劉秀穎 吳 原 藍(lán)瑞芳

(1 廣西欽州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，欽州市 535000，E-mail：13471716560@163.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南寧市 530021)

白藜蘆醇對(duì)難治性癲癇細(xì)胞模型神經(jīng)元損傷及神經(jīng)突起的影響

劉秀穎1吳 原2藍(lán)瑞芳1

(1 廣西欽州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，欽州市 535000，E-mail：13471716560@163.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南寧市 530021)

目的 探討白藜蘆醇(Res)對(duì)難治性癲癇細(xì)胞模型的神經(jīng)元損傷及神經(jīng)突起形態(tài)學(xué)變化的影響。方法 將體外培養(yǎng)至第10天的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元分為對(duì)照組、模型組、10 μmol/L Res組、20 μmol/L Res組、40 μmol/L Res組及60 μmol/L Res組。對(duì)照組采用正常細(xì)胞的細(xì)胞外液培養(yǎng)3 h后恢復(fù)維持培養(yǎng)液，模型組采用無鎂細(xì)胞外液培養(yǎng)3 h后恢復(fù)維持培養(yǎng)液，4個(gè) Res組經(jīng)無鎂細(xì)胞外液培養(yǎng)3 h后加入相應(yīng)濃度的Res培養(yǎng)液。檢測(cè)建立模型后24 h各組細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶(LDH)的活性，光學(xué)顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元及神經(jīng)突起的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組及各濃度Res組的LDH活性顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L Res組LDH活性明顯降低(P<0.05)，其中以40 μmol/L Res組最低；60 μmol /L Res組與模型細(xì)胞的LDH活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)建立模型后24 h，光學(xué)顯微鏡下可見模型組神經(jīng)突起之間相互遷移聚集，突起連接成“網(wǎng)格樣”；40 μmol/L Res組出現(xiàn)少部分神經(jīng)突起遷移靠近聚集，大部分的突起連接分布均勻。結(jié)論 Res能減少難治性癲癇細(xì)胞模型的神經(jīng)元損傷，抑制異常神經(jīng)突起連接的形成。

難治性癲癇；白黎蘆醇；神經(jīng)元；神經(jīng)突起；細(xì)胞模型；大鼠

癲癇經(jīng)藥物治療后可獲長(zhǎng)期緩解，但仍有20%～30%的患者不能得到有效控制，發(fā)展為難治性癲癇，即耐藥性癲癇。難治性癲癇患者的癲癇癥狀長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作，不僅使患者軀體受到損害，而且在一定程度上導(dǎo)致患者心理障礙及一系列的社會(huì)問題。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然多酚類，廣泛存在于葡萄皮、虎杖等植物中。目前已有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Res有抗癲癇的作用及對(duì)癲癇發(fā)作后損傷的神經(jīng)元有保護(hù)作用[1]，但由于其抗癲癇的機(jī)制仍未完全明確而制約了臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)擬通過無鎂液建立體外難治性癲癇細(xì)胞模型，觀察Res對(duì)難治性癲癇細(xì)胞模型神經(jīng)元損傷及神經(jīng)突起形態(tài)學(xué)變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 Res(純度99%，批號(hào)PCS0043)購自北京中科儀友化工技術(shù)研究院。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生24 h內(nèi)SD大鼠乳鼠12只，無特定病原體級(jí)，體重5～12 g，雌雄不限，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)： SCXK(桂)2010-0002。

1.3 主要試劑 胎牛血清(Hyclone公司)、神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、L-多聚賴氨酸 (Sigma公司)、B-27添加劑(Gibco公司)、神經(jīng)微絲(Sigma公司)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)試劑盒(上海執(zhí)誠)。主要溶液的配制：(1)種植培養(yǎng)液：90%的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%胎牛血清、0.2 mol/L的L-谷氨酰胺、100 U/ml的青霉素及100 mg/L的鏈霉素。(2)維持培養(yǎng)液：98%的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基、2% B-27添加劑、0.2 mol/L的L-谷氨酰胺、100 U/ml的青霉素及100 mg/L的鏈霉素。(3)無鎂細(xì)胞外液的配制：145 mmol/L氯化鈉、2.5 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、2 mmol/L氯化鈣、10 mmol/L葡萄糖、0.002 mmol/L甘氨酸，將上述重量的粉末溶于1 000 ml的三蒸水，用NaOH將pH調(diào)至7.2，過濾滅菌后置于4℃冰箱待用。無鎂細(xì)胞外液不含氯化鎂成分，其余成分與細(xì)胞外液成分相同。

1.4 儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma公司)，Zeiss Axiovert 200倒置相差熒光顯微鏡(德國(guó)Olympus公司)，SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)(蘇州凈化集團(tuán)安泰公司)。

