激素治療史；無吸煙史或戒煙至少達1年。排除標準：合并呼吸系統(tǒng)其他疾病、惡性腫瘤、心肝腎功能不全、自身免疫性疾病及妊娠者等。根據(jù)患者誘導痰中細胞分類計數(shù)中NEU或EOS占有核非鱗狀細胞的百分比結果進行分型[3，11]，將痰NEU≥61%且EOS<3%設為NA組，痰EOS≥3%且NEU<61%為EA組。NA組13例，其中男7例、女6例，平均年齡(42.2±15.5)歲；EA組13例，其中男3例，女10例，平均年齡(40.4±9.2)歲，兩組性別及年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均具有可比性。

1.2 方法 所有哮喘患者均按照支氣管哮喘全球防治倡議給予布地奈德福莫特羅粉吸入劑(購自瑞典阿斯利康制藥有限公司，生產(chǎn)批號：PBNG)規(guī)范治療，分別于治療前和治療1個月時抽血、誘導痰檢測ECP水平，同時NA組行血、誘導痰炎癥細胞分類計數(shù)及肺功能檢查。

1.2.1 血及痰炎癥細胞計數(shù)、血及痰ECP水平檢測：隨機抽外周靜脈血5 ml，其中2 ml用于血細胞計數(shù)，采用日本Sysmex公司SF-3000型自動全血分析儀進行檢測，嚴格按照儀器的操作步驟進行；將其余3 ml靜脈血3 000 r/min離心15 min，沉淀后將血清分裝凍存，待檢測血清ECP水平。痰液收集及處理參照中華醫(yī)學會呼吸分會推薦方法[12]?；颊哽F化吸入2%高滲鹽水，收集深部痰，加入4倍體積0.1%二硫蘇糖醇、水浴，過濾，取少量過濾液行細胞計數(shù)，余離心沉淀，上清液分裝凍存待檢，沉淀涂片染色，行細胞分類計數(shù)。血、痰ECP水平使用酶聯(lián)免疫吸附法進行測定，嚴格按照試劑盒(購于武漢華美生物工程公司，生產(chǎn)批號L09012096)說明書操作。

1.2.2 肺功能檢查：使用肺功能儀(購自德國Jaeger公司，MasterScreen系列)測定第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(percentage of forced expiratory volume in one second to the predicted value，F(xiàn)EV1%)、第1秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比(percentage of forced vital capacity in one second to forced vital capacity，F(xiàn)EVl/FVC)、最大呼氣流速占預計值百分比(percentage of peak expiratory flow rate to the predicted value，PEF% )、75%和50%容量時的呼氣流速-容量曲線(maximal midexpiratory flow curve，MMEF75/25)。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，治療前后組均數(shù)比較采用配對t檢驗，相關分析采用Pearson相關系數(shù)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者治療前后血清和痰的ECP水平比較 治療前及治療后兩組外周血及誘導痰上清液的ECP水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后兩組外周血及誘導痰上清液的ECP水平與治療前比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組血、痰ECP水平比較(x±s，pg/ml )

2.2 NA組患者治療前后外周血和誘導痰白細胞分類計數(shù)比較 規(guī)范化治療1個月后，NA組僅痰NEU百分比、NEU絕對值較治療前降低(P<0.05)，其余痰及外周血各指標治療前后差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 NA組外周血及誘導痰白細胞分類計數(shù)治療前后比較(x±s，n=13)

2.3 NA組患者治療前后肺功能變化 治療前NA組患者呈現(xiàn)阻塞性通氣功能障礙，治療后氣流受限程度有所改善(P<0.05)，見表3。

表3 NA組肺功能治療前后比較(x±s，n=13)

2.4 相關性分析 (1)NA組中，血ECP水平與血NEU百分比呈正相關(r=0.621，P=0.024)，與血WBC計數(shù)、NEU絕對值、EOS百分比、EOS絕對值及肺功能各項指標之間均無明顯相關性(P>0.05)。(2)痰ECP水平與痰EOS百分比呈正相關(r=0.649，P=0.016)，與FEV1%、PEF%為負相關(r=-0.593，P=0.033；r=-0.607，P=0.028)，與WBC計數(shù)、NEU絕對值、EOS百分比、EOS絕對值及其他肺功能指標不相關(P>0.05)。(3)痰NEU百分比與FEV1%(r=-0.906，P=0.000)、FEV1/FVC(r=-0.604，P=0.029)、PEF%(r=-0.731，P=0.005)、MMEF75/25%(r=-0.683，P=0.010)呈負相關。

3 討 論

既往對EA研究較多，其多為過敏性哮喘，氣道炎癥特征以EOS、CD4+T細胞為標志，而NA氣道炎癥以NEU為特征，發(fā)病機制尚未完全明確，與EA機制的差異亦未明確。同時，研究發(fā)現(xiàn)，作為EOS活化的特異性標志的ECP亦可存在于成熟NEU中，雖然未活化的NEU不能合成ECP，但可以捕獲環(huán)境中的ECP，當其活化后即可釋放ECP[8]。Monteseirin等[9]的體外研究結果顯示活化后的NEU可以檢測到ECP mRNA的存在。但NA患者的ECP水平如何，與EA患者有無差異目前尚無臨床病例研究報告。

