董閃閃,張 潔,劉 璠,秘玉靜,李欣盼,周慧敏

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院:1.內(nèi)分泌科;2.檢驗(yàn)科，石家莊 050031)

2型糖尿病腎病患者尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平與氧化應(yīng)激的相關(guān)性*

董閃閃1,張 潔1,劉 璠1,秘玉靜2,李欣盼1,周慧敏1

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院:1.內(nèi)分泌科;2.檢驗(yàn)科，石家莊 050031)

目的 探討2型糖尿病(T2DM)并發(fā)不同程度腎病患者尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白(PCX)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)水平變化，及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系。方法 186例T2DM患者按照24 h尿清蛋白排泄率(UAER)分為單純T2DM組(SDM組，62例)、微量組(NA組，60例)、大量組(MA組，64例),另取24 h UAER正常者作對(duì)照(NC組，60例)。分別檢測(cè)PCX、VEGF、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-px)和丙二醛(MDA)水平。結(jié)果 與其他3組比較，MA組VEGF、PCX及MDA水平最高(P<0.01)，SOD和GSH-px水平最低(P<0.01，P<0.05)。VEGF、UAER、HbA1c是尿PCX的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論 糖尿病腎病患者尿PCX及血VEGF與氧化應(yīng)激相關(guān)，氧化應(yīng)激與足細(xì)胞的損傷密切相關(guān)。

糖尿病腎病;尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;氧化性應(yīng)激

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，目前已成為引起終末期腎病的主要原因。而其具體發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。足細(xì)胞附著于腎小球基底膜外側(cè)，參與構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)膜的最后一道屏障。足細(xì)胞的損傷和脫落與蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)，是腎小球硬化形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素[1-2]。最近人體活組織檢查研究表明，DN發(fā)病過(guò)程中足細(xì)胞功能及結(jié)構(gòu)上的損傷早期已出現(xiàn)[3]。足細(xì)胞標(biāo)志蛋白(PCX)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)主要表達(dá)于足細(xì)胞，是足細(xì)胞損傷的主要標(biāo)志物。腎臟對(duì)氧化損傷敏感，多項(xiàng)研究證實(shí)氧化應(yīng)激在DN的發(fā)病中起著重要作用。DN發(fā)生時(shí)活性氧(ROS)產(chǎn)生增加，ROS可介導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡，同時(shí)誘導(dǎo)PCX的脫落，促進(jìn)VEGF的過(guò)度表達(dá)，是引起足細(xì)胞損傷的主要原因。體內(nèi)主要的氧化應(yīng)激標(biāo)志物丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，反映了細(xì)胞氧化損傷程度。抗氧化應(yīng)激物質(zhì)的減少是引起足細(xì)胞損傷的另一主要原因，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-px)是體內(nèi)的最重要的抗氧化酶[4]。本研究旨在探討DN患者尿PCX及血VEGF與氧化應(yīng)激的相關(guān)性，并為DN患者足細(xì)胞損傷的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年3月至2014年5月本院2型糖尿病(T2DM)患者186例(T2DM組)，均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)24 h尿清蛋白排泄率(UAER)分為單純糖尿病組(UAER<20 μg/min,SDM組)62例、微量組(20 μg/min≤UAER<200 μg/min，NA組)60例、大量組(UAER≥200 μg/min，MA組)64例，另選取60例健康體檢者為對(duì)照者(NC組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有研究對(duì)象均符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并取得倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)及簽署知情同意書(shū)；(2)研究對(duì)象均排除糖尿病急性并發(fā)癥、泌尿系感染、其他腎臟疾病、高血壓、嚴(yán)重心腦肺疾病、嚴(yán)重肝病、精神心理疾病及其他內(nèi)分泌等疾病；(3)1年未服用過(guò)抗氧化應(yīng)激藥物；(4)無(wú)手術(shù)、外傷等應(yīng)激情況。各組患者年齡、性別、BMI、收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組臨床一般資料比較(±s)

1.2 方法 測(cè)量身高、體質(zhì)量、血壓，計(jì)算BMI。空腹10 h抽靜脈血，采用美國(guó)貝克曼DXC800進(jìn)行全血生化測(cè)定,采用Vantage(德國(guó)，拜耳)測(cè)定糖化血紅蛋白(HbA1c)。采用ELISA法測(cè)定血VEGF(晶美生物工程有限公司)。采用比色法測(cè)定SOD、GSH-px和MDA(南京建成生物工程研究所)。留取晨尿10 mL采用ELISA法測(cè)定PCX(上海越研生物科技有限公司)，同日留取24 h尿檢測(cè)UAER。

