胡 越,劉 莉,熊威威,譚 毅,黃志華,李愛國,楊 華，蔣奕紅△

(1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生院,廣西桂林 541001；2.湖北省武漢市第三醫(yī)院麻醉科 430000; 3.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科,廣西桂林 541001;4.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，廣西桂林 541001)

電針復(fù)合七氟烷麻醉對(duì)斷尾大鼠急性應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控的影響*

胡 越1,劉 莉2,熊威威3,譚 毅3,黃志華3,李愛國3,楊 華4，蔣奕紅3△

(1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生院,廣西桂林 541001；2.湖北省武漢市第三醫(yī)院麻醉科 430000; 3.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科,廣西桂林 541001;4.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，廣西桂林 541001)

目的 探討不同穴位電針刺激復(fù)合七氟烷麻醉對(duì)斷尾大鼠急性應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控作用的影響。方法 健康成年雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量280～320 g，分為正常組(Ⅰ組)、模型組(Ⅱ組)、七氟烷吸入組(Ⅲ組)、七氟烷吸入加體針組(Ⅳ組)和七氟烷吸入加耳針組(Ⅴ組)，每組10只。Ⅰ組不作處理置于氧流量30%的混合氣體玻璃箱中(流量2 L/min)，Ⅱ組斷尾后置于氧流量30%的混合氣體玻璃箱中(流量2 L/min)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組斷尾后置于含體積分?jǐn)?shù)為2%的七氟烷麻醉箱中(流量2 L/min)，Ⅳ組持續(xù)刺激雙側(cè)“足三里”穴30 min (刺激參數(shù)3 V，3 Hz，2 ms)，共4次，每次間隔30 min，Ⅴ組刺激雙側(cè)“耳尖”穴，刺激參數(shù)及時(shí)間同Ⅳ組。各組治療方法結(jié)束后，處死各組大鼠，取斷頸血采用ELISA測(cè)促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和外周血皮質(zhì)酮(CORT)水平。采用Western blot法測(cè)定下丘腦組織c-fos蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 與Ⅰ組相比，Ⅱ組血清ACTH、CORT水平、下丘腦c-fos蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠外周血ACTH、CORT水平均有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ⅲ組與Ⅳ組的ACTH和CORT水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ⅴ組的ACTH水平與Ⅲ組相比明顯下降(P<0.05)，Ⅴ組CORT水平與Ⅳ組相比明顯下降(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組c-fos表達(dá)與Ⅱ組相比均降低(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組3組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 七氟烷吸入復(fù)合電刺激“耳尖”穴治療時(shí)，對(duì)應(yīng)激的作用優(yōu)于單純的七氟烷治療和七氟烷復(fù)合電刺激“足三里”穴。電針復(fù)合吸入全身麻醉對(duì)應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制可能與下丘腦調(diào)節(jié)室旁核c-fos蛋白分泌并影響下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸有關(guān)。

