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        下調(diào)蛋白磷酸酯酶2A活性對(duì)抑郁癥大鼠癥狀改善效果及其作用機(jī)制▲

        2016-02-17 06:01:23王凱華周欣梅
        廣西醫(yī)學(xué) 2016年5期
        關(guān)鍵詞:側(cè)腦室激酶磷酸化

        蒙 冰 任 丁 王凱華 周欣梅

        (廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,南寧市 530011,E-mail:67232624@qq.com)

        論著·基礎(chǔ)研究

        下調(diào)蛋白磷酸酯酶2A活性對(duì)抑郁癥大鼠癥狀改善效果及其作用機(jī)制▲

        蒙 冰 任 丁 王凱華 周欣梅

        (廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,南寧市 530011,E-mail:67232624@qq.com)

        目的 探討下調(diào)蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活性對(duì)抑郁模型大鼠癥狀改善效果及其作用機(jī)制。方法 以慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁癥大鼠模型30只,分為對(duì)照A組、對(duì)照B組、低濃度岡田酸(OA)組、中濃度OA組、高濃度OA組及最優(yōu)濃度OA組各5只;檢測(cè)對(duì)照A組、對(duì)照B組、低濃度OA組、中濃度OA組、高濃度OA組PP2A的活性,篩選最優(yōu)濃度OA;對(duì)照A組及對(duì)照B組分別從側(cè)腦室微量注射無(wú)菌生理鹽水5 μl,低濃度OA組、中濃度OA組、高濃度OA組、最優(yōu)濃度OA組分別從側(cè)腦室注射濃度為5 nmol/L、10 nmmol/L、20 nmol/L及最優(yōu)濃度OA溶液各5 μl。對(duì)對(duì)照B組及最優(yōu)濃度OA組進(jìn)行蔗糖水消耗試驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)、體重及水迷宮等行為學(xué)測(cè)試,檢測(cè)去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)、皮質(zhì)醇(CORT)水平,檢測(cè)腦組織中酪氨酸羥化酶(TH)、細(xì)胞外信號(hào)激酶(ERK)、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)及糖原合酶激酶3β(GSK-3β)的蛋白水平及磷酸化水平檢測(cè)。結(jié)果 OA組的濃度越高PP2A的活性越低(P<0.01),將20 nmol/L OA組設(shè)為最優(yōu)濃度OA組;最優(yōu)濃度OA組曠野實(shí)驗(yàn)的水平及垂直得分均高于對(duì)照B組(P<0.05);隨觀(guān)察時(shí)間延長(zhǎng),最優(yōu)濃度OA組的糖水飲用量、體重增加,水迷宮逃避潛伏期縮短(P<0.05),且在給藥后第8、15、22天,與對(duì)照B組比較,其糖水飲用量、體重均較高,水迷宮逃避潛伏期較短(P<0.05);最優(yōu)濃度OA組NE、5-HT水平,TH、ERK、AKT蛋白水平以及TH、ERK、AKT、GSK-3β的磷酸化水平均高于對(duì)照B組(P<0.05);最優(yōu)濃度OA組CORT水平以及GSK-3β蛋白水平均低于對(duì)照B組(P<0.05)。結(jié)論 PP2A的活性隨OA濃度升高而降低,下調(diào)PP2A活性可能通過(guò)調(diào)節(jié)TH、ERK 以及 AKT/GSK-3β信號(hào)途徑,從而改善大鼠的抑郁癥狀。

        抑郁癥;蛋白磷酸酯酶A;糖原合酶激酶3β;酪氨酸羥化酶;細(xì)胞外信號(hào)激酶;大鼠

        抑郁癥作為一種較為多發(fā)的精神障礙疾病,隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展和人們精神壓力的增大,全球抑郁癥患者人數(shù)正呈不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì),最新的研究表明,全球抑郁癥的發(fā)病率高達(dá)10%~15%[1],已然成為世界第四大疾病,據(jù)推算,到2020年,抑郁癥極有可能僅次于心臟疾患成為影響人們健康的第二大疾患[2]。抑郁癥已經(jīng)成為當(dāng)前對(duì)人們?cè)谏?、工作中的幸福指?shù)造成嚴(yán)重影響的重要不良因素,甚至出現(xiàn)自殺而危及生命。