本研究結果顯示，NA組慢性持續(xù)期哮喘患者血清及痰液中均可檢測到一定水平的ECP，說明在NA慢性持續(xù)期患者無論是全身還是氣道局部均有ECP存在，且其表達水平與EA患者并無差異(P>0.05)。分析其可能的原因如下：(1)ECP的表達與釋放并不單純依賴于EOS，其他細胞如NEU也可表達及分泌ECP。(2)無論是EOS還是NEU，ECP表達和釋放水平均不依賴于兩者的數(shù)量。雖然兩者在NA及EA兩種哮喘表型中各自所占比例不同，但兩者均存在于兩種哮喘表型中，因此兩組ECP水平無明顯差異。由此推測，ECP在NA及EA的發(fā)病中均有可能發(fā)揮重要作用。

目前已明確過敏性支氣管哮喘患者血清ECP水平高于正常對照，在急性發(fā)作期的水平高于緩解期。在對不同嚴重程度哮喘患者的病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，重度組ECP水平升高最明顯，并與肺功能持續(xù)氣流受限呈明顯負相關，經(jīng)治療后ECP水平可明顯下降，提示ECP與哮喘發(fā)病、嚴重程度有關，可作為哮喘嚴重程度評估及預后、療效監(jiān)測的良好指標[3-6]。

本研究結果顯示，NA組痰ECP水平與痰EOS百分比呈正相關，血ECP水平與血NEU百分比呈正相關(P<0.05)，提示著ECP可能通過EOS及NEU參與了NA氣道局部甚至全身反應機制，且可能ECP在氣道局部更多是與EOS相關，而在全身與NEU相關性更大，具體原因有待進一步研究。治療前NA組患者呈現(xiàn)阻塞性通氣功能障礙，治療后肺功能指標有所上升(P<0.05)，提示經(jīng)規(guī)范治療后可明顯好轉。值得注意的是，NA組痰NEU百分比及ECP水平與FEV1%、PEF%等均呈負相關(P<0.05)，這與其他文獻報告的結果一致[5，13]，提示在慢性持續(xù)期NA患者中，氣道NEU及ECP可能參與氣流受限機制。治療1月后，NA組痰NEU百分比、NEU較前明顯降低，肺功能有所改善(P<0.05)，但ECP水平無明顯下降(P>0.05)，提示聯(lián)合吸入治療初期對NA患者局部氣道炎癥可能僅部分有效，其首先改善的是炎癥細胞的數(shù)量，而對ECP水平尚無顯著影響。但是，隨著療程的延長，ECP水平能否有所降低需進一步觀察。

綜上所述，ECP存在于慢性持續(xù)期NA患者外周血及痰上清液中，且表達水平與慢性持續(xù)期EA患者無差異，并與氣流受限密切相關；聯(lián)合吸入治療初期對NA患者氣道中性粒細胞炎癥有一定作用，但尚不能降低ECP水平，間接提示了長期規(guī)范治療的重要性。

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Peripheral blood and induced sputum levels of eosinophil cationic protein in patients with chronic persistent neutrophilic asthma before and after treatment and its clinical significance

LIANGLian-shao,DENGJing-min,ZOUXiao-ying,CHENXiao-li,WEIXuan,GONGChen,LIANGSi-qiao,CHENChang-rong

(InstituteofRespiratoryDisease,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To observe the peripheral blood and sputum levels of eosinophilic cationic protein(ECP) in the patients with chronic persistent neutrophilic asthma(NA) as well as the effect of inhalation therapy on ECP levels.Methods Twenty-six patients with chronic persistent asthma who were not treated by standard therapy were divided into NA group(n=13) and eosinophilic asthma(EA) group(n=13) based on the sputum cell counts.Both groups were administered inhaled budesonide/formoterol.Before and after one month of treatment,the peripheral blood and sputum ECP were detected in the two groups.The samples of peripheral blood and sputum were detected for inflammatory cell counts in NA group,and lung function examination was performed as well.Results There was no statistical difference in the blood or sputum level of ECP between two groups before and after treatment(P>0.05).In each group,there was no statistical difference between the blood level or sputum level of ECP before and after one month of treatment(P>0.05).In NA group,the percentage and counts of sputum neutrophil decreased,and the percentage of forced expiratory volume in one second to the predicted value(FEV1%),percentage of forced vital capacity in one second to forced vital capacity,percentage of peak expiratory flow rate to the predicted value(PEF%),and maximal midexpiratory flow curve elevated after treatment(P<0.05),but no statistical change was observe in inflammatory cell counts of blood(P>0.05).In NA group,the blood ECP level positively correlated with the percentage of blood neutrophil(P<0.05),the sputum ECP level positively correlated with the percentage of sputum eosinophile (P<0.05),and either the sputum ECP level or the percentage of blood neutrophil negatively correlated with FEV1% and PEF%(P<0.05).Conclusion ECP exists in the peripheral blood and supernatant sputum of the patients with chronic persistent NA,and there is no significant difference in the ECP level between NA and EA.The ECP level is related closely with airflow limitation in patients with chronic persistent NA.Combined inhalation therapy has a certain effect on airway neutrophil inflammation in patients with NA at the initial stage of treatment,but it can not reduce the ECP level. 【Key words】 Bronchial asthma,Neutrophilic asthma,Chronic persistent stage,Eosinophilic cationic protein,Peripheral blood,Induced sputum,Inhalation therapy,Budesonide,Formoterol

廣西高?？茖W技術研究項目(YB2014068)

梁聯(lián)哨(1988～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：支氣管哮喘。

鄧靜敏(1970～)，女，博士，教授，研究方向：支氣管哮喘，E-mail：Ldyy666@163.com。

R 562.25

A

0253-4304(2016)03-0324-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.03.08

2015-12-10

2016-02-23)