應(yīng)激；電針；原癌基因蛋白質(zhì)c-fos；七氟烷；耳針

應(yīng)激(stress) 是機(jī)體對(duì)各種刺激產(chǎn)生的一些非特異性反應(yīng)。機(jī)體主要是通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸分泌的應(yīng)激激素來調(diào)節(jié)并完成對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)。HPA多以外周血中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)酮(CORT)水平變化作為應(yīng)激調(diào)控的外周指標(biāo)[1]，以c-fos蛋白作為中樞調(diào)控應(yīng)激的敏感因子[2]。研究表明，電針復(fù)合全身麻醉可降低肺切除患者圍術(shù)期的應(yīng)激反應(yīng)[3]，電針復(fù)合頸叢阻滯也能顯著降低甲狀腺患者圍術(shù)期的應(yīng)激反應(yīng)[4]。臨床應(yīng)用多以體針復(fù)合麻醉，而實(shí)際操作中體針多受手術(shù)操作及體位的局限，而耳針不僅操作靈活且便于術(shù)中管理。但目前耳針復(fù)合麻醉對(duì)應(yīng)激的調(diào)控作用不明。本研究通過對(duì)外周血清ACTH、CORT水平和下丘腦c-fos蛋白表達(dá)的變化，探討電針體穴和耳穴復(fù)合全身麻醉對(duì)斷尾大鼠應(yīng)激反應(yīng)的影響，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取50只成年雄性SD大鼠(桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量280～320 g,按照晝夜節(jié)律性飼養(yǎng)，即在12 h光照和12 h黑暗的條件下喂養(yǎng),自由攝食和飲水。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1周后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑及儀器 大鼠ACTH、CORT ELISA試劑盒(華美Cusabio公司)，兔抗人多克隆c-fos抗體(1∶1 000，Santa Cruz公司)，山羊抗兔辣根標(biāo)記二抗 (1∶5 000)、山羊抗小鼠辣根標(biāo)記二抗(1∶5 000)、DAB(Sigma公司)，鼠抗β-actin(1∶1 000，中杉金橋公司)，SAB試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)公司)。儀器：華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn))，Bio-Rad蛋白電泳系統(tǒng)、Bio-Rad電轉(zhuǎn)膜儀、七氟烷揮發(fā)罐(Datex-Ohmeda公司)，ALC-V8動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾特生物科技有限公司)，麻醉氣體監(jiān)護(hù)儀(Datex-Ohmeda)，IPP6.0凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表達(dá)法分為5組,分別為正常組(Ⅰ組)、模型組(Ⅱ組)、七氟烷吸入組(Ⅲ組)、七氟烷吸入加體針組(Ⅳ組)和七氟烷吸入加耳針組(Ⅴ組)，每組10只。

1.3.2 急性應(yīng)激模型制備 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，除Ⅰ組外各組大鼠采用低位尾干切斷(ICTR)的方法模擬急性應(yīng)激，即用鼠籠固定大鼠后，在靠近尾端的尾干處(S3和S4脊髓神經(jīng)之間)橫切。

1.3.3 處理方法和取材 參照Lee等[5]的方法，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠均通入體積分?jǐn)?shù)2%的七氟烷氣體。將大鼠放入體積約為30 cm×20 cm×20 cm的玻璃麻醉箱中，箱底鋪滿石灰，用Ohmeda揮發(fā)罐給予七氟烷行麻醉誘導(dǎo)和維持，Datex麻醉氣體監(jiān)護(hù)儀與氣管導(dǎo)管連接，用于監(jiān)測(cè)呼氣末七氟烷水平，使箱內(nèi)七氟烷的水平維持在2%，再將大鼠置入玻璃箱。對(duì)Ⅳ組和Ⅴ組進(jìn)行電針刺激治療，在翻正反射消失后，將大鼠從七氟烷麻醉箱中迅速拿出，接上電針后立即放回麻醉箱中。按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]進(jìn)行取穴：Ⅳ組取“足三里”對(duì)應(yīng)大鼠的后三里位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)腓骨小頭下約5 mm處脛腓骨間，直刺7 mm，給予“疏密波”，參數(shù)設(shè)置為3 V，3 Hz，2 ms[7]。取穴完成后，迅速放回體積分?jǐn)?shù)維持在2%的七氟烷麻醉箱中，電針刺激30 min 1次，每2次間隔30 min，共4次電刺激治療。Ⅴ組在“耳尖”穴：位于耳尖后緣，針刺時(shí)沿耳廓橫刺2 mm，各項(xiàng)刺激參數(shù)、持續(xù)時(shí)間同Ⅳ組。處理結(jié)束時(shí)，各組大鼠斷頸取血5 mL，隨后取下丘腦組織置于液氮中，以備檢測(cè)以下指標(biāo)。