        抑郁癥主要表現(xiàn)為情緒障礙、自主神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙、認(rèn)知功能障礙、運(yùn)動(dòng)抑制等。由于目前抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確,故缺乏針對(duì)該疾病靶點(diǎn)有效的防治措施。因此,進(jìn)一步明確抑郁癥的發(fā)病機(jī)制,尋找更為切實(shí)有效的治療方法則顯得尤為重要。最近,Budziszewska等[3]報(bào)告,蛋白磷酸酯酶 2A(protein phosphatase 2A,PP2A) 蛋白水平在產(chǎn)前應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠模型的海馬和皮質(zhì)中明顯升高,分別約70%和25%。這提示 PP2A可能參與了抑郁癥的發(fā)生,但其作用機(jī)制目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)類(lèi)似的研究報(bào)告。本文通過(guò)研究下調(diào)PP2A活性對(duì)抑郁癥改善作用的分子機(jī)制,從而為研制治療抑郁癥藥物提供新的靶點(diǎn)和理論支持。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性SD大鼠30只(由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK桂2012-0003,體重(230±30)g(普通級(jí)),先將其按自然條件飼養(yǎng)7 d以對(duì)環(huán)境進(jìn)行適應(yīng),進(jìn)而依照曠野行為學(xué)鑒定法[4]進(jìn)行篩選,垂直方向分?jǐn)?shù)≥10分并且水平方向分?jǐn)?shù)≥30分的大鼠被認(rèn)定為正常大鼠,將所有正常大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為6組:對(duì)照A組(不給藥)、對(duì)照B組(不給藥)、低濃度岡田酸(Okadaic acid,OA)組、中濃度OA組、高濃度OA組、最優(yōu)濃度OA組(通過(guò)PP2A活性的測(cè)定結(jié)果選取最佳OA濃度),每組5只。

        1.2 抑郁癥大鼠模型建立 采用慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激[5]誘導(dǎo)建立抑郁癥大鼠模型。將所有大鼠予以?shī)A尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、45℃環(huán)境5 min、晝夜顛倒24 h、水平振蕩30 min、4℃冰水游泳5 min刺激。將上述7種方法依次標(biāo)記為1~7,每天采用隨機(jī)數(shù)字法采取1種,共安排21 d,每2種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 腦立體定位儀(成都儀器廠(chǎng),型號(hào):DW-2000),微型電鉆(成都儀器廠(chǎng),型號(hào):XSZ-P-I),微量注射器(5 μl)(上海安亭微量進(jìn)樣器廠(chǎng),型號(hào):87930),曠野實(shí)驗(yàn)用敞箱(廣西中醫(yī)藥大學(xué)生理學(xué)教研室制),Morris水迷宮(成都儀器廠(chǎng)),普通離心機(jī)(江蘇海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司,型號(hào):SS200),液體閃爍計(jì)數(shù)器(北京恒昌高科科學(xué)技術(shù)有限公司,型號(hào):RM-905a),熒光分光光度計(jì)(北京海光儀器有限公司,型號(hào):F7001);岡田酸(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司,合格證號(hào):78111-17-8),凝膠成像系統(tǒng)(Thermo Scientific公司,批號(hào):4466611),Western Blot電泳儀(北京六一儀器廠(chǎng),型號(hào):DYCP-37B);磷32標(biāo)記三磷酸腺苷(32P-adenosine triphosphate,32P-ATP;上海嵐派生物科技有限公司,合格證號(hào):67129),磷酸化酶-b(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):SLBG9973),磷酸化酶激酶(上海維基生物有限公司,批號(hào):23302),蛋白磷酸酯酶-1(protein phosphatase-1,PP-1)特異性抑制劑(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):SLDG1223),抗酪氨酸羥化酶(anti-tyrosine hydroxylase,anti-TH)抗體(上??道噬锟萍加邢薰?,批號(hào):10-P1732-1)、抗細(xì)胞外信號(hào)激酶(anti-extracellular signal regulated kinase,anti-ERK)抗體(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司,批號(hào):02-9011-200)、抗絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(anti-serine/threonine protein kinase,anti-AKT)抗體(美國(guó)Abcam公司,批號(hào):ab79360)、抗糖原合酶激酶3β(anti-glycogen synthase kinase 3β,anti-GSK-3β)抗體(美國(guó)Santa公司,批號(hào):sc-81496),山羊IgG親和純化二抗標(biāo)記( 北京中杉金橋生物公司,批號(hào):SP-9000-D),BeyoECL Plus-超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物公司,批號(hào):P0018)。

