孔 山 忽勝和 楊新原 趙衛(wèi)東

(大理大學1 臨床醫(yī)學院檢驗診斷學教研室，2 附屬醫(yī)院檢驗科，大理市 671000，E-mail：185354177@qq.com)

論著·臨床研究

呼吸道感染嬰幼兒肺炎鏈球菌的耐藥性及青霉素結合蛋白基因突變分析▲

孔 山1忽勝和2楊新原2趙衛(wèi)東1

(大理大學1 臨床醫(yī)學院檢驗診斷學教研室，2 附屬醫(yī)院檢驗科，大理市 671000，E-mail：185354177@qq.com)

目的 分析呼吸道感染嬰幼兒肺炎鏈球菌的耐藥性及青霉素結合蛋白基因(PBPs)突變情況。方法 收集呼吸道感染嬰幼兒痰或咽拭子標本中分離出的24株肺炎鏈球菌，進行菌株鑒定和藥敏試驗。對篩選出的耐青霉素肺炎鏈球菌行耐藥性分析，并提取菌株DNA后分析PBPs基因突變情況。結果 24株肺炎鏈球菌中，青霉素不敏感菌株有13株，占54.2%；13株青霉素不敏感菌株對對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸和頭孢呋辛不敏感率較高，分別為100%、76.9%和76.9%；對頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢吡肟的不敏感率較低，分別為46.2%、38.5%和30.8%；對美羅培南和萬古霉素的不敏感率最低，分別為15.4%和0。13株青霉素不敏感菌株未發(fā)現pbp1a基因突變菌株，5株存在pbp2b基因突變，占38.5%。結論 青霉素不敏感肺炎鏈球菌存在對多種抗生素耐藥情況，而pbp2b基因突變可能是導致肺炎鏈球菌耐藥的重要原因，應加強肺炎鏈球菌耐藥性及PBP基因突變監(jiān)測。

肺炎鏈球菌；青霉素；青霉素結合蛋白；耐藥性

肺炎鏈球菌在人群中可以引起中耳炎、大葉性肺炎和腦膜炎等感染性疾病，尤其是在嬰幼兒中[1]。青霉素自面世以來被廣泛應用于治療肺炎鏈球菌肺炎。自20世紀60年代耐青霉素肺炎鏈球菌(penicillin resistantStreptococcuspneumoniae，PRSP)出現，耐藥菌株的流行與擴散對青霉素的臨床治療有效率造成很大影響。更為嚴重的是，對青霉素耐藥的菌株會對其他β-內酰胺類藥物造成交叉耐藥。青霉素結合蛋白(penicillin-binding proteins，PBPs)編碼pbp基因突變是導致PRSP的主要原因[2]。為了解嬰幼兒患者肺炎鏈球菌pbps基因突變與抗生素耐藥之間的關系，筆者對24株分離自嬰幼兒(≤5歲)的肺炎鏈球菌進行研究，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2013年3月至2014年10月大理大學大理附屬醫(yī)院送檢的呼吸道感染嬰幼兒的痰或咽拭子標本中分離肺炎鏈球菌27株，其中有3株在保存過程中死亡，剩余24株。

1.2 菌株分離、鑒定與保存 無菌采集標本1.5 h內即接種于哥倫比亞血瓊脂平板(生物梅里埃公司，批號43041)，置含5% CO2的培養(yǎng)箱中37℃孵育24～48 h，根據菌落特征，革蘭染色后顯微鏡下觀察形態(tài)，行奧普托欣敏感試驗進行鑒別，再用全自動微生物鑒定儀(VITEK-2 Compact)(法國生物梅里埃公司)進行鑒定。挑取純化后的肺炎鏈球菌菌落至含30%甘油的腦心浸液肉湯(青島海博生物公司，批號HB8297-1)中，-80℃冷凍保存。

1.3 藥敏試驗 將保存的菌株從-80℃中取出，置于37℃水浴鍋中約3 min，迅速解凍，然后將菌液接種于哥倫比亞血瓊脂平板復蘇細菌備用。用苯唑西林K-B紙片擴散法進行青霉素敏感試驗，折點按美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)M2-A11標準[3]；采用微量肉湯稀釋法，按照CLSI M7-A9標準中非腦膜炎折點對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、美羅培南和萬古霉素等8種常用抗生素進行藥敏試驗。質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC 49619(購自上海樂訊生物科技公司)。