2 結(jié) 果

2.1 各組糖代謝指標(biāo)的比較 與NC組比較，T2DM組患者空腹血糖(FPG)及HbA1c高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T2DM 3組間比較，NA組及MA組FPG及HbA1c高于SDM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組糖代謝指標(biāo)比較(±s)

a:P<0.01，與NC組比較；b:P<0.01,與SDM組比較。

2.2 各組VEGF、PCX及UAER比較 與NC組比較，T2DM組患者VEGF、PCX及UAER高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T2DM 3組患者VEGF、PCX及UAER為SDM組

2.3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較 與NC組比較，T2DM組患者M(jìn)DA高于NC組，T2DM組患者GSH-px及SOD低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T2DM 3組患者M(jìn)DA水平為SDM組NA組>MA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.4 Pearson相關(guān)分析 尿PCX與UAER、MDA、VEGF、FPG、HbA1c呈正相關(guān)(r=0.823，0.823,0.870,0.639,0.700)，與SOD、GSH-px呈負(fù)相關(guān)(r=-0.739，-0.474，均P<0.05)；血VEGF與PCX、UAER、MDA、FPG、HbA1c呈正相關(guān)(r=0.870,0.794,0.877,0.672,0.707)，與SOD、GSH-px呈負(fù)相關(guān)(r=-0.771，-0.514，均P<0.05)。

2.5 多元逐步回歸分析 以PCX為因變量，UAER、SOD、GSH-px、MDA、VEGF、FPG、HbA1c、病程、BMI、SBP、DBP、血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)為自變量進(jìn)行多元逐步回歸分析，回歸方程為Y=-10.56+0.032(VEGF)+0.029(UAER)+1.043(HbA1c)，P<0.01,說(shuō)明VEGF、UAER、HbA1c是尿PCX的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 各組VEGF、PCX及UAER比較(±s)

a:P<0.01，與NC組比較；b:P<0.01,與SDM組比較；c：P<0.01，與NA組比較。

表4 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較(±s)

a:P<0.01，與NC組比較;b:P<0.05,c:P<0.01，與SDM組比較;d:P<0.05,e:P<0.01,與NA組比較。

3 討 論

腎小球的臟層上皮細(xì)胞又稱(chēng)為足細(xì)胞，是一種終末分化的多突狀細(xì)胞，分化成熟后一般不能再生，是腎小球?yàn)V過(guò)膜的重要構(gòu)成部分[5]。PCX是一種唾液酸黏蛋白分子，正常表達(dá)于足細(xì)胞，固定于足細(xì)胞頂膜構(gòu)成腎小球分子屏障，同時(shí)因其帶負(fù)電荷，故又參與構(gòu)成腎小球的電荷屏障[6]。Hara等[7]、Ye等[8]多項(xiàng)研究表明PCX是T2DM患者足細(xì)胞損傷的早期標(biāo)志物，ELISA法可準(zhǔn)確檢測(cè)尿中PCX的水平，本研究表明T2DM組尿PCX明顯高于NC組,FPG與尿PCX呈正相關(guān)，HbA1c是PCX獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明高血糖可導(dǎo)致足細(xì)胞的損傷，進(jìn)一步研究表明UAER是PCX獨(dú)立危險(xiǎn)因素，尿PCX排泄增多可反映出足細(xì)胞的損傷呈進(jìn)行性加重，提示PCX與足細(xì)胞損傷程度相平行。隨著尿PCX逐漸升高，UAER亦逐漸升高，證實(shí)尿PCX的水平可反應(yīng)腎臟損傷的嚴(yán)重程度。

VEGF即血管通透因子，具有增加血管通透性作用。足細(xì)胞是表達(dá)VEGF最豐富的細(xì)胞，生理情況下足細(xì)胞分泌的VEGF 通過(guò)自分泌方式調(diào)節(jié)自身鈣離子平衡，降低細(xì)胞毒性，提高足細(xì)胞存活率，同時(shí)對(duì)維持腎小球基底膜的完整性及正常功能起著重要作用，而腎小球發(fā)生病理改變時(shí)足細(xì)胞表達(dá)VEGF也相應(yīng)發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)VEGF與FPG、HbA1c呈正相關(guān)，說(shuō)明高血糖可通過(guò)蛋白激酶C(PKC)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)介導(dǎo)的PKC-ERK 機(jī)制促進(jìn)足細(xì)胞VEGF mRNA 及蛋白的表達(dá)[9]引起VEGF分泌增多，過(guò)高分泌的VEGF可引起足細(xì)胞Ⅳ型膠原分泌增多，從而引起基底膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成更大的孔，使大分子蛋白更易通過(guò)，同時(shí)還可引起足細(xì)胞的損傷和凋亡，在蛋白尿的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[10]。本研究驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)，血VEGF與UAER、PCX呈顯著正相關(guān)，隨血VEGF分泌增多，UAER、PCX隨之升高，MA組VEGF、PCX顯著高于其他組。