1.3.4 血清ACTH、CORT水平的檢測(cè) 血樣加入不凝管中，在常溫下靜置2 h后，4 ℃，3 500 r/min，離心15 min，取上清液-20 ℃保存，采用ELISA試劑盒檢測(cè)ACTH和CORT水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.3.5 下丘腦組織c-fos蛋白水平測(cè)定 待測(cè)時(shí)將組織從液氮中取出，用液氮研磨并裂解后，提取蛋白質(zhì),進(jìn)行蛋白定量,用Western blot法檢測(cè)下丘腦組織c-fos蛋白的變化。按5 μg/mL的比例將組織裂解液加入到下丘腦組織內(nèi),勻漿后,12 000 r/min離心吸取上清液測(cè)定總蛋白含量(BCA蛋白測(cè)定法)。取40 μg蛋白質(zhì),加熱變性后,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,用電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到聚二偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含10%脫脂奶粉和0.1% Tween-20的Tris緩沖液 (TBST) 常溫封閉60 min,然后進(jìn)行免疫雜交反應(yīng)。首先加入1∶1 000的兔來源的c-fos抗體(Santa Cruz公司),4 ℃孵育過夜。用新鮮配制的TBST洗滌后,加入山羊抗兔抗體二抗,抗體滴度為1∶5 000,室溫孵育78 min。用TBST洗滌后,在暗室內(nèi)加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑 (West Pico),壓X線片(柯達(dá))。同一Western雜交膜顯示c-fos條帶后,用TBST洗滌PVDF膜30 min,然后用同樣的方法顯示β-actin條帶,以此作為加樣的內(nèi)參照。X 線片上的條帶經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)讀其灰度值,并進(jìn)行定量。以c-fos條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來糾正上樣量的偏差。用灰度比值的高低表示c-fos蛋白水平的多少。

2 結(jié) 果

2.1 各組外周血血清ACTH、CORT水平比較 與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組血清ACTH、CORT水平明顯升高(P<0.01)。與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組ACTH、CORT水平均有不同程度下降(P<0.05)。Ⅲ組與Ⅳ組的ACTH和CORT水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而Ⅴ組的ACTH水平與Ⅲ組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ⅴ組的CORT水平與Ⅲ組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ⅳ組與Ⅴ組相比，兩組間ACTH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但CORT水平Ⅴ組較Ⅵ組低 (P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清ACTH、CORT水平比較(±s，n=10)

a：P<0.01，與Ⅰ組比較;b:P<0.05，與Ⅱ組比較；c:P<0.05,與Ⅲ組比較；d:P<0.05,與Ⅳ組比較。

2.2 各組下丘腦組織c-fos蛋白表達(dá)情況 Ⅰ組c-fos表達(dá)很少，斷尾應(yīng)激后，Ⅱ組c-fos表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組c-fos表達(dá)減少(P<0.01)；與Ⅲ組比較，Ⅳ、Ⅴ組的c-fos表達(dá)均下調(diào)(P<0.01)；Ⅳ、Ⅴ組間表達(dá)有差異，且Ⅴ組表達(dá)低于Ⅳ組(P<0.01)，見圖1、表2。

圖1 各組下丘腦c-fos蛋白Western印記X-線片顯影結(jié)果

組別nc?fos蛋白表達(dá)Ⅰ組100．16(0．15，0．18)Ⅱ組101．91(1．89，1．92)aⅢ組101．13(1．12，1．14)abⅣ組101．02(1．00，1．04)abcⅤ組100．66(0．60，0．73)bcd

a：P<0.01，與Ⅰ組比較；b：P<0.01，與Ⅱ組比較；c：P<0.01，與Ⅲ組比較；d：P<0.01，與Ⅳ組比較。

3 討 論

本研究參照Xu等[8]采取低位尾干切斷的方法制造急性創(chuàng)傷性應(yīng)激的模型，操作簡(jiǎn)便且模型效果顯著。有研究證實(shí)[9]，電針“足三里”可通過抑制下丘腦神經(jīng)元進(jìn)而調(diào)整HPA軸功能異常，以減輕急性創(chuàng)傷大鼠術(shù)后應(yīng)激。同時(shí)，電針大鼠“耳尖”穴對(duì)慢性應(yīng)激也有一定的調(diào)控作用[10]。固選取“足三里”和“耳尖”復(fù)合全身麻醉進(jìn)行效果對(duì)比。

