馬憲魯 張 申 鄭寶石 馮 旭 謝曉勇 黃柳柳

(1 山東省濟寧市第一人民醫(yī)院心外科，濟寧市 272011，E-mail：ma.xianlu@163.com；2 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟外科，南寧市 530021)

論著·臨床研究

細胞色素氧化酶P450基因多態(tài)性對心臟機械瓣膜置換患者術后華法林抗凝劑量的影響▲

馬憲魯1張 申1鄭寶石2馮 旭2謝曉勇2黃柳柳2

(1 山東省濟寧市第一人民醫(yī)院心外科，濟寧市 272011，E-mail：ma.xianlu@163.com；2 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟外科，南寧市 530021)

目的 探討細胞色素氧化酶P450(CYP2C9)基因多態(tài)性對心臟機械瓣膜置換患者術后華法林抗凝劑量的影響。方法 擇期行心臟瓣膜置換術的瓣膜性病變患者522例，采用聚合酶鏈反應-限制性內切酶片段長度多態(tài)性技術檢測患者CYP2C9基因型，根據(jù)CYP2C9基因型進行分組，CYP2C9*1/*1為強代謝(EM)組，含有CYP2C9*2或*3為弱代謝(PM)組，記錄患者術后連續(xù)6 d華法林用量、凝血酶原時間(PT)值及國際標準化比值(INR)，比較兩組華法林初始治療抗凝過量的情況。結果 CYP2C9*1/*1共466例(89.3%)；CYP2C9*1/*2共6例(1.15%)；CYP2C9*1/*3共42例(8.05%)；CYP2C9*2/*3共8例(1.53%)，EM組466例，PM組56例。各組不同時間點的華法林用量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EM組的華法林用量在術后4 d較首次劑量明顯減少，PM組的華法林用量在術后3 d較首次劑量明顯減少，術后4、5、6 d持續(xù)減少；術后4、5、6 d PM組華法林用量明顯低于EM組(P<0.05)。兩組不同時間點的PT值及INR比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組PT值及INR于術后2 d開始增高，術后4 d上升到最高水平；術后3、4、5 d PM組的PT值及INR高于EM組(P<0.05)。PM組出現(xiàn)華法林抗凝過量者比例為62.5%，高于EM組的6.0%(P<0.05)。結論 CYP2C9基因多態(tài)性檢測結合臨床檢驗對心臟機械瓣膜置換術后華法林抗凝劑量的確定具有重要指導意義。

心臟瓣膜置換術；細胞色素氧化酶P450；華法林；基因多態(tài)性；抗凝

心臟瓣膜病變常用的外科治療方法為心臟瓣膜置換術，金屬機械瓣為常用的瓣膜材料，為避免術后血栓形成的風險，術后抗凝治療尤為重要，術后因抗凝不足導致的血栓栓塞和抗凝過度所致的出血是影響患者生存質量甚至死亡的主要原因[1]。華法林是一種香豆素類口服抗凝血藥物，臨床上廣泛用于血栓栓塞性疾病的治療，如深靜脈血栓、心臟瓣膜置換、腦栓塞、肺栓塞、心房纖顫等[2-3]。但華法林安全治療范圍窄，劑量個體差異較大，遺傳因素是造成其維持劑量以及個體差異的主要原因[4]。華法林是由S-華法林對映體和R-華法林對映體組成的消旋體，并且具有構象選擇性，抗凝作用更強的S-對映體約有85%經由肝臟中肝微粒體的細胞色素氧化酶P450(cytochrome P450 2C9，CYP2C9)代謝降解[5]。CYP2C9具有多種基因型，不同基因型患者使用華法林的效果及安全性具有差異，基因型為CYP2C9*1/*1為野生型純合子，含有CYP2C9*2、CYP2C9*3是最常見的突變型為雜合子[6]，兩種突變型酶活性較野生型分別降低了30%和80%[7]，術后抗凝服用劑量減少。臨床中檢測華法林用量的常用指標為凝血酶原時間(prothrombin time，PT)以及國際標準化比值(international normalized ratio，INR)[8]。本文旨在研究CYP2C9基因多態(tài)性對臨床心臟機械瓣膜置換術患者術后華法林初始使用的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年9月至2016年5月在我院心臟外科擇期行心臟機械瓣膜置換術患者，入選標準：瓣膜性病變患者；術前肝功能正常；在我院行金屬機械瓣膜置換術；術后24 h開始口服華法林片抗凝治療。排除標準：年齡<18歲；三尖瓣置換術患者；先天性心臟病患者；A型主動脈夾層患者；升主動脈擴張動脈瘤患者；瓣膜置換合并冠狀動脈旁路移植術患者；同期服用能與華法林產生協(xié)同或拮抗的藥物(如阿司匹林腸溶片、胺碘酮片、苯妥英鈉片等)者；女性懷孕者；高血壓病患者；近3個月內顱內出血或顱內動脈瘤者；胃腸道出血者；出現(xiàn)重癥肺部炎癥、低心排綜合征、重要臟器衰竭等嚴重并發(fā)癥者。共納入522例患者，男268例、女254例，年齡(43.5±5.8)歲，體質量(54.4±4.7)kg，血壓(127.3±6.6)/(62.4±5.5)mmHg；二尖瓣狹窄患者129例，二尖瓣關閉不去患者88例，二尖瓣狹窄并關閉不全患者80例，主動脈瓣狹窄患者95例，主動脈瓣關閉不全患者60例，主動脈瓣狹窄并關閉不全患者35例，二尖瓣合并主動脈瓣病變患者35例。本次研究獲得廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，入選患者均簽訂知情同意書。

