呂 良 唐煥煥 陽艷麗 苑 博 陳夢青 陳高建 張可鋒盧 曦 鐘明利 徐 慶 韋京辰 羅 艷 韋桂嬌 蔣璐慧 段小群

(桂林醫(yī)學院1 藥學院，2 生物技術(shù)學院，桂林市 541004，E-mail：luliang998@163.com)

論著·基礎(chǔ)研究

D-葡萄糖同系物作為人類肝癌細胞BEL-7402熒光探針的價值▲

呂 良1唐煥煥1陽艷麗1苑 博1陳夢青1陳高建1張可鋒1盧 曦2鐘明利1徐 慶1韋京辰1羅 艷1韋桂嬌1蔣璐慧1段小群1

(桂林醫(yī)學院1 藥學院，2 生物技術(shù)學院，桂林市 541004，E-mail：luliang998@163.com)

目的 評價熒光D-葡萄糖同系物2-NBDG作為肝癌細胞BEL-7402熒光探針的價值。方法 肝癌細胞株BEL-7402培養(yǎng)24 h后分為實驗組及對照組，其中實驗組加入5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，對照組加入不含5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，再將兩組各分為兩個亞組加入不同濃度的2-NBDG(0.3 mmol/L、1 mmol/L)，即共4組：0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組、1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組、0.3 mmol/L 2-NBDG組、1 mmol/L 2-NBDG組。比較各組細胞熒光強度，分析2-NBDG在肝癌細胞BEL-7402中的攝取及熒光成像情況，以及D-葡萄糖對2-NBDG的抑制競爭作用。結(jié)果 0.3 mmol/L 2-NBDG組的相對熒光強度為(78.72±3.78)%，低于1 mmol/L 2-NBDG組的(100.00±8.23)%(P<0.05)。0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組的相對熒光強度為(20.67±1.46)%，明顯低于0.3 mmol/L 2-NBDG組的(78.72±3.78)%(P<0.05)。1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組的相對熒光強度為(22.23±2.01)%，明顯低于1 mmol/L 2-NBDG組的(100.00±8.23)%(P<0.05)。結(jié)論 2-NBDG可被肝癌細胞BEL-7402快速攝取，并可通過熒光強度的方式量化其攝取程度，D-葡萄糖可競爭性抑制肝癌細胞BEL-7402對2-NBDG攝取。2-NBDG可以作為人源肝癌細胞株BEL-7402的檢測熒光探針。

肝癌；肝癌細胞BEL-7402；D-葡萄糖同系物；熒光探針；糖攝取；診斷

目前，原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤的第5位，死亡率居全球第3位[1]。肝癌發(fā)病早期缺乏特征性癥狀，與多數(shù)消化道疾病的癥狀相似，因此很難在發(fā)病早期進行確診[2]。傳統(tǒng)惡性腫瘤的診斷是基于組織形態(tài)學的異常變化，通過CT、磁共振成像、超聲檢查等技術(shù)去辨認[3-4]。然而，對于惡性腫瘤細胞，其內(nèi)部異常代謝的發(fā)生會早于外部形態(tài)的變化，其中細胞的糖酵解加速即是典型表現(xiàn)[5]。與此同時，惡性腫瘤細胞對葡萄糖的攝取也會相應(yīng)地增多。因此，相關(guān)學者利用這一現(xiàn)象尋求更為靈敏的靶向檢查腫瘤組織的新方法，如放射核素標記的葡萄糖同系物在腫瘤細胞中的快速攝取[4-6]。但利用放射核素標記技術(shù)有諸多缺點，如放射性核素垃圾難以處理和消除、不能直接檢測單一的活細胞等[7]。熒光D-葡萄糖同系物{2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose，2-NBDG}易于通過熒光顯微鏡觀察，而不會帶來放射風險[8]。本研究采用肝癌細胞BEL-7402為研究對象，評價2-NBDG在肝癌細胞中的攝取情況以及作為肝癌細胞BEL-7402熒光探針的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 肝癌細胞BEL-7402(購自中山大學實驗動物中心)，DMEM普通培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，2-NBDG(Invitrogen公司)，D-葡萄糖(天津科密歐化學試劑公司)，胰酶細胞消化液(碧云天公司)，熒光顯微鏡(萊卡DM2000)。