1.4 菌株DNA的提取 將保存于-80℃的菌株取出，至37℃水浴中2 min，快速解凍，加到腦心浸液肉湯中，置于5% CO2、37℃震蕩培養(yǎng)箱中搖菌18 h，用細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，DP302)，按照說明書步驟提取肺炎鏈球菌DNA。

1.5 PBPs基因PCR擴增 用2×Taq PCR MasterMix 試劑盒(北京天根生化科技有限公司，KT201)進行PCR。以提取的肺炎鏈球菌DNA為模板進行PCR擴增，pbp基因引物序列及實驗參數如下：(1)pbp1a-F：5′-3′ GAA CTT CAA GAC AAG GCA GT，pbp1a-R：5′-3′ GTA AAC ACA AGC CAA GAC AC；熱循環(huán)參數為：94℃預變性3 min，然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，最后72℃延長5 min，共35個循環(huán)，產物1.4 kb。(2)pbp2b-F：5′-3′ GAT CCT CTA AAT GAT TCT CAG GTG G，pbp2b-R：5′-3′ CCA TTA GCT TAG CAA TAG GTG TTG G；熱循環(huán)參數為：94℃預變性3 min，然后94℃ 1 min，55℃ 2 min，72℃ 2 min，最后72℃延長5 min，共30個循環(huán)，產物1.5 kb。

1.6 PCR產物電泳及測序 PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，DNA分子量標準Marker V，包含6個條帶，分別為200、400、700、1 000、1 500、2 000 bp(北京天根生化科技有限公司，MD105)。PCR產物送至鉑尚生物技術(上海)公司進行測序，所得序列在GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)使用BLAST軟件與青霉素敏感肺炎鏈球菌R6(基因登錄號：NC-003098)進行序列比對分析[4]。

2 結 果

2.1 青霉素敏感試驗 24株肺炎鏈球菌中，對苯唑西林敏感菌11株，占45.8%；中度敏感菌株10株，占41.7%；耐藥菌3株，占12.5%；不敏感率為54.2%(13/24)。

2.2 藥敏試驗結果 13株PRSP對8種常用抗生素的耐藥結果顯示，PRSP對氨芐西林的耐藥率最高，其次為阿莫西林/克拉維酸鉀、頭孢呋辛，對萬古霉素均敏感，見表1。

表1 13株青霉素不敏感PRSP對常用抗生素的藥敏情況(株，%)

2.3 PRSP基因分型 青霉素耐藥及中度敏感的13株PRSP中，全部擴增出了pbp1a基因和pbp2b基因，將測序結果與R6標準菌株序列對比發(fā)現，有5株存在pbp2b基因突變，占38.5%(5/13)，其中3株耐青霉素肺炎鏈球菌的pbp2b基因全部存在突變位點，占100%(3/3)，未發(fā)現pbp1a基因突變菌株。存在pbp2b基因的突變株PBP基因PCR產物電泳結果見圖1、圖2。

圖1 pbp1a基因型代表菌株PCR產物電泳結果

注：M代表DNA Marker，N為陰性對照，2、5、6、7、10分別表示第2、5、6、7、10號菌株。

圖2 pbp2b基因型代表菌株PCR產物電泳結果

注：M代表DNA Marker，N為陰性對照，2、5、6、7、10分別表示第2、5、6、7、10號菌株。

2.4pbp2b基因氨基酸序列比對 有青霉素耐藥菌的PBP2b氨基酸序列都存在SSN(保守序列)附近變異，為T→A(蘇氨酸→丙氨酸)，pbp2b基因氨基酸序列比對結果見表2。