1.2 實驗材料 華法林(芬蘭Orion藥廠，規(guī)格：3 mg/片，批號：H20110108)，總RNA小量制備試劑盒(美國Axygen公司，批號：FAB 2015004)，反轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司，批號：DRR047A)，定量PCR試劑盒(美國Roche公司，批號：4913914001)，高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司，型號：5810R)，定量PCR儀(美國Stratagene公司，型號：MX 3000)，JY電泳儀(北京六一儀器廠，型號：JY-ECPT 3000)，凝膠成像儀(美國BioRad公司，型號：170-8170)，微量紫外分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：NanoDrop 2000)。

1.3 研究方法

1.3.1 血液標本采集：患者于術前1 d采集肘正中靜脈血4 ml，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，3 000 r/min離心5 min，分離血漿，吸取中間層白細胞，血漿置入含有RNAstore保存液的凍存管中，放置-60℃冰箱中凍存，用于測定CYP2C9基因型。

1.3.2 CYP2C9基因型檢測及分組：提取患者外周血基因組RNA，按照試劑盒步驟進行操作。通過對樣品分離、RNA沉淀、RNA清洗后，取5 μl總RNA在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓80 V，電泳20 min，判斷總RNA的完整性，見圖1。采用聚合酶鏈反應-限制性內切酶片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技術檢測CYP2C9基因型。從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載人CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3基因序列，應用Oligo 6.0引物評估軟件，Primer Premier 5.0設計一下引物CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3為特異性序列，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物系列如下：CYP2C9*1：上游5′-GTGAATGACACACACAAACTAACAG-3′，下游5′-TCACACCCTATTCACACATTCCTTC-3′；CYP2C9*2：上游5′-TAACAGAGGATTTGGTAGGTG-3′，下游5′-AGTTCAGGAGAACATGGGAT-3′；CYP2C9*3：上游5′-CCAGGTCAGTAACAGGTCAG-3′，下游5′-ATGGAGTTGCAGTGTAGGAG-3′。依照試劑盒指示建立反應體系，反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s共40個循環(huán)。反應結束后，按儀器默認條件收集熒光，把離心管迅速放入PCR擴增儀，按擴增程序進行PCR擴增，擴增完成后收集熔解曲線，見圖2。根據(jù)CYP2C9基因型進行分組，基因型為*1/*1野生型純合子為強代謝(extensive metabolizer，EM)組；基因型為含有*2或*3的突變型為弱代謝(poor metabolizer，PM)組。

圖1 CYP2C9*1、CYP2C9*2和*3 PCR產物電泳圖

注：標志物分別為100、200、300、400、500、600、800、1 000、1 500 bp；“1”代表CYP2C9*1酶切產物，“2”代表CYP2C9*2酶切產物，“3”代表CYP2C9*3酶切產物，“4”代表標記位點，“5”代表產物陽性對照。