        1.4 側(cè)腦室置管注射藥物 使用1.5%戊巴比妥鈉(0.4 ml/100 g)對(duì)需進(jìn)行側(cè)腦室注射的大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉,參照 Paxinos & Watson 大鼠腦立體定位圖譜,采用立體定向儀作為引導(dǎo),于單側(cè)側(cè)腦室上方鉆取骨窗,并由此向側(cè)腦室置入注射用套管(AP=0.8 mm,LR=1.6 mm,V=3.5 mm)。完成置入術(shù)24 h后,給予對(duì)照A組及對(duì)照B組分別從側(cè)腦室微量注射無(wú)菌生理鹽水5 μl,低濃度OA組、中濃度OA組、高濃度OA組、最優(yōu)濃度OA組分別從側(cè)腦室微量注射濃度為5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L及從上述濃度中選取最優(yōu)濃度的OA溶液各5 μl,其中用無(wú)菌生理鹽水將OA分別配制成相應(yīng)濃度。

        1.5 行為學(xué)測(cè)試 對(duì)照B組、最優(yōu)濃度OA組在側(cè)腦室給藥后,完成蔗糖水消耗試驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)、體重測(cè)量及水迷宮的測(cè)試。

        1.5.1 蔗糖水消耗試驗(yàn)[6]:分別在給藥后第1天、第8天、第15天、第22天禁水,禁水24 h后次日測(cè)定飲用1%蔗糖溶液的量。以蔗糖溶液的飲用量反映了大鼠快感反應(yīng)。

        1.5.2 曠野試驗(yàn)[4]:在側(cè)腦室注射藥物后第22天對(duì)每只大鼠在相同環(huán)境情況下進(jìn)行曠野試驗(yàn),記錄大鼠運(yùn)動(dòng)情況。所用敞箱為長(zhǎng)寬均80 cm、高40 cm、內(nèi)空的立柱體,周壁為黑色,地面用黑線(xiàn)劃分為面積相等的25塊。以大鼠穿越地面方塊數(shù)(四爪跨入)作為水平活動(dòng)得分,以直立次數(shù)(兩前肢離地1 cm以上)為垂直活動(dòng)得分。以曠野試驗(yàn)的水平活動(dòng)反映了大鼠的活動(dòng)水平,垂直活動(dòng)的多少則反映其興趣高低;水平運(yùn)動(dòng)減少反映了動(dòng)物的活動(dòng)度的降低,垂直運(yùn)動(dòng)減少反映了動(dòng)物對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度降低。

        1.5.3 體重:分別測(cè)定給藥后第1天、第8天、第15天、第22天大鼠的體重。

        1.5.4 水迷宮測(cè)試:空間記憶的訓(xùn)練和測(cè)試參照水迷宮測(cè)試法[7]進(jìn)行。水溫保持在24℃左右,用二氧化鈦將水染成白色,從而隱蔽平臺(tái)。將大鼠背對(duì)平臺(tái)放入水中, 大鼠從入水到找到水下隱蔽的平臺(tái)所需要的時(shí)間為逃避潛伏期,從給藥后第1天開(kāi)始,共歷時(shí)4 d,每天測(cè)試1次,并記錄下結(jié)果。