最近研究證實(shí)[4]，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)在DN發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。ROS產(chǎn)生過(guò)多和/或抗氧化系統(tǒng)活性降低可導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加,本研究表明T2DM組代表氧化損傷水平的MDA顯著高于NC組，代表抗氧化水平的SOD、GSH-px顯著低于NC組，且隨著UAER的升高，氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡逐漸加重，MA組MDA最高，SOD、GSH-px最低證實(shí)了上述觀點(diǎn)。DN發(fā)生時(shí)高血糖通過(guò)多元醇途徑、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)途徑、PKC途徑和氨基己糖途徑導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增多[4]，進(jìn)一步激活p38MAPK途徑引起足細(xì)胞凋亡，同時(shí)通過(guò)ERK1/2的磷酸化導(dǎo)致足突形態(tài)發(fā)生改變[11]，引起PCX的脫落。本研究表明PCX與MDA呈正相關(guān)，與SOD、GSH-px呈負(fù)相關(guān)，且隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)的加重，尿PCX排泄增多，MA組PCX最高，這與Lin等[12]研究一致，抗氧化劑α-硫辛酸通過(guò)減輕氧化應(yīng)激可使尿PCX排泄減少。同時(shí)Susztak等[13]研究表明ROS介導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡，ROS可直接攻擊足細(xì)胞，并激活足細(xì)胞還原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸磷酸氧化酶產(chǎn)生過(guò)多的ROS，從而形成惡性循環(huán)。ROS產(chǎn)生增多可啟動(dòng)高遷移率蛋白 1，激活c-jun氨基末端激酶誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)[14]，研究發(fā)現(xiàn)VEGF與MDA呈正相關(guān)，與SOD、GSH-px負(fù)相關(guān)，SDM組中足細(xì)胞分泌的VEGF已顯著增加，隨著UAER升高，氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行性加重，VEGF水平相應(yīng)升高，Thallas-Bonke等[15]研究表明氧化應(yīng)激的減輕可使VEGF分泌減少。此外VEGF與足細(xì)胞損傷密切相關(guān)[16]，VEGF可介導(dǎo)單核吞噬細(xì)胞的趨化或活化，進(jìn)而產(chǎn)生大量毒性的促生長(zhǎng)物質(zhì)，如蛋白水解酶、血小板活化因子及生長(zhǎng)因子等從而引起足細(xì)胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)VEGF是尿PCX的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明過(guò)高分泌的VEGF一方面可直接引起PCX的丟失，從而引起腎小球分子屏障及電荷屏障受損，另一方面可引起腎小球毛細(xì)血管通透性加大，促使大分子蛋白濾過(guò)，這些可能是蛋白尿形成的主要原因。

氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)可以直接引起PCX的丟失，同時(shí)促使足細(xì)胞分泌過(guò)多的VEGF，進(jìn)而引起足細(xì)胞的損傷和凋亡，這可能是DN進(jìn)行性惡化的主要原因，所以，盡早改善高血糖及氧化應(yīng)激，可延緩DN的發(fā)生，并為治療DN開(kāi)辟了新的途徑。

[1]Matsui K,Kamijo-Ikemori A,Hara M,et al.Clinical significance of tubular and podocyte biomarkers in acute kidney injury[J].Clin Exp Nephrol,2011,15(2):220-225.

[2]Merscher S,Fornoni A.Podocyte pathology and nephropathy-sphingolipids in glomerular diseases[J].Front Endocrinol (Lausanne),2014,5(5):127.

[3]Maezawa Y,Takemoto M,Yokote K.Cell biology of diabetic nephropathy:Roles of endothelial cells,tubulointerstitial cells and podocytes[J].J Diabetes Investig,2015,6(1):3-15.

[4]Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications-A unifying mechanism[J].Diabetes,2005,54(6):1615-1625.