圖2 CYP2C9*1、CYP2C9*2和*3基因擴增曲線與溶解曲線

注：A1 為CYP2C9*1基因擴增曲線；A2為CYP2C9*1基因熔解曲線；B1為CYP2C9*2基因擴增曲線；B2為CYP2C9*2基因熔解曲線；C1 為CYP2C9*3基因擴增曲線；C2為CYP2C9*3基因熔解曲線。

1.3.3 PT值、INR值測定及術后華法林治療：(1)PT值測定結果由廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科生化室提供，應用美國Pacific Hemostasis公司生產凝血質控品、美國Instrument Laboratory公司生產PT檢測試劑及美國Instrument Laboratory公司生產ACL 9000全自動凝血分析儀、采用Quick濕化學法[9]監(jiān)測PT值。根據(jù)公式INR=(PTtest/PTnormal)ISI得出INR值[10]。(2)患者入院時即檢測PT值與INR值，以術后24 h開始口服華法林為第1天，給予的華法林劑量為首次劑量，連續(xù)監(jiān)測6 d。根據(jù)中華醫(yī)學會制定的華法林抗凝指南[11]，由于心臟機械瓣膜置換術患者術后PT值超出40 s、INR超出4出血并發(fā)癥發(fā)生率高，因此本次研究將PT值≥40 s以及INR≥4.0作為抗凝過量。依據(jù)每日的PT值與INR調整華法林用量，記錄患者術后口服華法林首次劑量以及連續(xù)6 d的劑量。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。Pearson χ2檢驗用于檢查基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律[12]；計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗；計量資料以(x±s)表示，重復測量的資料采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 CYP2C9基因檢測結果及分組 采用PCR-RFLP檢測技術檢測基因型：CYP2C9*1/*1共466例(89.3%)，CYP2C9*1/*2共6例(1.15%)，CYP2C9*1/*3共42例(8.05%)，CYP2C9*2/*3共8例(1.53%)，未發(fā)現(xiàn)*2和*3的純合體。經Hardy-Weinberg平衡檢驗，該人群符合群體基因遺傳平衡(P>0.05)。根據(jù)CYP2C9基因型進行分組：無基因突變的*1/*1基因型為EM組，共466例，攜帶*2或*3雜合等位基因的為PM組共56例。兩組患者在年齡、性別、體質量以及瓣膜置換手術類型比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同基因型患者一般情況比較

2.2 兩組患者連續(xù)6 d華法林用量比較 在EM組與PM組，不同時間點的華法林用量比較，差異具有統(tǒng)計學意義(F時間=6.132，P時間=0.022)，其中EM組在術后4 d的華法林用量較首次劑量明顯減少，PM組在術后3 d華法林用量較首次劑量明顯減少，術后4、5、6 d持續(xù)顯著減少；兩組華法林用量比較，差異具有統(tǒng)計學意義(F分組=6.804，P分組=0.015)，其中術后4、5、6 d PM組華法林用量顯著低于EM組；分組與時間無交互作用(F交互=1.592，P交互=0.201)。見表2。

表2 EM組與PM組患者術后6 d華法林用量比較(x±s，mg)

2.3 兩組患者術后PT值與INR值比較 EM組與PM組，不同時間點PT值比較，差異有統(tǒng)計學意義(F時間=8.134，P時間=0.016)，其中兩組PT值均于術后2 d開始增高，術后4 d上升到最高水平；兩組PT比較，差異有統(tǒng)計學意義(F分組=7.112，P分組=0.013)，其中PM組術后3、4、5d 的PT值明顯高于EM組；分組與時間無交互作用(F交互=1.661，P交互=0.191)。EM組與PM組不同時間點INR值比較，差異有統(tǒng)計學意義(F時間=8.439，P時間=0.011)，其中兩組INR值于術后2 d開始增高，術后4 d上升到最高；兩組INR比較，差異有統(tǒng)計學意義(F分組=6.414，P分組=0.022)，其中PM組術后3、4、5 d INR值明顯高于EM組；分組與時間無交互作用(F交互=1.575，P交互=0.221)。見表3。