        1.6 免疫生化水平檢測(cè)

        1.6.1 PP2A活性的測(cè)定:在側(cè)腦室注射藥物24 h后,處死對(duì)照A組、低濃度OA組、中濃度OA組、高濃度OA組大鼠,分別取出海馬組織,并低溫勻漿以備用。于緩沖液中,用磷酸化酶-b對(duì)32P-ATP和磷酸化酶激酶進(jìn)行中和標(biāo)記,30℃孵育10 min,經(jīng)層析后,收集含32P-ATP標(biāo)記的磷酸化酶-a,作為PP2A的底物。再將該底物與海馬組織勻漿提取物及PP-1特異性抑制劑等于常溫下反應(yīng)30 min后終止反應(yīng),將反應(yīng)物于層析紙上,進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)分析。

        1.6.2 熒光分光光度法:對(duì)照B組和最優(yōu)濃度OA組大鼠在完成行為學(xué)檢測(cè)后采取迅斷頭采血法,采血5 ml,并進(jìn)行血清分離,在4℃下按3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min,然后取上清液,用熒光分光光度法測(cè)去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、皮質(zhì)醇(cortisol,CORT)的水平。

        1.6.3 Western Blot方法:獲取對(duì)照B組和最優(yōu)濃度OA組大鼠皮質(zhì)和海馬勻漿后(方法同1.6.1),采用 Western Blot 檢測(cè)皮質(zhì)和海馬的酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、細(xì)胞外信號(hào)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT )及糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)的蛋白水平及磷酸化水平。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析以及多因素方差分析。以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 OA對(duì)PP2A活性的作用觀(guān)察 4組間PP2A活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。不同濃度OA組PP2A活性均低于對(duì)照A組,但低濃度OA組與對(duì)照組A比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),中、高濃度OA組與對(duì)照A組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。低濃度OA組、中濃度OA組、高濃度OA組的PP2A活性依次下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。因此最優(yōu)濃度OA組大鼠采取高濃度(20 nmol/L)OA進(jìn)行側(cè)腦室注射。

        表1 對(duì)照A組與各濃度OA干預(yù)組間PP2A活性的比較(x±s)

        注:與對(duì)照A組比較,#P<0.01;與低濃度OA組比較,*P<0.01;與中濃度OA組比較,▲P<0.05。

        2.2 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組大鼠蔗糖水實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 兩組飲用蔗糖水量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=7.910,P組間=0.023),第8、15、22天,最優(yōu)濃度OA組均多于對(duì)照B組。兩組飲用蔗糖水量均有隨觀(guān)察時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=8.834,P時(shí)間=0.016),其中最優(yōu)濃度OA組的飲用蔗糖水量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,對(duì)照B組的飲用蔗糖水量隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少。組間與時(shí)間有交互效應(yīng)(F交互=24.045,P交互=0.001)。見(jiàn)表2。

        表2 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組蔗糖水實(shí)驗(yàn)結(jié)果(x±s,ml)

        2.3 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組大鼠曠野試驗(yàn)得分比較 對(duì)照B組大鼠水平及垂直得分均低于最優(yōu)濃度OA組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

        表3 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組曠野實(shí)驗(yàn)得分比較(x±s,分)

        2.4 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組大鼠體重變化比較 兩組體重比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=5.736,P組間=0.044),第8、15、22天,最優(yōu)濃度OA組的體重均重于對(duì)照B組。兩組體重均有隨觀(guān)察時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=14.475,P時(shí)間=0.001),其中最優(yōu)濃度OA組的體重隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,對(duì)照B組的體重隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少。組間與時(shí)間有交互效應(yīng)(F交互=652.544,P交互<0.001)。見(jiàn)表4。