1.2 方法

1.2.1 BEL-7402細胞培養(yǎng)：用DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素培養(yǎng)細胞，細胞每隔3～5 d按1 ∶5比例進行傳代。1.2.2 實驗方法：將BEL-7402細胞進行計數(shù)，以每孔1×104的細胞數(shù)種在48孔板中。培養(yǎng)24 h后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次后分為實驗組及對照組，其中實驗組加入含5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，對照組加入不含5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，再將兩組各分為兩個亞組加入不同濃度的2-NBDG(0.3 mmol/L、1 mmol/L)，即共4組：0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組、1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組、0.3 mmol/L 2-NBDG組、1 mmol/L 2-NBDG組。4組BEL-7402細胞均在37℃下孵育20 min，再用PBS洗3次后在熒光顯微鏡下觀察并攝像。實驗重復3次。 利用IPP6.0軟件計算各組細胞熒光強度。 1.3 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用 SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以(x±s)表示，比較均采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞攝入2-NBDG情況 2-NBDG孵育20 min后，在未加入D-葡萄糖的情況下，1 mmol/L 2-NBDG組細胞熒光強度大于0.3 mmol/L 2-NBDG組(圖1 a-2及c-2)，即細胞熒光強度呈劑量依賴性增加。在0.3 mmol/L 2-NBDG組中，與未加入D-葡萄糖組比較，加入D-葡萄糖后，細胞熒光強度呈顯著性減弱(圖1 a-2及b-2)。在1 mmol/L 2-NBDG組中，與未加入D-葡萄糖組比較，加入D-葡萄糖后，細胞熒光強度顯著性減弱(圖1 c-2及d-2)。見圖1。

圖1 2-NBDG標記后BEL-7402細胞光學成像(200×)

a和b為加入0.3 mmol/L 2-NBDG的BEL-7402細胞，其中a-1為正常培養(yǎng)條件下的細胞白光圖片，a-2為細胞熒光圖片，b-1為添加5 mmol/L D-葡萄糖下的細胞白光圖片，b-2為添加5 mmol/L D-葡萄糖的細胞熒光圖片；c和d為加入1 mmol/L 2-NBDG的BEL-7402細胞，其中c-1為正常培養(yǎng)條件下的細胞白光圖片，c-2為細胞熒光圖片，d-1為添加5 mmol/L D-葡萄糖的細胞白光圖片，d-2為添加5 mmol/L D-葡萄糖的細胞熒光圖片。

2.2 不同2-NBDG濃度組BEL-7402細胞的相對熒光強度 2-NBDG孵育20 min后，以1 mmol/L 2-NBDG組為100%的相對熒光強度，0.3 mmol/L 2-NBDG組的相對熒光強度為(78.72±3.78)%，低于1 mmol/L 2-NBDG組的(100.00±8.23)%(t=4.000，P=0.011)。

2.3 5 mmol/L D-葡萄糖對BEL-7402細胞攝取0.3 mmol/L 2-NBDG的影響 0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組的相對熒光強度為(20.67±1.46)%，明顯低于0.3 mmol/L 2-NBDG組的(78.72±3.78)%(t=31.866，P=0.001)。

2.4 5 mmol/L D-葡萄糖對BEL-7402細胞攝取1 mmol/L 2-NBDG的影響 1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組的相對熒光強度為(22.23±2.01)%，明顯低于1 mmol/L 2-NBDG組的(100.00±8.23)%(t=17.326，P=0.001)。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，0.3 mmol/L 2-NBDG組及1 mmol/L 2-NBDG組的相對熒光強度分別為(78.72±3.78)%、(100.00±8.23)%，這表明肝癌細胞BEL-7402可以快速攝取2-NBDG，并且2-NBDG在該細胞上具有激發(fā)熒光的作用，其進入細胞內(nèi)部后表現(xiàn)為聚集狀態(tài)，這是己糖激酶將其6位C磷酸化的結(jié)果[9]，這也易于觀察2-NBDG。而0.3 mmol/L 2-NBDG組的相對熒光強度低于1 mmol/L 2-NBDG組(P<0.05)，提示在2-NBDG一定劑量范圍內(nèi)，這種熒光強度與劑量(攝取量)成正比。此外，加入5 mmol/L D-葡萄糖后，0.3 mmol/L 2-NBDG及1 mmol/L 2-NBDG中BEL-7402細胞的相對熒光強度均明顯降低(P<0.05)，這表明D-葡萄糖可影響肝癌細胞BEL-7402對2-NBDG的攝取，呈競爭性抑制熒光強度的作用。