表2 5株pbp2b基因變異肺炎鏈球菌氨基酸序列與R6標準菌序列對比結果

3 討 論

肺炎鏈球菌是一種常見的造成機會致病的陽性球菌，主要寄居于人體鼻咽部，嬰幼兒是該菌的主要易感人群[1]。感染該菌后常會導致兒童肺炎及腦膜炎等疾病。青霉素是治療肺炎鏈球菌感染的首選藥物。目前，國內外關于耐青霉素肺炎鏈球菌的文獻報告日益增多。一項包括歐洲和南美多個臨床中心的數據表明，在兒科患者人青霉素耐藥率為35%～86%[5]。我國一項包括12所教學醫(yī)院的數據表明，2005年至2010年間，青霉素耐藥菌株從28.6%增加至59.5%，而在5歲以下兒童患者中，青霉素耐藥株的分離率為70.6%[6]。崔建邦等[7]報告重慶兒童肺炎鏈球菌青霉素耐藥率為3.32%，不敏感率為47.30%。本實驗中，肺炎鏈球菌青霉素耐藥率為12.5%，不敏感率為54.2%。以上肺炎鏈球菌耐藥率不相同可能與不同地區(qū)用藥習慣有關。

本研究13株PRSP對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸和頭孢呋辛耐藥率較高，分別為61.5%、46.2%和38.5%，不敏感率分別為100.0%、76.9%和76.9%，因此，這些藥物用于肺炎鏈球菌肺炎治療時應慎重選擇；對頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢吡肟的耐藥率相對較低，均為15.4%，但是不敏感率分別為46.2%、38.5%和30.8%，提示應密切監(jiān)測以避免不敏感菌株的增加；對美羅培南和萬古霉素的敏感性高，分別為86.4%和100.0%，說明這兩種抗生素對肺炎鏈球菌的抗菌能力較強。

近年來，研究發(fā)現β-內酰胺類抗生素通過與PBPs中的絲氨酸親核基團結合，生成較穩(wěn)定的酰胺酶中間產物，以此來抑制細菌增殖[8]。PBPs主要包括6個亞單位，分別為PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2b、PBP2x、PBP3[9]。其中PBP1a突變與高水平的耐藥有關[10]，而PBP2b突變與低水平耐藥有關，而肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥主要是由于PBP2b基因的突變導致與青霉素親和力下降所引起[11]。本研究結果顯示，在13株PRSP中，均擴增出了pbp1a基因和pbp2b基因，通過與不耐青霉素的肺炎鏈球菌R6序列對比發(fā)現，pbp1a基因未發(fā)現突變，可能是由于收集的菌株較少造成的；而pbp2b基因突變在3株耐藥株中都存在，在2株對青霉素中度敏感菌株中存在。與其他研究結果[12]類似的是，所有青霉素耐藥菌的PBP2b氨基酸序列都存在SSN(保守序列)附近變異，為T→A(蘇氨酸→丙氨酸)，提示pbp2b基因突變可能是造成肺炎鏈球菌對青霉素及其他β-內酰胺類抗生素耐藥的重要原因。

綜上所述，肺炎鏈球菌耐藥性問題嚴峻，尤其是不敏感菌株的比例較大，應該加強日常PRSP耐藥性以及對耐藥基因突變的監(jiān)測，及時掌握PRSP的耐藥趨勢及耐藥基因突變情況，同時加強與臨床醫(yī)師溝通，共同控制肺炎鏈球菌耐藥株的產生與流行。

[1] Yao KH,Yang YH.Streptococcus pneumoniae diseases in Chinese children:past,present and future[J].Vaccine,2008,26(35):4 425-4 433.

[2] Zapun A,Contreras-Martel C,Vernet T.Penicillin-binding proteins and beta-lactam resistance[J].FEMS Microbiol Rev,2008,32(2):361-385.

[3] Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard-Eleventh Edition.CLSI document M02-A11 [M].Wayne,PA.2012:26-28.

[4] Hoskins J,Alborn WE Jr,Arnold J,et al.Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6[J].J Bacteriol,2001,183(19):5 709-5 717.

[5] Brandon M,Dowzicky MJ.Antimicrobial susceptibility among Gram-positive organisms collected from pediatric patients globally between 2004 and 2011:results from the Tigecycline Evaluation and Surveillance Trial[J].J Clin Microbiol,2013,51(7):2 371-2 378.

