朱麗英 劉鑫 袁靜 劉麗榮

(貴陽醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院,貴州 貴陽 550004)

血清循環(huán)DNA微衛(wèi)星位點雜合性缺失對宮頸癌與卵巢癌診斷的應用價值研究

朱麗英 劉鑫 袁靜 劉麗榮△

(貴陽醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院,貴州 貴陽 550004)

目的 探討血清循環(huán)DNA微衛(wèi)星位點雜合性缺失(LOH)對宮頸癌與卵巢癌的診斷應用價值。方法 選取6個微衛(wèi)星位點，采用血液基因組DNA提取試劑盒抽提各組血清標本循環(huán)DNA 、PCR、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色對63例宮頸癌和33例卵巢癌(病例組)、63例子宮肌瘤(良性對照組)、63名健康成年女性血清標本(健康對照組)進行檢測。結果 宮頸癌在D3S1038、D3S1300、D3S1228位點LOH頻率分別為53.4%、60.3%、57.1%；卵巢癌在D17S579、D17S855、D17S786、D3S1038位點的LOH頻率分別為：45.5%、42.4%、27.3%、51.3%；所有位點的病例組與健康對照組的LOH差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；宮頸癌D3S1228位點與良性對照組的LOH差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；卵巢癌D17S579與D17S855位點與良性對照組的LOH差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 宮頸癌D3S1228位點及卵巢癌D17S579、D17S855位點具有較高的LOH，為進一步研究血清循環(huán)DNA作為宮頸癌與卵巢癌的遺傳學輔助診斷指標提供了一定的實驗基礎。

循環(huán)DNA； 宮頸癌； 卵巢癌； 雜合性缺失

許多腫瘤患者循環(huán)DNA(circulatingcell-DNA，c-DNA)與正常人相比有很大差異，尤其是循環(huán)DNA檢測避免了當前分子診斷需要采集癌組織作為標本來源的困難，是一種有潛力的腫瘤標志物。研究[1]發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤患者血清中c-DNA具有與腫瘤組織中DNA相一致的分子遺傳學改變，如雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH) 。因此，尋找并確定宮頸癌及卵巢癌基因的LOH高發(fā)位點，對其輔助診斷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 收集自2013年7月至2015年2月在貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院和貴州省腫瘤醫(yī)院經(jīng)臨床病理檢查確診為宮頸癌患者63例、卵巢癌患者33例、子宮肌瘤患者和健康成年女性各63例血清標本，分別于-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 血液基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生物有限公司；引物合成由上海生工生物工程公司合成；Mix Taq DNA聚合酶購自大連TaKaRa公司；丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺購自上海華美公司；乙二胺四乙酸(EDTA)購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 血清循環(huán)DNA的提取 取600 μL血清標本，按DNA提取試劑盒的說明操作。分別取子宮肌瘤患者血清標本作為良性對照組，健康成年女性血清標本作為從作健康對照組。

1.2.2 PCR 本研究所用微衛(wèi)星有D3S1038、D3S1300、D3S1228、D17S579、D17S855、D17S786，其PCR 產(chǎn)物大小( bp ) 分別為115 bp、49 bp、89 bp、96 bp、104 bp、135 bp。所有位點的標志參數(shù)均查自Gene Bank。PCR反應體系25 μL:含 Mix Taq聚合酶12.5 μL,各種引物5 μL、模版DNA 4.0 μL、無菌雙蒸水3.5 μL 。95℃預變性10 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s,共35個循環(huán)；72 ℃7 min，4℃保存。

1.2.3 電泳 取PCR產(chǎn)物5 μL，加4 μL Loading buffer充分混勻，室溫下8%變性聚丙烯酰胺凝膠溶液電泳，加樣后120 V穩(wěn)壓電泳約1 h。

1.2.4 銀染色 膠板浸入10% 乙醇45 min，0.2%AgNO3，35 min，3%Na2CO35 min，5%冰乙酸終止顯色。每一步反應后都用雙蒸水清洗。