        2.5 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組大鼠水迷宮測(cè)試結(jié)果比較 兩組潛伏期比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=9.812,P組間=0.014 ),第8、15、22天,最優(yōu)濃度OA組的體重均短于對(duì)照B組。兩組潛伏期均隨觀(guān)察時(shí)間延長(zhǎng)而縮短(F時(shí)間=2375.770,P時(shí)間<0.001)。組間與時(shí)間有交互效應(yīng)(F交互=51.742,P交互<0.001)。見(jiàn)表5。

        表4 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組不同時(shí)間點(diǎn)體重比較(x±s,g)

        表5 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組水迷宮逃避潛伏期比較(x±s,s)

        2.6 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組間NE、5-HT、CORT水平比較 最優(yōu)濃度OA組NE水平、5-HT水平均高于對(duì)照B組(P<0.01),而CORT水平低于對(duì)照B組(P<0.01)。見(jiàn)表6。

        表6 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組大鼠NE、5-HT、CORT水平比較(x±s)

        2.7 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組間TH、ERK、AKT及GSK-3β的蛋白水平比較 最優(yōu)濃度OA組大鼠TH、ERK、AKT的蛋白水平均高于對(duì)照B組,GSK-3β的蛋白水平低于對(duì)照B組(P<0.05)。見(jiàn)表7。

        2.8 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組間TH、ERK、AKT及GSK-3β的磷酸化水平比較 最優(yōu)濃度OA組TH、ERK、AKT及GSK-3β的磷酸化水平均高于對(duì)照B組(P<0.05)。見(jiàn)表8。

        表7 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組間TH、ERK、AKT及GSK-3β蛋白水平(相對(duì)密度值)比較(x±s)

        表8 對(duì)照B組與最優(yōu)濃度OA組間TH、ERK、AKT及GSK-3β磷酸化水平(相對(duì)密度值)比較(x±s)

        3 討 論

        目前隨著針對(duì)抑郁癥病因靶點(diǎn)研究的日益深入,較高水平的PP2A與抑郁癥的正性關(guān)系已逐漸為學(xué)界所認(rèn)可,但其作用機(jī)制尚未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)告。本研究采用OA對(duì)抑郁癥大鼠模型PP2A活性進(jìn)行抑制,在對(duì)不同劑量的OA進(jìn)行分組對(duì)比后發(fā)現(xiàn),PP2A活性受OA的影響,其活性隨OA濃度的增加而明顯下降(P<0.05)。進(jìn)一步地我們使用對(duì)PP2A影響最大的濃度劑量的OA(最優(yōu)劑量OA)對(duì)抑郁模型大鼠進(jìn)行干預(yù),行為學(xué)檢查結(jié)果顯示,最優(yōu)濃度OA組曠野實(shí)驗(yàn)的水平及垂直得分均高于對(duì)照B組(P<0.05);隨觀(guān)察時(shí)間延長(zhǎng),最優(yōu)濃度OA組的糖水飲用量、體重而增加,水迷宮逃避潛伏期縮短(P<0.05),且在給藥后第8、15、22天,與對(duì)照B組比較,其糖水飲用量、體重均較高,水迷宮逃避潛伏期較短(P<0.05),這提示最優(yōu)濃度OA組大鼠的抑郁癥狀表現(xiàn)明顯輕于未進(jìn)行干預(yù)的抑郁模型大鼠,說(shuō)明下調(diào)PP2A活性可有效緩解抑郁狀態(tài),這與Bauman等[8]的研究結(jié)果相類(lèi)似。并且經(jīng)過(guò)OA干預(yù)的抑郁模型大鼠的NE、5-HT明顯高于未經(jīng)處理的抑郁大鼠,而CORT水平則低于后者(P<0.05),這與前者的抑郁癥狀態(tài)得到緩解后,被抑郁狀態(tài)刺激而興奮的下丘腦—垂體—腎上腺軸受到抑制而興奮性下降有關(guān),其中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子作為下丘腦—垂體—腎上腺軸上關(guān)聯(lián)神經(jīng)系統(tǒng)與內(nèi)分泌系統(tǒng)之間的重要神經(jīng)遞質(zhì),可調(diào)控藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元、中縫背側(cè)縫核和中縫正中核5-羥色胺能神經(jīng)元[9],進(jìn)一步對(duì)NE和5-HT水平產(chǎn)生影響;而另一方面,在抑郁狀態(tài)下高水平的CORT也隨著抑郁癥狀緩解后對(duì)腎上腺皮質(zhì)的興奮作用的減輕而隨之下降。