c-fos蛋白的表達(dá)被廣泛認(rèn)為是神經(jīng)元興奮的標(biāo)志[11]。在非應(yīng)激的基礎(chǔ)狀態(tài),腦部c-fos表達(dá)水平很低；由張?jiān)茤|等[12]的研究結(jié)果可知，創(chuàng)傷后應(yīng)激早期下丘腦c-fos快速表達(dá)，但促腎上腺素釋放激素(CRH)的表達(dá)遲于c-fos的表達(dá)過程,說明創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)中下丘腦早期表達(dá)的c-fos可能起激活CRH基因表達(dá)的作用。并有研究表明[13]，急性疼痛應(yīng)激傳入后,激活下丘腦室旁核(PVN)c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄，表達(dá)c-fos蛋白，并作為第3信使與CRH mRNA位點(diǎn)結(jié)合激活CRH mRNA轉(zhuǎn)錄，使下丘腦釋放CRH至垂體并入血，從而啟動(dòng)HPA軸。本研究結(jié)果顯示，斷尾給予的急性刺激后，外周血中血清ACTH和CORT水平顯著升高，且下丘腦c-fos表達(dá)升高，即急性應(yīng)激模型制備成功，隨后在給予電針加七氟烷吸入后，c-fos表達(dá)降低，可能的機(jī)制為電針復(fù)合七氟烷作用后大鼠下丘腦激活的c-fos神經(jīng)元減少，則轉(zhuǎn)錄合成的CRH也隨之減少。因此，CRH激活HPA軸后釋放入血的ACTH水平也隨之降低，ACTH刺激腎上腺皮質(zhì)釋放的CORT也同時(shí)減少。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[14]，電針“百會(huì)”“神門”等穴可下調(diào)血清CORT和ACTH水平,作用機(jī)制可能與電針調(diào)節(jié)HPA軸的功能有關(guān)；臨床上將電針復(fù)合七氟烷麻醉用于神經(jīng)外科手術(shù)中，也驗(yàn)證了電針復(fù)合麻醉作用對(duì)術(shù)后早期鎮(zhèn)痛和恢復(fù)有良好的效果[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，電針復(fù)合七氟烷全身麻醉作用后，升高的外周血清ACTH和CORT水平均有不同程度的回落，即證實(shí)了電針聯(lián)合七氟烷吸入全身麻醉對(duì)應(yīng)激的調(diào)控作用是有效的，而各治療組大鼠的下丘腦c-fos蛋白表達(dá)降低證實(shí)下丘腦調(diào)控HPA軸跟通過減少c-fos蛋白表達(dá)有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Ⅳ與Ⅴ組作用效果比較時(shí)，Ⅴ組對(duì)應(yīng)激下調(diào)的作用強(qiáng)于Ⅳ組，即電刺激“耳尖”穴復(fù)合七氟烷麻醉對(duì)斷尾應(yīng)激的調(diào)控優(yōu)于電刺激體穴“足三里”復(fù)合七氟烷全身麻醉。相比于體穴，耳部有豐富的迷走神經(jīng)分布。應(yīng)激傳入興奮交感神經(jīng)啟動(dòng)HPA軸，電針刺激耳穴時(shí)，一方面可以通過下丘腦系統(tǒng)調(diào)節(jié)交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的平衡，興奮迷走膽堿能神經(jīng)纖維抑制交感腎上腺素能作用，調(diào)節(jié)激素水平變化[16]；另一方面能通過激活鎮(zhèn)痛機(jī)制，抑制痛覺信號(hào)傳遞，達(dá)到鎮(zhèn)痛作用從而降低疼痛誘發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)[17]。多途徑多系統(tǒng)的參與可能是耳穴復(fù)合七氟烷全身麻醉作用優(yōu)于體穴的原因。

總之，電針復(fù)合七氟烷麻醉法對(duì)急性應(yīng)激的調(diào)控有明確效果，其機(jī)制與PVN分泌c-fos蛋白有關(guān)，耳針復(fù)合七氟烷比體針復(fù)合七氟烷的調(diào)控作用效果好。電針復(fù)合藥物麻醉應(yīng)用于臨床時(shí)，不僅可以有效減輕圍麻醉期應(yīng)激反應(yīng)的作用，還對(duì)預(yù)防術(shù)后疼痛及術(shù)后惡心嘔吐等術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生有顯著作用[18]，值得臨床大力推廣。

