崔亞威 陳銘伍 王永勇 譚 翔 歐 進 冼 磊 郭建極 陽 諾 戴 磊 梁冠標

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530021，E-mail：cuiyawei1121@126.com)

肌球蛋白輕鏈激酶mRNA在非小細胞肺癌患者外周血的表達情況及其臨床意義▲

崔亞威 陳銘伍 王永勇 譚 翔 歐 進 冼 磊 郭建極 陽 諾 戴 磊 梁冠標

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530021，E-mail：cuiyawei1121@126.com)

目的 探討肌球蛋白輕鏈激酶(MYLK)mRNA在非小細胞肺癌(NSCLC)患者外周血的表達情況及其與臨床特征的關(guān)系。方法 48例NSCLC患者(肺癌組)和48例非腫瘤患者(對照組)，抽取靜脈血后分離出單個核細胞，使用實時熒光定量PCR檢測MYLK mRNA的表達情況，并分析其表達量與臨床特征的關(guān)系。結(jié)果 肺癌組及對照組患者外周血均有MYLK mRNA表達，肺癌組患者MYLK mRNA表達量為(1.40±0.57)，明顯低于對照組的(2.03±0.16)(P<0.05)；術(shù)前組與術(shù)后組、鱗癌組與腺癌組、高+中分化組與低分化組、男性組與女性組、吸煙組與不吸煙組的MYLK mRNA相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；Ⅲ+Ⅳ期組患者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者MYLK mRNA相對表達量分別高于 Ⅰ+Ⅱ 期組、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者(P<0.05)。結(jié)論 外周血MYLK mRNA的表達水平可能與NSCLC發(fā)生發(fā)展有關(guān)，對判斷NSCLC預后有一定價值。

非小細胞肺癌；肌球蛋白輕鏈激酶；信使RNA；外周血

目前肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，近年來全球肺癌發(fā)病率略有下降，但仍然是癌癥死亡的主要原因，尤其在發(fā)展中國家[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌85%以上，即使是手術(shù)Ⅰ期完全切除的患者，仍有超過1/4的患者術(shù)后短期內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移，提示外周血循環(huán)中可能存在循環(huán)腫瘤細胞，嚴重威脅患者生命[2-3]。目前，肺癌的發(fā)生被認為是一個多基因參與、多步驟發(fā)展的復雜生物學過程，也涉及多種信號轉(zhuǎn)導通路。已知吸煙、遺傳、職業(yè)暴露和大氣污染等因素與肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MYLK)的表達變化與胃癌、結(jié)腸癌等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]，但有關(guān)其與肺癌的關(guān)系的研究甚少，我們前期已采用基因富集等生物信息學方法篩選出與NSCLC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因之一MYLK[6]，并發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中MYLK mRNA及蛋白的表達水平低于癌旁及正常組織，但其在患者外周血的表達情況尚不清楚[7]。因此，本研究采用實時熒光定量PCR檢測NSCLC患者外周血MYLK mRNA的表達情況，探討其表達水平與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科2014年11月至2015年7月收治的經(jīng)手術(shù)切除治療且病理檢查證實為NSCLC的患者48例(肺癌組)，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟系統(tǒng)進行腫瘤TNM分期[8]。男性38例，女性10例，年齡30～75歲。納入標準：均無全身系統(tǒng)性病變或其他器官良、惡性腫瘤；術(shù)前均未經(jīng)放、化療及靶向治療。選取同期48例非腫瘤患者作為對照組，其中氣胸患者16例，無感染及腫瘤的神經(jīng)內(nèi)科疾病患者32例；男性38例，女性10例，年齡16～60歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有血樣抽取均取得患者及其家屬同意以及倫理委員會批準。

1.2 主要儀器與試劑 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒均為TAKARA公司的產(chǎn)品；Trizol試劑和buffer EL紅細胞裂解液分別為Invitrogen公司和QIAGEN公司的產(chǎn)品；UVI FireReader凝膠成像分析系統(tǒng)生產(chǎn)于英國UVItec公司；Tromor 4實時熒光定量PCR儀購買于Bio-Rad公司；MR23i高速多功能冷凍離心機和NanoDrop ND-2000微量紫外分光光度儀均購自美國Thermo公司生產(chǎn)。

1.3 實時熒光定量PCR

1.3.1 引物的設(shè)計與合成：在Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中查詢?nèi)祟怣YLK和看家基因β-肌動蛋白(ACTB)基因的cDNA序列，使用Oligo7軟件設(shè)計引物，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。各基因引物的序列見表1。