        此外,在PP2A活性下降的同時(shí),經(jīng)過(guò)OA干預(yù)的抑郁模型大鼠TH、ERK、AKT、GSK-3β的磷酸化水平升高(P<0.05),從而使得TH、ERK、AKT蛋白水平上升,而GSK-3β蛋白水平則下降(P<0.05)。由此,我們可認(rèn)為下調(diào)PP2A可使ERK、TH、AKT及GSK-3β的磷酸化水平上升,ERK、TH、AKT的功能上調(diào)而GSK-3β的功能下降,從而促使5-HT及NE等抗抑郁物質(zhì)的分泌釋放及其相應(yīng)神經(jīng)元應(yīng)答反應(yīng)功能的改善。

        PP2A是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸酯酶,是絲氨酸/蘇氨酸磷酸酯酶中極為重要的一種,在細(xì)胞功能的諸多方面均起著相當(dāng)重要的作用,直接或間接參與了細(xì)胞的新陳代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA 復(fù)制、蛋白合成、生長(zhǎng)發(fā)育及凋亡等活動(dòng)方式。腦組織富含的PP2A對(duì)神經(jīng)細(xì)胞功能包括可塑性、細(xì)胞存活與死亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等起重要作用[10]。研究表明, PP2A蛋白水平在產(chǎn)前應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠模型腦組織中明顯升高[11]。在本研究中,我們通過(guò)OA下調(diào)PP2A的活性,使得PP2A通過(guò)對(duì)底物去磷酸化從而參與細(xì)胞功能的能力下降,結(jié)果顯示TH、ERK、AKT以及GSK-3β的磷酸化水平均明顯上升,與此同時(shí),受磷酸化影響的TH、ERK、AKT及GSK-3β的活性也隨之改變,前三者活性上調(diào),而后者的活性則下降,這與其他學(xué)者的研究報(bào)告結(jié)果相似[12-15]。這與PP2A作為T(mén)H、ERK脫磷酸化修飾的重要的蛋白磷酸酯酶之一有關(guān),由于PP2A活性下調(diào)后,TH、ERK的磷酸化水平上升,活性也隨之上調(diào),TH作為兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)合成的限速酶,其活性在Ser19 位點(diǎn)磷酸化水平上升后得到上調(diào),促使兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)的合成,使單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)增加,與此同時(shí),在PP2A處于高水平時(shí)由于ERK活性下調(diào)而出現(xiàn)功能障礙的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)也因?yàn)镋RK活性的上調(diào)而得到恢復(fù)[11,16-17],使得抑郁模型大鼠的抑郁狀態(tài)得到改善。另一方面,我們通過(guò)OA下調(diào)PP2A使得AKT的磷酸化水平上升、活性上調(diào);由于在A(yíng)KT/GSK-3β信號(hào)途徑中下游的GSK-3β與大多數(shù)蛋白激酶不同,去磷酸化時(shí)其處于活化狀態(tài),作用于靜息細(xì)胞[18],因此AKT磷酸化水平上升可導(dǎo)致下游的GSK-3β磷酸化水平上升而活性下調(diào)[19],除此間接作用之外,下調(diào)PP2A活性還可以直接減少其對(duì)GSK-3β活性抑制性 Ser9 位點(diǎn)脫磷酸化的催化作用使得GSK-3β的活性下調(diào)[20],由于在A(yíng)KT/GSK-3β信號(hào)途徑中AKT活性的下降以及GSK-3β活性的明顯上升是抑郁癥的重要致病環(huán)節(jié)[21-22],因此通過(guò)下調(diào)PP2A的活性促使AKT活性上升以及GSK-3β活性下降使得抑郁模型大鼠行為學(xué)及血清學(xué)指標(biāo)均顯示其抑郁狀態(tài)得到顯著改善。