2-NBDG是一種新型帶熒光的葡萄糖類似物，在2位C原子位置有一個修飾過的2-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)氨基酸基團[6]。該熒光試劑激發(fā)熒光最佳波長為發(fā)射波長542 nm、激發(fā)波長467 nm。D-葡萄糖通過葡萄糖轉(zhuǎn)運子(glucose transporter，GLUT)的轉(zhuǎn)運進入細胞。已有實驗證明，D-葡萄糖可抑制細胞攝取2-NBDG，而L-葡萄糖不會呈現(xiàn)類似的抑制效果，這表明2-NBDG和D-葡萄糖是通過競爭與GLUT的結(jié)合從而進入細胞[10-12]。研究表明，GLUT1在腫瘤細胞廣泛表達，包括肝癌細胞[13-14]，因此，2-NBDG可以被這些廣泛表達GLUT1的腫瘤細胞攝取，這與我們的實驗結(jié)果是一致的。

本研究設(shè)計不足之處是沒有設(shè)置正常肝細胞作為研究對照。但有相關(guān)文獻報道，非腫瘤細胞對2-NBDG的攝取和聚集僅為腫瘤細胞的20%[15]。因此，2-NBDG是一種很好的熒光探針，已經(jīng)在臨床前和臨床腫瘤靶向診斷、監(jiān)測治療效果和靶向治療中被廣泛研究[16-17]。

綜上所述，2-NBDG可被肝癌細胞BEL-7402快速攝取，并可通過熒光強度的方式量化其攝取程度，D-葡萄糖可競爭性抑制肝癌細胞BEL-7402對2-NBDG攝取。因此，2-NBDG可作為肝癌細胞的葡萄糖代謝熒光標記應(yīng)用于診斷體外培養(yǎng)的肝癌細胞BEL-7402，這種帶熒光的葡萄糖類似物有望為肝癌的診斷和治療提供新的方式。

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Value of 2-NBDG as a fluorescent probe for BEL-7402 human hepatocarcinoma cells

LYULiang1,TANGHuan-huan1,YANGYan-li1,YUANBo1,CHENMeng-qing1,CHENGao-jian1,ZHANGKe-feng1,LUXi2,ZHONGMing-li1,XUQing1,WEIJing-chen1,LUOYan1,WEIGui-jiao1,JIANGLu-hui1,DUANXiao-qun1

(1SchoolofPharmacy,2SchoolofBiotechnology,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To evaluate the value of D-glucose analog(2-NBDG) as a fluorescent probe for BEL-7402 human hepatocarcinoma cells.Methods BEL-7402 human hepatocarcinoma cell strains were divided into experimental group with 5 mmol/L D-glucose and control group without 5 mmol/L D-glucose after 24 hours of culture.The two groups were divided into subgroups,and then were added with 2-NBDG with different concentrations(0.3 mmol/L and 1 mmol/L).There were 4 groups obtained,including 0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group,1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group,0.3 mmol/L 2-NBDG group and 1 mmol/L 2-NBDG group.The fluorescence intensities were compared among the 4 groups.The intake and fluorescence imaging of 2-NBDG in BEL-7402 human hepatocarcinoma cells were analyzed.And the competitive antagonism of 2-NBDG by D-glucose was also assessed.Results The relative fluorescence intensity of 0.3 mmol/L 2-NBDG group was (78.72±3.78)%,and was lower than that of 1 mmol/L 2-NBDG group[(100.00±8.23)%](P<0.05).The relative fluorescence intensity of 0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group was (20.67±1.46)%,and was significantly lower than that of 0.3 mmol/L 2-NBDG group[(78.72±3.78)%](P<0.05).The relative fluorescence intensity of 1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group was (22.23±2.01)%,and was significantly lower than that of 1 mmol/L 2-NBDG group[(100.00±8.23)%](P<0.05).Conclusion BEL-7402 human hepatocarcinoma cells can intake 2-NBDG rapidly,and the intake can be assessed quantitatively by the fluorescence intensity.D-glucose might competitively inhibit the intake of 2-NBDG in BEL-7402 hepatocarcinoma cells.2-NBDG can be taken as a fluorescent probe for BEL-7402 human hepatocarcinoma cells. 【Key words】 Hepatocarcinoma,BEL-7402 hepatocarcinoma cell,2-NBDG,Fluorescent probe,Glucose intake,Diagnosis

國家自然科學基金(81460619)；廣西科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)項目(132907)

呂良(1980～)，男，博士，講師，研究方向：藥理學。

段小群(1972～)，男，博士，教授，研究方向：藥物開發(fā)與藥理學，E-mail：xiaoqunduan@163.com。

R 735.7

A

0253-4304(2016)02-0149-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.01

2015-11-01

2015-12-16)