表1 各基因引物的序列

1.3.2 RNA提?。喝》伟┙M患者(術(shù)前及術(shù)后)及對照組外周靜脈血2 ml，使用buffer EL紅細胞裂解液將紅細胞裂解后離心分離出外周血單個核細胞。加入1 ml Trizol試劑混勻，室溫放置5 min，加200 μl三氯甲烷并充分混勻，于4℃條件下13 000 r/min離心15 min，取上清置入新離心管，加入500 μl異丙醇，混勻后冰上靜置10 min，于4℃條件下13 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，加入75%的乙醇 1 ml，充分吹打洗滌，4℃條件下13 000 r/min離心5 min，倒掉上清液后空氣中自然干燥，加入適當?shù)腞Nase free水混勻，用微量紫外分光光度儀測定RNA的濃度和純度。純凈RNA樣本A 260 nm/A 280 nm的比值均大于2.0。

1.3.3 cDNA合成與鑒定：cDNA的合成反應按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進行，用ACTB引物對cDNA進行檢測，退火溫度為60℃，三步法進行PCR擴增，反應的循環(huán)數(shù)為32，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，在凝膠成像分析系統(tǒng)下，可在225 bp左右看見條帶。

1.3.4 實時熒光定量PCR：使用Tromor 4實時熒光定量PCR儀進行擴增，反應體系為20 μl，兩步法PCR擴增程序如下：第1步：95℃ 30 s，1個循環(huán)；第2步：95℃ 5 s，退火溫度 60℃ 30 s，反應循環(huán)數(shù)為40。反應完畢后取5 μl產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.4 實驗數(shù)據(jù)的處理 熒光定PCR結(jié)果以ACTB基因作為內(nèi)參，將非腫瘤患者為對照組，并將其目的基因表達量設(shè)為1，采用2-△△Ct法計算實驗組目的基因的表達相對于對照組目的基因表達量變化的倍數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以(x±s)表示，采用t檢驗，方差不齊的兩組數(shù)據(jù)則采用近似t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者外周血MYLK mRNA表達比較 各樣本RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，擴增檢測反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量(圖1)。肺癌組患者及對照組患者外周血均有MYLK mRNA表達，肺癌組患者治療前后的平均MYLK mRNA表達量為(1.40±0.57)，明顯低于對照組患者的(2.03±0.16)(t=-3.185，P=0.010)。

圖1 ACTB及MYLK基因的溶解曲線及擴增曲線

注：A為ACTB溶解曲線，B為ACTB擴增曲線，C為MYLK溶解曲線，D為MYLK擴增曲線。

2.2 不同臨床特征患者MYLK mRNA表達量比較 48例NSCLC患者中，術(shù)前組與術(shù)后組、鱗癌組與腺癌組、高+中分化組與低分化組、男性組與女性組、吸煙組與不吸煙組間的MYLK mRNA相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；Ⅲ+Ⅳ期組患者MYLK mRNA相對表達量明顯高于Ⅰ+Ⅱ期組(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者MYLK mRNA相對表達量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床特征患者外周血MYLK mRNA相對表達量比較

3 討 論

MYLK廣泛存在于各種真核細胞及非肌肉性細胞中，是一種鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于免疫球蛋白超家族[9]。MYLK主要是通過磷酸化方式使內(nèi)皮細胞上的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化，在MLC 氨基端的特異位點(蘇氨酸-19)上進行磷酸化，隨后通過絲氨酸-18 誘導三磷酸腺苷依賴的肌動球蛋白收縮，內(nèi)皮細胞骨架重塑，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞通透性，促進肌球蛋白驅(qū)動收縮、應力纖維形成、黏著、細胞遷移和細胞分裂[10]。

MYLK mRNA參與胃癌細胞的增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移過程。Lee等[5]研究發(fā)現(xiàn)MYLK mRNA在結(jié)腸癌組織的相對表達量明顯低于癌旁組織，起了抑癌基因的作用。有研究表明乳腺癌患者MYLK參與p38-絲裂原活化蛋白激酶通路，MYLK抑制劑如MLJ-7，可以降低MYLK的表達，導致成纖維細胞變圓，有效減少癌細胞的增殖及轉(zhuǎn)移，進而誘導乳腺癌細胞凋亡[11]。白藜蘆醇通過下調(diào)肝組織MYLK 的表達水平誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制大鼠肝腫瘤細胞的增生[12]。但近年來關(guān)于MYLK與NSCLC關(guān)系的研究報告甚少。Minamiya等[13]首次報告了MYLK mRNA與NSCLC患者的預后情況，發(fā)現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者MYLK mRNA 表達水平明顯增高。本研究結(jié)果顯示，在NSCLC患者及非腫瘤患者外周血中均有MYLK mRNA表達，但NSCLC患者的表達量明顯低于非腫瘤患者(P<0.05)。譚翔等[7]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCLC癌組織中MYLK mRNA表達量明顯低于癌旁組織及正常肺組織(P<0.05)，表明在NSCLC患者的癌組織及外周血中MYLK mRNA均呈低表達。有研究表明，在腫瘤細胞中，MYLK的假基因MYLKP1能降低MYLK mRNA的穩(wěn)定性，甚至抑制其表達來刺激細胞增殖[14]，但MYLKP1是否對MYLK的表達起調(diào)控作用仍需進一步研究。