        本研究結(jié)果有望為研發(fā)治療抑郁癥藥物提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

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        Efficacy and mechanism of down-regulation of protein phosphatase 2A activity for improving symptoms of rats with depression

        MENGBin,RENDing,WANGKai-hua,ZHOUXin-mei

        (DepartmentofNeurology,RuikangHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530011,China)

        Objective To explore the efficacy and mechanism of down-regulation of protein phosphatase 2A(PP2A) activity for improving the symptoms of rats with depression.Methods Thirty rat models of depression were established by chronic unpredictable mild stress.And the rats were divided into control group A,control group B,low-concentration Okadaic acid(OA) group,medium-concentration OA group,high-concentration OA group and the optimal concentration OA group,with 5 rats in each group.The PP2A activity was detected in the control group A,control group B,low-concentration OA group,medium-concentration OA group and high-concentration OA group to screen the optimal concentration of OA.The control group A and control group B were injected with 5 μl sterile normal saline into cella lateralis.The low-concentration OA group,medium-concentration OA group and high-concentration OA group were injected into cella lateralis with 5 μl OA at the concentrations of 5 nmol/L,10 nmmol/L and 20 nmol/L respectively,and the optimal concentration OA group with 5 μl OA at the optimal concentration.The praxiology tests including the consumption of sucrose solution,open-field test,weight and Morris water maze were conducted in the control group B and the optimal concentration OA group.And the levels of noradrenaline(NE),5-hydroxytryptamine(5-HT) and cortsol(CORT),the levels of the protein and phosphorylation of tyrosine hydroxylase(TH),extracellular signal-regulated kinase(ERK),serine/threonine protein kinase(AKT) and glycogen synthase kinase 3β(GSK-3β) in brain tissues were detected in the control group B and the optimal concentration OA group.Results The activity of PP2A decreased with the increase of OA concentration(P<0.05),and the 20 nmol/L OA group was defined as the optimal concentration OA group.The horizontal and vertical scores of open-field test in the optimal concentration OA group were higher than those in the control group B(P<0.05).In the optimal concentration OA group,the consumption of sucrose solution and weight increased,and latent period of Morris water maze was shorter over time(P<0.05).Compared to the control group B,the consumption of sucrose solution and weight increased,and latent period of Morris water maze was shorter in the optimal concentration OA group on the 8th,15th and 22nd day after drug administration(P<0.05).The levels of NE,5-HT,TH protein,ERK protein and AKT protein,and phosphorylation levels of TH,ERK,AKT and GSK-3β in the optimal concentration OA group were higher than those in the control group B(P<0.05).The levels of CORT and GSK-3β protein in the optimal concentration OA group were lower than those in the control group B(P<0.05).Conclusion The activity of PP2A reduces with the increase of OA concentration. Down-regulation of PP2A activity might improve the symptoms of rats with depression by adjusting the signal pathways of TH,ERK and AKT/GSK-3β.

        Depression,Protein phosphatase A,Glycogen synthase kinase 3β,Tyrosine hydroxylase,Extracellular signal-regulated kinase,Rat

        廣西自然科學(xué)基金(2012GXNSFAA053076);廣西自然科學(xué)基金青年基金(2012GXNSFBA053082)

        蒙冰(1978~),女,碩士研究生,主治醫(yī)師,研究方向:神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治。通信作者:任丁(1959~),男,本科,主任醫(yī)師,碩士研究生導(dǎo)師,研究方向:神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中西醫(yī)結(jié)合防治,E-mail:Dingren2006@163.com。

        R 749.42

        A

        0253-4304(2016)05-0605-06

        10.11675/j.issn.0253-4304.2016.05.02

        2016-01-19

        2016-04-14)

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