1.5 方法

1.5.1 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)前一晚將小蓋玻片置于用培養(yǎng)基濕潤(rùn)過的12孔培養(yǎng)板，每個(gè)玻片小心滴加0.5 ml的多聚賴氨酸溶液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜，用三蒸水清洗3遍后晾干備用。取SD大鼠，斷頭取腦，將大腦投入裝有D-Hanks液的培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿底下墊冰)，暴露雙側(cè)海馬，鈍性分離海馬，置于另一個(gè)裝有D-Hanks液的培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿底下墊冰)，將海馬組織剪碎為1 mm×1 mm×1 mm的小塊。將剪碎的組織移入含有相當(dāng)于5倍腦組織體積的0.125%濃度胰酶的離心管中，在37℃水浴箱中作用20～25 min，加入4 ml種植培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕吹打細(xì)胞約30次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，在沉淀中再加適量種植培養(yǎng)液后，用吸管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，調(diào)整細(xì)胞終濃度為(1～2)×105個(gè)/ml，以此濃度接種于預(yù)先包被過的12孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。種板后10 h將培養(yǎng)液全量換成維持培養(yǎng)液，隨后每3 d半量換液。

1.5.2 神經(jīng)元的鑒定：采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以神經(jīng)微絲蛋白單克隆抗體標(biāo)記神經(jīng)元。

1.5.3 神經(jīng)元分組及難治性癲癇細(xì)胞模型的建立：將培養(yǎng)至第10天的海馬神經(jīng)元分為對(duì)照組、模型組及4個(gè)濃度的Res組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。對(duì)照組更換為正常細(xì)胞的細(xì)胞外液培養(yǎng)3 h后恢復(fù)維持培養(yǎng)液。模型組為更換為無鎂細(xì)胞外液培養(yǎng)3 h后恢復(fù)維持培養(yǎng)液，4個(gè)濃度的Res組經(jīng)無鎂細(xì)胞外液培養(yǎng)3 h后在每孔加入最終濃度為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L 的Res培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5.4 分別取上述各組細(xì)胞建立模型24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)液20 μl，按照LDH盒的說明，于全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定LDH。

1.5.5 觀察神經(jīng)突起連接的形態(tài)學(xué)變化：倒置相差熒光顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元及神經(jīng)突起的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)元鑒定 利用神經(jīng)微絲蛋白抗體鑒定，倒置顯微鏡下可見神經(jīng)元胞漿內(nèi)和軸突內(nèi)棕黃色陽性顆粒，視野中可見大部分為神經(jīng)元細(xì)胞，偶見非神經(jīng)元細(xì)胞，表明所采用得培養(yǎng)方法獲得的海馬神經(jīng)元純度相對(duì)較高。見圖1。

2.2 各組LDH活性的比較 與對(duì)照組相比，模型組及各濃度Res組的LDH活性顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，10 μmol/L Res組、20 μmol/L Res組、40 μmol/L Res組LDH的活性均有所減少(P<0.05)，其中40 μmol/L組達(dá)到最低；60 μmol/L組與模型組間LDH活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組的LDH活性比較(x±s，U/L)

注：與對(duì)照組比較，※P<0.05；與模型組比較，★P<0.05。

2.3 各組神經(jīng)突起連接的形態(tài)學(xué) 模型組未經(jīng)無鎂液處理前，神經(jīng)元光暈明顯，神經(jīng)元突起豐滿，神經(jīng)突起連接分布有序、均勻，見圖2；無鎂細(xì)胞外液處理3 h后，神經(jīng)元形態(tài)及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)光鏡下均未見明顯變化；造模24 h后可見神經(jīng)元胞體之間相互靠近，神經(jīng)突起之間相互遷移聚集，突起連接成“網(wǎng)格樣”變化，見圖3。各Res濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較模型組好，神經(jīng)元突起仍大多豐滿，僅出現(xiàn)少部分神經(jīng)突起遷移靠近聚集，大部分的突起連接分布均勻，其中以40 μmol/L Res組最明顯，見圖4。對(duì)照組與無鎂細(xì)胞外液處理前的模型組比較，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)無明顯變化。

圖1 SD大鼠的海馬神經(jīng)元神經(jīng)微絲蛋白免疫化學(xué)染色(×200)圖2 無鎂細(xì)胞外液處理前模型組的神經(jīng)元突起及神經(jīng)突起連接鏡下情況(×200)圖3 造模24h后模型組神經(jīng)突起及神經(jīng)突起連接的鏡下情況(×200)圖4 造模24h后40μmol/LRes組神經(jīng)突起及神經(jīng)突起連接的鏡下情況(×200)

3 討 論

通過體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，無鎂液作用3 h后，可成為自發(fā)穩(wěn)定放電癲癇細(xì)胞模型，該模型可作為難治性癲癇的細(xì)胞模型，已得到了很多研究者的認(rèn)可[2-4]，目前廣泛應(yīng)用于抗癲癇新藥的實(shí)驗(yàn)研究中[5-6]。Res存在于多種植物中，具有抗氧化、清除氧自由基、抗癲癇等多種生理活性。尤竹燕等[7]發(fā)現(xiàn)Res能抑制大鼠海馬CA1區(qū)誘發(fā)癲癇樣放電活動(dòng)。有研究表明發(fā)現(xiàn)Res通過上調(diào)癲癇動(dòng)物模型大鼠內(nèi)海馬內(nèi)源性抗氧化酶，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，對(duì)抗癲癇發(fā)作發(fā)生的氧化損傷從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8]。但Res對(duì)難治性癲癇細(xì)胞模型的影響未見有報(bào)告。