[6] Zhao C,Sun H,Wang H,et al.Antimicrobial resistance trends among 5 608 clinical Gram-positive isolates in China:results from the Gram-Positive Cocci Resistance Surveillance program(2005-2010)[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2012,73(2):174-181.

[7] 崔建邦,鄭玉強,景春梅,等.241例重慶地區(qū)急性呼吸道感染患兒肺炎鏈球菌耐藥性分析[J].重慶醫(yī)科大學學報,2015,40(3):459-462.

[8] Hakenbeck R,Brückner R,Denapaite D,et al.Molecular mechanisms of β-lactam resistance in Streptococcus pneumoniae [J].Future Microbiol,2012,7(3):395-410.

[9] Albarracin Orio AG,Pias GE,Cortes PR,et al.Compensatory evolution of pbp mutations restores the fitness cost imposed by beta-lactam resistance in Streptococcus pneumoniae[J].PLoS Pathog,2011,7(2):e1002000.

[10]Leach AJ,Morris PS,Smith-Vaughan H,et al.In vivo penicillin MIC drift to extremely high resistance in Serotype 14 Streptococcus pneumoniae persistently colonizing the nasopharynx of an infant with chronic suppurative lung disease:a case study[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(11):3 648-3 649.

[11]Sadeghi J,Ahamadi A,Douraghi M,et al.Molecular analysis ofpbp2bin Streptococcus pneumonia isolated from clinical and normal flora samples[J].Curr Microbiol,2015,70(2):206-211.

[12]張春玲,許亞亞,牛 津,等.耐β-內酰胺類抗生素肺炎鏈球菌青霉素結合蛋白PBPs的氨基酸基因變異[J].中國微生態(tài)學雜志,2012,24(12):1 088-1 092.

Drug resistance and mutation of penicillin-binding proteins gene ofStreptococcuspneumoniaein children with respiratory infection

KONGShan1,HUSheng-he2,YANGXin-yuan2,ZHAOWei-dong1

(1DepartmentofLaboratoryDiagnostics,ClinicalMedicineCollege,DaliUniversity,Dali671000,China; 2DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofDaliUniversity,Dali671000,China)

Objective To analyze the drug resistance and mutation of penicillin-binding proteins(PBPs) gene ofStreptococcuspneumoniae(S.pneumoniae) in children with respiratory infection.Methods Twenty-four strains ofS.pneumoniaewere obtained from sputum or throat swab of children with respiratory infection for the identification of bacterial strain and drug sensitive test.Then the drug resistance was analyzed in the screened penicillin resistantStreptococcuspneumonia(PRSP),and DNA was extracted from these strains to analyze the mutation of PBPs gene.Results Among 24 strains ofS.pneumoniae,13(54.2%) strains were PRSP.The unsensitive rates of the 13 strains of PRSP to ampicillin,amoxicillin-clavulanic acid and cefuroxime were quite high,were 100%,76.9% and 76.9% respectively.The unsensitive rates of PRSP to cefotaxime,ceftriaxone and cefepime were low,were 46.2%,38.5% and 30.8% respectively.And the unsensitive rates of PRSP to meropenem and vancomycin were the lowest,were 15.4% and 0 respectively.Among 13 strains of PRSP,nopbp1amutation strain was found,and 5pbp2bmutation strains were found,accounting for 38.5%.Conclusion PRSP is resistant to multiple antibiotics,andpbp2bmutation may be an important factor that causesS.pneumoniaeto be drug resistant.The monitoring for drug-resistance and PBPs gene mutation ofS.pneumoniashould be strengthened.

Streptococcuspneumoniae,Penicillin resistantStreptococcuspneumonia,Penicillin-binding protein; Drug resistance

云南省科技廳應用基礎研究青年項目(2013FD095)

孔山(1972～)，男，在職研究生，講師，研究方向：臨床檢驗診斷學。

趙衛(wèi)東(1983～)，男，在讀博士研究生，助教，研究方向：臨床病原微生物，E-mail：wdzhao1229@foxmail.com。

R 378.14

A

0253-4304(2016)05-0632-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.05.09

2016-01-20

2016-04-07)