1.2.5 結果判定 LOH判定標準：參照文獻[2]的判定, 與健康對照組多肽性條帶相對照，基因條帶消失或密度減少50% 以上為LO H。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗結果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，采用χ2檢驗。

2 結 果

宮頸癌在病例組D3S1038、D3S1300、D3S1228位點的LOH發(fā)生率分別為53.4%、60.3%、57.1%；子宮肌瘤在良性對照組D3S1038、D3S1300、D3S1228位點的LOH發(fā)生率分別為38.1%、46.0%、34.9%；宮頸癌3個位點與健康對照組的LOH差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；子宮肌瘤D3S1300位點與健康對照組的LOH差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；宮頸癌D3S1228位點與良性對照組的LOH差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

卵巢癌在D17S579、D17S855、D17S786、D3S1038位點的LOH率分別為：45.5%、42.4%、27.3%、51.3%。子宮肌瘤在D17S579、D17S855、D17S786、D3S1038位點的LOH率分別為：22.2%、17.5%、12.7%、38.1%。卵巢癌4個位點的病例組與健康對照組的LOH差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；子宮肌瘤D17S579、D3S1038位點與健康對照組的LOH差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)卵巢癌D17S579和D17S855位點與良性對照組的LOH差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 卵巢癌各位點發(fā)生LOH頻率[n(%)]

注：與健康對照組比較，*P<0.05，#P<0.05；與良性對照組比較，△P<0.05。

3 討 論

c-DNA是一種存在于動、植物和人的體液中的無細胞狀態(tài)的胞外DNA。研究[3]表明，外周血c-DNA一部分以游離形式存在于血清中，體細胞抑癌基因的失活是導致癌變的一個主要因素，常表現(xiàn)為LOH。染色體LOH是指腫瘤基因組中特定染色體上某種DNA多態(tài)標記(如微衛(wèi)星標記)的等位基因片段由正常組織基因組的兩種變成一種，即等位基因型由雜合子變成純合子。造成LOH的原因可能是多位點染色體事件(如缺失、有絲分裂重組及不分離)、基因轉(zhuǎn)變和點突變的結果，從而導致抑癌基因附近的側翼標記丟失，結果抑癌基因附近區(qū)域與發(fā)生第一次突變的等位基因相連的序列，成為純合性或半合性。

D3S1300和D3S1228兩個位點均位于3p14基因內(nèi)部，D3S1038位點定位于3p25。對于染色體3p對宮頸癌早期診斷是否有預測作用，存在一定的爭議[4]。本研究的檢測結果表明，宮頸癌D3S1228位點LOH發(fā)生率明顯高于子宮肌瘤組(P<0.05)，因此，我們認為3p區(qū)域LOH對宮頸癌的診斷有重要的預測作用。張國玲[5]等發(fā)現(xiàn)50例原發(fā)性上皮性良惡性卵巢腫瘤(40例癌組織10例非癌組織)3p25 處LOH頻率為40.0%。在本次研究中， D3S1038位點發(fā)生LOH的頻率為51.5%。

D17S579位點和D17S855位點位于17q21，均與BRCA1基因連鎖，其中D17S855位點位于BRCA1基因內(nèi)部，而D17S579位點位于BRCA1基因的外側。D17S786與p53基因連鎖。劉爭等[6]發(fā)現(xiàn)在乳腺型導管增生組中，D17S855、D17S579位點LOH頻率分別為10%、16.7%，在浸潤性導管癌中LOH頻率均>25%。本研究結果顯示，卵巢癌在D17S579、D17S855位點LOH發(fā)生率明顯高于子宮肌瘤組(P<0.05)，因此，我們推測BRCA1基因相關的D17S855位點、D17S579位點的LOH對卵巢癌的診斷有重要的預測作用。劉銘等[7]采用PCR熒光測序儀凝膠電泳檢測34例食管癌患者手術切除的鱗狀細胞癌組織在D17S786等16個MS位點的LOH狀況，鱗狀細胞癌在D17S786位點LOH頻率為69.5%。本研究的檢測結果表明，卵巢癌D17S786位點發(fā)生LOH頻率>25%，由此我們推測D17S786位點是卵巢癌發(fā)展中發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的腫瘤抑制因子，它可能是一個卵巢癌高發(fā)的基因標志物。但能否最終應用于臨床上作為診斷卵巢癌的特異性基因標志物還需進一步作大量深入的研究及隨訪調(diào)查證實。