表3 EM組與PM組患者術后PT值及INR值比較(x±s)

2.4 兩組華法林初始治療抗凝過量的比較 全組522例患者中，出現(xiàn)抗凝過量63例，占12.1%(63/522)；EM組出現(xiàn)抗凝過量28例，占6.0%(28/466)；PM組出現(xiàn)抗凝過量35例，占62.5%(35/56)；PM組出現(xiàn)抗凝過量者的比例高于EM組，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=6.98，P=0.016)。

3 討 論

華法林是心臟瓣膜置換術后抗凝治療的常用藥物，金屬機械瓣置換術后患者需要終生抗凝，但不同患者使用華法林劑量差異明顯，需要個體化治療，其中遺傳因素是影響患者華法林用量的主要因素[4]。CYP2C9基因是位于人染色體10q24.2，全長約50.71 kb，目前研究發(fā)現(xiàn)CYP2C9存在CYP2C9*2～*35多種突變等位基因，以野生型純合子*1/*1和含有突變型雜合子*2、*3最為常見[6]。CYP2C9*2突變是3號外顯子上發(fā)生C430>T的突變，造成精氨酸144>半胱氨酸144氨基酸置換，CYP2C9*3是在7號外顯子上發(fā)生A1075>C突變，造成異亮氨酸359>亮氨酸359氨基酸置換[13]。CYP2C9參與人機體中多種藥物的代謝，其中包括抗凝血藥華法林、雙香豆素、硝芐香豆素、苯丙香豆素等[14]。由于不同CYP2C9基因型對華法林代謝程度的影響不同，所以參考CYP2C9基因型多態(tài)性來指導華法林個體用量具有較高的臨床指導意義。Ghozlan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，結合CYP2C9基因型的多態(tài)性來進行華法林抗凝治療指導能夠更準確地達到INR治療窗的時間。Poopak等[16]發(fā)現(xiàn)對華法林抗凝治療的患者提前2周進行CYP2C9基因多態(tài)性檢測指導治療可以減少血栓栓塞與出血的風險。

對于瓣膜置換術后的患者，術后定期檢測PT值和INR來決定華法林的用量。對于抗凝治療范圍，結合中華醫(yī)學會制定的華法林抗凝指南[11]以及我院心臟外科診療規(guī)范，應以PT值作為抗凝標準、INR作為參考標準，合理的抗凝治療是維持PT值在20～30 s為宜，INR控制在2.0～3.0為宜。而華法林的用量調整，若PT值<20 s，表示抗凝不足，需要增加用量；而>30 s表示抗凝過度，需要減少用量，每次增減0.75 mg藥量；而PT值>40 s且對應的INR>4.0則表示抗凝過度，需要停用華法林，而這一標準與2008年美國胸科醫(yī)師協(xié)會建議的指南[17]相符合。本研究中，絕大多數(shù)研究對象的基因型為CYP2C9*1/*1，符合Hardy-Weinberg定律。術后連續(xù)觀察6 d，EM組華法林抗凝用量在第4天較首次劑量明顯降低，于第5天、第6天上升且趨于平穩(wěn)，提示該組患者術后使用華法林抗凝用量相對較穩(wěn)定；而術后第4天EM組PT值與INR增高至最高水平，可能與華法林使用前3 d的用量積累有關。華法林的半衰期為36～42 h，口服40 h后血藥濃度趨于穩(wěn)定[18]。含有*2和*3突變型雜合子的基因型占少數(shù)，且該突變型雜合子屬于對華法林的慢代謝基因[6]。術后連續(xù)觀察6 d，PM組華法林抗凝用量在術后第3天華法林用量較首次劑量明顯減少，且術后4 d、5 d、6 d用量持續(xù)顯著降低，可能與*2和*3基因導致對華法林代謝降低，從而引起術后華法林抗凝用量變化幅度大且維持量減少有關。含有*2和*3的PM組在術后4、5、6 d的華法林用量較EM組顯著下降，且術后3、4、5 d的PT值與INR高于EM組，提示含有*2和*3的突變型雜合子對華法林代謝能力低于*1/*1的野生型純合子，CYP2C9基因多態(tài)性能夠影響華法林代謝及抗凝效果。此外，含有*2和*3突變型雜合子的PM組患者術后出現(xiàn)抗凝過度的幾率明顯高于基因型為*1/*1野生型純合子的EM組患者(P<0.05)，提示可通過CYP2C9基因多態(tài)來進行換瓣術后華法林抗凝指導，有效減少抗凝過度甚至出血的風險。