分析MYLK基因在不同臨床病理特征NSCLC患者中的表達特點，對于判斷肺癌局部生物學行為、復發(fā)及預后具有重要意義。本研究結(jié)果表明，NSCLC患者術(shù)前與術(shù)后MYLK mRNA的表達無差異(P>0.05)，這可能與該組患者術(shù)前、術(shù)后取血標本的時間周期短有關(guān)，仍需進一步追蹤隨訪。在鱗癌與腺癌、高+中分化與低分化、男性與女性、吸煙與不吸煙的NSCLC患者血中MYLK mRNA相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，但Ⅲ+Ⅳ期組患者MYLK mRNA相對表達量明顯高于Ⅰ+Ⅱ 期組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者MYLK mRNA相對表達量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者(P<0.05)，這可能與在外周血中MLCK使肌球蛋白輕鏈MLC磷酸化，導致細胞連接破壞、細胞骨架重排、血管內(nèi)皮細胞收縮，并最終增加血管內(nèi)皮細胞的通透性有關(guān)[15]；或是通過MYLK或Rho激酶調(diào)控腫瘤細胞黏附而引起內(nèi)皮細胞膜表面受體與細胞骨架之間的信號轉(zhuǎn)導，并通過調(diào)控肌球蛋白輕鏈的磷酸化水平，引起肌球蛋白與肌動蛋白相互作用，導致腫瘤細胞向血管外游走，并向遠處轉(zhuǎn)移[16]。本文研究結(jié)果與Tan等[6]的研究結(jié)果基本一致，表明外周血MYLK mRNA表達量與NSCLC的分期有關(guān)，分期越高表達量越高，這對患者的預后判斷有重要價值。此外，Tan等[6]也報告MYLK可能在黏著斑通路上參與調(diào)控細胞骨架重塑，增強細胞移動及細胞黏附、細胞侵襲能力。

綜上所述，NSCLC患者外周血MYLK mRNA表達明顯降低，并其表達量與患者的分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，該指標有可能成為研究NSCLC發(fā)生發(fā)展及評估預后的一個重要的預警因子及治療NSCLC的新靶點。

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Expression and clinical significance of myosin light chain kinase message RNA in peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer

CUIYa-wei,CHENMing-wu,WANGYong-yong,TANXiang,OUJin,XIANLei,GUOJian-ji,YANGNuo,DAILei,LIANGGuan-biao

(DepartmentofCardiothoracicSurgery,theAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the expression of myosin light chain kinase(MYLK) message RNA(mRNA) in peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC),and to investigate the relationship of MYLK mRNA expression with clinical characteristics.Methods Mononuclear cells were isolated from the venous blood of 48 patients with NSCLC(lung cancer group) and 48 patients without tumor(control group).And then the expression of MYLK mRNA was detected by real-time quantitative PCR,and the relationship between the expression level of MYLK mRNA and clinical characteristics was analyzed.Results MYLK mRNA was expressed in peripheral blood of the patients in lung cancer group and control group.The expression level of MYLK mRNA of the patients in lung cancer group was (1.40±0.57),and was significantly lower than that of control group(2.03±0.16)(P<0.05).For patients with NSCLC,there was no significant difference in the relative expression level of MYLK mRNA between two different subgroups,including preoperative group and postoperative group,squamous cell carcinoma group and adenocarcinoma group,well-differentiated+moderated differentiated group and poor-differentiated group,male group and female group,smoking group and non-smoking group(P>0.05).The relative expression levels of MYLK mRNA in patients with stage Ⅲ+Ⅳ and with lymphatic metastasis were significantly higher than those in patients with stage Ⅰ+Ⅱ and without lymphatic metastasis respectively(P<0.05).Conclusion The expression level of MYLK mRNA in peripheral blood may be closely related to the occurrence and development of NSCLC,and it is valuable for evaluating the prognosis of NSCLC to a certain extent. 【Key words】 Non-small cell lung cancer,Myosin light chain kinase,Message RNA,Peripheral blood

廣西壯族自治區(qū)高等學校科學研究項目(桂教立項項目KY2015LX053)；廣西科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃(桂科攻10124001A-47)

崔亞威(1990～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：肺癌、食管癌及心臟疾病等臨床及科研。通信作者：陳銘伍(1959～)，男，碩士，教授，碩士生導師，研究方向：肺癌、食管癌及心臟疾病等臨床及科研，E-mail：chen535@126.com。

R 734.2

A

0253-4304(2016)02-0171-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.07

2015-10-10

2015-12-31)