(本文圖1見封三)

[1] 薛建祥，龔波，俞菁，等．乳腺癌患者血清游離DNA的定量檢測[J]．腫瘤，2011，31(12)：1099-1102．

[2] 成凡，楚雍烈，賀大林，等．尿脫落細胞6號染色體長臂的微衛(wèi)星改變診斷膀胱腫瘤[J]．第四軍醫(yī)大學學報，2003，24(8)：693-695．

[3] 趙心亮，田廣明，田亞平．人體循環(huán)游離DNA應用的研究進展[J]．臨床檢驗雜志，2013，31(2)：109-114．

[4] 王靖，張煦，徐星榕，等．宮頸癌染色體雜合性缺失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析[J]．西北國防醫(yī)學雜志,2009,3(30):174．

[5] 張國玲，陳鳴之，楊慧娟，等．上皮性卵巢腫瘤中 3P14 、3P25 雜合性丟失[J].中國癌癥雜志，2011,11(5)：416-417．

[6] 劉爭，趙華，羅志永，等．乳腺癌與癌前病變微衛(wèi)星DNA雜合性缺失研究[J]．中國實驗診斷學，2011，15(4)：592-595．

[7] 劉銘，曾會昌，張曉莉．食管鱗狀細胞癌及癌前病變組織中多個染色體區(qū)域微衛(wèi)星雜合性缺失的研究[J]．中華外科雜志，2008，46(17)：1337-1339．

Diagnostic value of serum circulating DNA microsatellite LOH for cervical cancer and ovarian cancer

ZhuLiying,LiuXin,YuanJing,LiuLirong.

DepartmentofClinicalLaboratoryScience,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China.

Objective To explore the efficiency of serum circulating DNA microsatellite LOH in the diagnosis of cervical cancer and ovarian cancer. Methods Six sites of microsatellite were selected. Serum circulating DNA (c-DNA) was extracted with blood genomic DNA extraction kit. LOH were detected with polymerase chain reaction (PCR) and denaturing polyacry1amide gelelectrophoresis in 63 cases of varian cancer, 33 cases of ovarian cancer (pathological group), 63 cases of hysteromyoma (benign group) and 63 healthy adult women serum (healthy control group). Results The rates of LOH on cervical cancer at D3S1038, D3S1300 and D3S1228 were 53.4%, 60.3% and 57.1% respectively. The rates of LOH on ovarian cancer at D17S579, D17S855 , D17S786 and D3S1038 were 45.5%, 42.4%, 27.3% and 51.3% respectively. Significant difference was observed in LOH between pathological group and healthy control group at all the sites (P<0.05). There was significant difference in LOH rates between benign group and cervical cancer at D3S1228, and between benign group and ovarian cancer at D17S579 and D17S855 (P<0.05). Conclusion LOH on D3S1228 are common in cervical cancer ,and LOH on D17S579 and D17S855 are common in ovarian cancer. This study could provide the experimental basis for further study on serum c-DNA as auxiliary diagnostic indicators of cervical cancer and ovarian cancer.

Circulating DNA; Cervical cancer; Ovarian cancer; Loss of heterozyosity

貴州省科學技術基金[黔科合J字(2011)2233號]

R737.31；R737.33

A

1000-744X(2016)01-0011-02

2015-10-21)

△通信作者，E-mail:249018257@qq.com