[5]Tsilibary EC.Microvascular basement membranes in diabetes mellitus[J].J Pathol,2003,200(4):537-546.

[6]Nielsen JS,Mcnagny KM.The role of podocalyxin in health and disease[J].J Am Soc Nephrol,2009,20(8):1669-1676.

[7]Hara M,Yamagata K,Tomino Y,et al.Urinary podocalyxin is an early marker for podocyte injury in patients with diabetes:establishment of a highly sensitive ELISA to detect urinary podocalyxin[J].Diabetologia,2012,55(11):2913-2919.

[8]Ye H,Bai X,Gao H,et al.Urinary podocalyxin positive-element occurs in the early stage of diabetic nephropathy and is correlated with a clinical diagnosis of diabetic nephropathy[J].J Diabetes Complications,2013,28(1):96-100.

[9]Hoshi S,Nomoto K,Kuromitsu J,et al.High glucose induced VEGF expression via PKC and ERK in glomerular podocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,290(1):177-184.

[10]Chen S,Kasama Y,Lee JS,et al.Podocyte-derived vascular endothelial growth factor mediates the stimulation of alpha3(IV) collagen production by transforming growth factor-beta1 in mouse podocytes[J].Diabetes,2004,53(11):2939-2949.

[11]Koshikawa M,Mukoyama M,Mori K,et al.Role of p38 mitogen-activated protein kinase activation in podocyte injury and proteinuria in experimental nephrotic syndrome[J].J Am Soc Nephrol,2005,16(9):2690-2701.

[12]Lin H,Ye S,Xu J,et al.The alpha-lipoic acid decreases urinary podocalyxin excretion in type 2 diabetics by inhibiting oxidative stress in vivo[J].J Diabetes Complications,2014,29(1):64-67.

[13]Susztak K,Raff AC,Schiffer M,et al.Glucose-induced reactive Oxygen species cause apoptosis of podocytes and podocyte depletion at the onset of diabetic nephropathy[J].Diabetes,2006,55(1):225-233.

[14]Lee JJ,Hsiao CC,Yang IH,et al.High-mobility group box 1 protein is implicated in advanced glycation end products-induced vascular endothelial growth factor A production in the rat retinal ganglion cell line RGC-5[J].Mol Vis,2012,18:838-850.

[15]Thallas-Bonke V,Jha JC,Gray SP,et al.Nox-4 deletion reduces oxidative stress and injury by PKC-α-associated mechanisms in diabetic nephropathy[J].Physiol Rep,2014,2(11):e12192.

[16]Brosius FC,Podocytes CR,Pathways S.And vascular factors in diabetic kidney disease[J].Adv Chronic Kidney Dis,2014,21(3):304-310.

Association of urinary podocalyxin and vascular endothelial growth factor levels with oxidative stress in patients with type 2 diabetes nephropathy*

DongShanshan1,ZhangJie1,LiuFan1,MiYujing2,LiXinpan1，ZhouHuimin1

(1.DepartmentofEndocrinology;2.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang,Hebei050031,China)

Objective To investigate the change of urinary podocalyxin(PCX) and vascular endothelial growth factor(VEGF) levels and its association with the oxidative stress in the patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM) complicating different degrees of diabetic nephropathy.Methods Totally 186 patients with T2DM were divided into the pure T2DM (SDM,62 cases),trace amount group(NA group,60 cases) and massive amount group(MA group,64 cases) according to the 24 h urinary albumin excretion rate(UAER).60 cases of normal 24 h UAER were taken as the control group(NC group).The levels of PCX,VEGF,superoxide dismutase (SOD),malondialdehyde(MDA) and glutathione peroxidase (GSH-px)were determined.Results Compared with other three groups，the level of VEGF,PCX and MDA in the MA group were highest(P<0.01),while the levels of SOD and GSH-px were lowest(P<0.01,P<0.05).VEGF,UAER,HbA1c were the independent risk factors for urinary PCX.Conclusion In patients with diabetic nephropathy，urinary PCX and VEGF are correlated with the oxidative stress,while the oxidative stress is closely correlated with glomerular podocyte injury.

diabetic nephropathy;podocytes;vascular endothelial growth factor；oxidative stress

河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃(20130260)。

董閃閃(1982-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事糖尿病及糖尿病并發(fā)癥研究。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.011

R587.1

A

1671-8348(2016)10-1334-03

2016-01-02

2016-01-21)