祝成亮，李 艷，袁 麗，劉興暉

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430060；2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗科，上海 200135)

乙型肝炎病毒對白細(xì)胞介素35表達(dá)影響的研究

祝成亮1，李 艷1，袁 麗1，劉興暉2

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430060；2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗科，上海 200135)

目的 探討乙型肝炎病毒(HBV)對白細(xì)胞介素35(IL-35)表達(dá)的影響。方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測108例乙型肝炎患者和115例健康對照者IL-35的血清含量，將HBV感染性克隆pHBV1.3轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)及ELISA檢測細(xì)胞IL-35 mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果HBV患者IL-35血清水平明顯高于健康對照者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染pHBV1.3后IL-35mRNA及蛋白的表達(dá)升高。結(jié)論HBV能夠上調(diào)IL-35的表達(dá)。

乙型肝炎病毒；白細(xì)胞介素35；酶聯(lián)免疫吸附試驗；表達(dá)

乙型肝炎病毒(HBV)是導(dǎo)致乙型肝炎和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的病原體。研究表明，HBV感染后引起機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)很多炎癥因子的過度表達(dá)和分泌，導(dǎo)致肝細(xì)胞的破壞和肝臟組織的損傷[1]。白細(xì)胞介素35(IL-35)屬于IL-12家族的新成員，包括病毒誘導(dǎo)基因3(EBI3)和IL-12 p35兩個亞基，是一種抑制性細(xì)胞因子，由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞合成和分泌[2]。但目前尚未有HBV與IL-35相關(guān)性的研究報道。本研究主要通過體內(nèi)外實驗探討HBV對IL-35表達(dá)的影響，為揭示HBV的致病機(jī)理奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院臨床確診的乙型肝炎患者108例，其中，男65例，女43例，平均(35.9±15.3)歲。選擇115例健康體檢者作為正常對照組，其中男性62例，女性53例，平均(37.8±16.8)歲。所有患者均無其他嗜肝病毒的感染。

1.2 材料 單核細(xì)胞株THP-1由武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心提供RNA提取試劑TRIzolR購自invitrogen公司；IL-35 ELISA檢測試劑盒購自Cusabio Biotech公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；HBV感染性克隆pHBV1.3由本室保存；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 THP-1細(xì)胞的培養(yǎng) THP-1培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液(含10%的胎牛血清，100 mg/L鏈霉素和100 U/ml青霉素)，在37℃、濃度為5%CO2恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待THP-1細(xì)胞至對數(shù)生長晚期，4℃離心收集細(xì)胞，洗滌后加入電穿孔緩沖液重懸，加入質(zhì)粒DNA混勻，設(shè)置電壓為300 V，電流1 000μF進(jìn)行電穿孔。

1.3.3 RT-PCR檢測 TRIzolR提取THP-1細(xì)胞的RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用IL-35兩個亞基基因的檢測引物p35：5'-CTCCTTGTGGCTACCCTG-3'(上游引物)，5'-GCAACTCCCATTAGTTATGAA-3'(下游引物)，EBI3：5'-CCGCCTGCTCCAAACTCCAC-3'(上游引物)，5'-CGGGCTTGATGATGTGCTCTGT-3'(下游引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時用β-actin的檢測引物進(jìn)行平行PCR擴(kuò)增[3]，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3.4 ELISA檢測 IL-35檢測采用ELISA檢測試劑盒，按照說明書操作進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，健康對照和HBV患者IL-35血清含量的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV患者IL-35血清水平升高 筆者采用ELISA分別檢測了HBV患者和健康體檢者的IL-35血清含量。結(jié)果顯示，HBV患者血清IL-35水平為(387.3±126.5)pg/ml，健康對照為(158.7±48.4)pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 HBV在細(xì)胞水平上調(diào)IL-35 mRNA和蛋白的表達(dá) 為探討HBV在細(xì)胞水平對IL-35表達(dá)的影響，筆者將HBV感染性克隆pHBV1.3轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，同時設(shè)立轉(zhuǎn)染空載體pBlue-ks作為空白對照。48 h后，筆者檢測了IL-35 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pHBV1.3后IL-35 mRNA表達(dá)上調(diào)，同時細(xì)胞上清中IL-35的含量較空白對照高[(216.3±25.1)pg/ml vs(136.5±18.7)pg/ml]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 IL-35兩個亞基p35和EBI3 mRNA的檢測