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Effect of electro-acupuncture combined with sevoflurane anesthesia on regulation of acute stress response in docked tails rats*

HuYue1，LiuLi2，XiongWeiwei3，TanYi3，HuangZhihua3，LiAiguo3，YangHua4,JiangYihong3△

(1.GraduateSchool，GuilinMedicalCollege,Guilin,Guangxi541001,China;2.DepartmentofAnesthesiology,ThirdHospitalofWuhanCity,Wuhan,Hubei430000,China;3.DepartmentofAnesthesiology，AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege，Guilin，Guangxi541001,China;4DepartmentofTraditionalChineseMedicine，AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege，Guilin,Guangxi541001，China)

Objective To investigate the effect of electro-acupuncture combined with sevoflurane anesthesia on the regulation of acute stress response in docked tails rats．Methods Fifty male SD rats weighing 280-320 g were randomlsy divided into 5 groups(n=10 each)：normal group (group Ⅰ),model group (group Ⅱ),sevoflurane group (group Ⅲ),sevoflurane inhalation combined with body acupuncture group (group Ⅳ) and sevoflurane combined with auricular acupuncture group (group Ⅴ).The group Ⅰwas placed in a glass box containing mixture gas with oxygenflow of 30% (flow 2 L/min) without treatment,the group Ⅱafter docking tail was placed in a glass box containing mixture gas with oxygenflow of 30% (flow 2 L/min),the group Ⅲ,Ⅳ and Ⅴ were placed in the 2% sevoflurane anesthesia box (flow 2 L/min),the group Ⅳ was given continuous stimulation at Zusanli (stimulation parameters:3 V，3 Hz，2 ms) for 30 min per time,4 times at intervals of 30 min,the groupⅤ was given the stimulation at Erjian with the same stimulation parameters as the groupⅣ.Rats in each group were killed after treatment and the blood at broken neck was collected for measuring serum corticosterone (CORT) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) levels by ELISA.The c-fos protein expression level in hypothalamic tissue was detected by Western blot.Results Compared with the group Ⅰ,serum ACTH,CORT levels,hypothalamic expression of c-fos protein in the group Ⅱwere significantly increased (P<0.01),compared with the group Ⅱ,the peripheral blood ACTH,CORT levels were decreased with statistical difference (P<0.05);the ACTH,CORT levels had no statistical difference between the group Ⅲ and Ⅳ(P>0.05);the ACTH level in the groupⅤ was significantly decreased compared with the groupⅢ(P<0.05) and the CORT level in the group Ⅴ was also decreased when compared with the group Ⅳ(P<0.05).The c-fos expression in the groupⅢ,Ⅳ and Ⅴwere decreased compared with the groupⅡ(P<0.05),there were significant difference among the group Ⅲ,ⅣandⅤ(P<0.05).Conclusion In the treatment of sevoflurane inhalation anesthesia combined with compound electrostimulation at Erjian,its effect on stress response is superior to simple sevoflurane treatment and sevoflurane combined with compound electrostimulation at Zusanli.The regulation mechanism of electro-acupuncture combined with inhalation general anesthesia on stress may be related with hypothalamus regulating paraventricular nucleus c-fos protein secretion and affecting the HPA axis.

stress;electroacupuncture;proto-oncogene proteins c-fos;sevoflurane;auricular acupuncture

2013年廣西中醫(yī)藥民族醫(yī)藥繼承創(chuàng)新工程(GZZC13-20)。

胡越(1989-)，在讀碩士，主要從事圍術(shù)期的應(yīng)激調(diào)控及術(shù)后并發(fā)癥的防治研究。
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，E-mail:jiangyihong@163.com。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.003

R245.97;R614

A

1671-8348(2016)10-1306-03

2015-11-18

2015-12-28)