LDH是廣泛存在于神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的氧化還原酶，正常情況下釋放很少，細(xì)胞一旦受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外，且其水平與損傷程度呈正相關(guān)，可敏感反映細(xì)胞的活性。因此，通過測(cè)定LDH的量可以定量衡量細(xì)胞的損傷程度[9]。以往Res體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(包括了抗癲癇及缺血再灌注損傷模型)的給藥范圍為10～60 μmol/L[10-11]，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，選擇了10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L 4個(gè)劑量進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組及各濃度Res組的LDH活性顯著增加(P<0.05)，提示難治性癲癇模型大鼠的神經(jīng)元損傷；與模型組相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L Res組的LDH活性均有所減少(P<0.05)，其中40 μmol/L Res組最低，表明Res能減輕難治性癲癇細(xì)胞模型神經(jīng)元損傷，從病理生理學(xué)角度證明了Res對(duì)難治性癲癇細(xì)胞模型有確切的保護(hù)作用，其中以40 μmol/L Res組保護(hù)作用最強(qiáng)，提示Res的作用有一定的濃度依賴關(guān)系。但60 μmol/L Res組與模型組之間比較無顯著性差異(P>0.05)，提示60 μmol/L的Res對(duì)難治性癲癇模型的細(xì)胞活性無明顯影響，因此對(duì)于Res有效的藥物濃度仍有待于進(jìn)一步細(xì)致的研究。

難治性癲癇的發(fā)生機(jī)制與很多因素有關(guān)，目前神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說正受到普遍關(guān)注，研究已證實(shí)反復(fù)的癲癇發(fā)作可導(dǎo)致腦組織尤其是海馬結(jié)構(gòu)的損傷，引起齒狀回苔蘚纖維側(cè)枝發(fā)芽形成新的突觸聯(lián)系，最終形成異常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在難治性癲癇發(fā)病中有著重要意義[12-13]，促進(jìn)了難治性癲癇的形成和反復(fù)發(fā)作。有動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，Res是通過抑制苔蘚纖維發(fā)芽從而減少癇樣放電的頻率發(fā)揮抗癲癇的作用[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們同樣觀察到了難治性癲癇細(xì)胞模型中存在神經(jīng)突起連接的變化，表現(xiàn)為神經(jīng)突起相互遷移聚集，突起連接成“網(wǎng)格樣”變化，而Res干預(yù)組僅出現(xiàn)少部分神經(jīng)突起遷移聚集，大部分的突起連接分布均勻。由此我們推測(cè)Res對(duì)難治性癲癇細(xì)胞模型異常網(wǎng)絡(luò)的形成有一定抑制作用。

綜上所述，Res能減少難治性癲癇細(xì)胞模型的神經(jīng)元損傷，抑制異常神經(jīng)突起連接的形成。

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Effects of resveratrol on neuronal damage and neurite in cell model of intractable epilepsy

LIUXiu-ying1,WUYuan2,LANRui-fang1

(1DepartmentofNeurology,theFirstPeople′sHospitalofQinzhouCity,Qinzhou535000,China; 2DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the effects of resveratrol(Res) on the neuronal damage and morphologic change of neurite in cell model of intractable epilepsy.Methods On the 10th day of culture in vitro,the hippocampal neurons of neonatal rats were divided into control group,model group,10 μmol/L Res group,20 μmol/L Res group,40 μmol/L Res group and 60 μmol/L Res group.Control group and model group continued to be cultured with feeding medium after 3 hours of culturing with normal extracellular fluid and magnesium-free extracellular fluid respectively.Res culture medium with corresponding concentrations was added to the four Res groups after 3 hours of culturing with magnesium-free extracellular fluid.After 24 hours of modeling,the lactic dehydrogenase(LDH) activity of cell supernatant was detected in all groups,and the morphologic changes of neuron and neurite were observed in each group with optical microscope.Results Compared to control group,model group and four Res groups had significantly increased activities of LDH(P<0.05).The activities of LDH in 10 μmol/L Res group,20 μmol/L Res group and 40 μmol/L Res group decreased significantly compared to that in the model group(P<0.05),and the lowest activity was observed in 40 μmol/L Res group.But there was no statistical difference in the activity of LDH between 60 μmol/L Res group and model group(P>0.05).After 24 hours of modeling,the observation under optical microscope showed that neurites migrated closely to each other and connected to be grid-shaped in the model group,but a few neurites migrated closely to each other and most of neurites connections uniformly distributed in 40μmol/L Res group.Conclusion Res can reduce the neuronal damage in the cell model of intractable epilepsy,and can inhibit the formation of abnormal neurite connections.

Intractable epilepsy,Resveratrol,Neuron,Neurite,Cell model,Rat

劉秀穎(1983～)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：癲癇。

R 74

A

0253-4304(2016)02-0164-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.05

2015-11-24

2016-01-25)