華法林抗凝治療的效果受多種因素的影響，基因多態(tài)性是導致個體差異最主要的原因?；驅虻慕o藥方式與能夠有效縮短達到穩(wěn)定劑量的時間，減少因機體內劑量原因引起的出血或栓塞風險，為臨床更安全有效用藥提供了依據(jù)。但CYP2C9的*2和*3基因只是影響華法林穩(wěn)定劑量基因突變中的2個有代表性基因，僅解釋40%～74%的個體劑量差異[19]。此外，華法林的影響因素還來自于其他基因的影響、拮抗或者協(xié)同藥物的作用、胃腸道的吸收、肝臟的代謝、民族差異、飲食習慣以及其他疾病狀態(tài)的干預等[20]。

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Effect of cytochrome oxidase P450 gene polymorphism on postoperative anticoagulant dosage of warfarin in patients undergoing mechanical heart valve replacement

MAXian-lu1,ZHANGShen1,ZHENGBao-shi2,FENGXu2,XIEXiao-yong2,HUANGLiu-liu2

(1DepartmentofCardiothoracicSurgery,theFirstPeople′sHospitalofJining,Jining272011,China;2DepartmentofCardiothoracicSurgery,theFiristAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the effect of cytochrome oxidase P450(CYP2C9) gene polymorphism on postoperative anticoagulant dosage of warfarin in patients undergoing mechanical heart valve replacement.Methods A total of 522 patients with valvular disease undergoing selective heart valve replacement were selected.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism was used to detect the CYP2C9 genotype in the patients.Then the patients were grouped according to the CYP2C9 genotypes.The patients with CYP2C9*1/*1 were enrolled as extensive metabolizer(EM) group,and the patients with CYP2C9*2 or *3 as poor metabolizer(PM) group.The dosages of warfarin,prothrombin time(PT) and international normalized ratio(INR) were recorded for 6 consecutive days after surgery.The incidences of overdose of warfarin for initial anticogulation were compared between the two groups.Results CYP2C9*1/*1,CYP2C9*1/*2,CYP2C9*1/*3 and CYP2C9*2/*3 were found in 466 patients(89.3%),6 patients(1.15%),42 patients(8.05%) and 8 patients(1.53%) respectively.And 466 cases were included in EM group and 56 cases in PM group.There was significant difference in the dosage of warfarin among different time points in each group(P<0.05).The dosage of warfarin in EM group reduced significantly on the postoperative 4th day compared to the initial dosage,while the dosage in PM group reduced significantly on the postoperative 3rd day compared to the initial dosage and continued to reduce on the postoperative 4th,5th and 6th day.The dosages of warfarin in PM group were less than those in EM group on the postoperative 4th,5th and 6th day(P<0.05).There were significant differences in PT and INR among different time points in each group(P<0.05).PT and INR in both groups began to increase on the postoperative 2nd day and reached the highest level on the postoperative 4th day.The levels of PT and INR in PM group were higher than those in EM group on the postoperative 3rd,4th and 5th day(P<0.05).The proportion of patients with overdose of warfarin for anticoagulation in PM group was higher than that in EM group(62.5%vs. 6.0%,P<0.05).Conclusion The detection of CYP2C9 gene polymorphism in combination with clinical laboratory is significant for determining the anticogulation dosage of warfarin after mechanical heart valve replacement. 【Key words】 Heart valve replacement,Cytochrome oxidase P450,Warfarin,Gene polymorphism,Anticoagulant

廣西科學研究與技術開發(fā)計劃(桂科攻1355005-2-3)；廣西自然科學基金(2013GXNSFAA019152)

馬憲魯(1990～)，男，碩士，研究方向：心臟大血管外科診療。

鄭寶石(1969～)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，研究方向心臟大血管外科診療，E-mail：zhengbs25@vip.sina.com。

R 654.27

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0253-4304(2016)10-1350-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.04

2016-05-20

2016-07-07)