3 討論

HBV感染是一個全球性問題，大約20億人感染乙肝病毒，其中有3.5億人為慢性感染。HBV感染會導(dǎo)致急性或慢性肝損傷，甚至肝硬化、肝細(xì)胞癌[4]，但HBV的致病及致癌機(jī)理目前尚不清楚。研究表明，HBV感染機(jī)體會引起一些細(xì)胞因子表達(dá)水平的改變，如IL-6、IL-12在HBV感染后血清水平升高[5]。我們前期的研究工作也發(fā)現(xiàn)HBV患者IL-27的表達(dá)水平升高，本研究通過體內(nèi)試驗探討了HBV對IL-35表達(dá)的影響。檢測結(jié)果顯示，HBV患者IL-35血清含量高于正常對照，表明HBV能夠在體內(nèi)上調(diào)IL-35的表達(dá)，進(jìn)一步通過細(xì)胞水平進(jìn)行了證實，pHBV1.3是HBV的感染性克隆，將pHBV1.3轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞株THP-1建立HBV細(xì)胞感染的模型[3]，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pHBV1.3后，IL-35 mRNA和蛋白的含量均升高，證實HBV能夠在體外上調(diào)IL-35的表達(dá)。

IL-35是IL-12家族的新成員，主要有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg)合成和分泌，具有重要的生物學(xué)功能，如刺激Treg細(xì)胞增殖、抑制Teff增殖、抑制Th17細(xì)胞的分化等，同時在機(jī)體抗感染，自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展等方面均發(fā)揮著重要作用[5]。

目前認(rèn)為，HBV致病并非HBV直接損傷肝細(xì)胞，而是由于病毒感染人體后所引發(fā)的機(jī)體免疫應(yīng)答導(dǎo)致肝臟的病理性損傷所致。HBV感染后引起體內(nèi)細(xì)胞因子如IL-27、IL-35等的過量表達(dá)，這些細(xì)胞因子參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，過度的炎癥反應(yīng)引起肝臟不斷地被修復(fù)和損傷，逐漸發(fā)展為肝纖維化，最終會導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。

綜上所述，本研究證實了HBV能夠在體內(nèi)外上調(diào)IL-35的表達(dá)，但HBV如何調(diào)節(jié)IL-35的表達(dá)，其分子機(jī)制如何？IL-35對HBV的復(fù)制有無影響，尚待進(jìn)一步研究。

[1]Busca A,Kumar A.Innate immune responses in hepatitis B virus (HBV)infection[J].Virol J,2014,11:22.

[2]Yang Y,Xuan M,Zhang X,et al.Decreased IL-35 levels in patients with immune thrombocytopenia[J].Hum Immunol,2014,75(8): 909-913.

[3]Zhu CL,Zhang R,Liu L,et al.Hepatitis B virus enhances interleukin-27 expression bothin vivoandin vitro[J].Clin Immunol,2009, 131(1):92-97.

[4]You CR,Lee SW,Jang JW,et al.Update on hepatitis B virus infection[J].World J Gastroenterol,2014,20(37):13293-13305.

[5]Wang S,Chen Z,Hu C,et al.Hepatitis B virus surface antigen selectively inhibits TLR2 ligand-induced IL-12 production in monocytes/ macrophages by interfering with JNK activation[J].J Immunol, 2013,190(10):5142-5151.

Effect of hepatitis B virus on the expression of interleukin 35.

ZHU Cheng-liang1,LI Yan1,YUAN Li1,LIU Xing-hui2.1.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA; 2.Department of Clinical Laboratory,Shanghai Pudong New District Gongli Hospital,Shanghai 200135,CHINA

ObjectiveTo oexplore the effect of hepatitis B virus(HBV)on the expression of interleukin 35 (IL-35).MethodsSerum levels of IL-35 in 108 patients of HBV and 115 healthy controls were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).HBV infectious clone pHBV1.3 was transfected into HepG2 cells. RT-PCR and ELISA were used to measure the expression of mRNA and protein.ResultsSerum level of IL-35 was significantly higher in HBV patients as compared with healthy controls(P＜0.05).Expression of IL-35 mRNA and protein were elevated with pHBV1.3 transfected.ConclusionHBV can upregulate the expression of IL-35.

Hepatitis B virus;Interleukin 35;Enzyme-linked immunosorbent assay;Expression

R512.6+2

A

1003—6350（2015）19—2874—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1045

2015-04-14)

國家自然科學(xué)基金(編號：81101485)；國家臨床重點?？茖ｍ椊?jīng)費(編號：2010305)；湖北省自然科學(xué)基金(編號：ZRY2014000315)

李 艷。E-mail：48329061@qq.com